全 文 ：! ! "#$% 木糖异构酶基因的克隆及表达条件的优化
许 伟!，"，严 明!，李永健!，李 艳!，许 琳!
!
（! # 南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 "!$$$%；" # 盐城工学院 化学生物工程学院，盐城 ""&$$’）
摘 要：采用 ()*技术以大肠杆菌 +,!$% 基因组 -./ 为模板扩增得到木糖异构酶基因 012/，连接到载体 3456""7
（ 8），得到重组质粒 3456""7（ 8）6012/。将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株 9:"!（-4’）中，重组菌株经 ;(5< 诱导
后，通过半胱氨酸6咔唑法测得木糖异构酶活力。每 =:发酵液中重组菌株显示出酶活力约为 $ #>& ?。@-@6(/<4电
泳结果显示出明显的 A B !$&（相对分子质量）特异性蛋白质条带。
关键词：! # "#$% 012/基因；木糖异构酶；克隆；表达
中图分类号：CD>E 文献标识码：/ 文章编号：!ED" F ’ED>（"$$A）$& F $$&A F $&
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9*4 :$-).：! # "#$% 012/ MILI；012NXI JXN=IVPXI；S2NLI；I03VIXXJNL
随着能源危机的日益严重，利用木质纤维素中
的木糖发酵生产乙醇成为研究热点之一。木糖异构
酶（012NXI JXN=IVPXI，G;）（4) A #’ #! #A），又称葡萄糖异
构酶，是一种具有重要应用价值的工业用酶。其在
细胞体内可将木糖异构化为木酮糖，在利用木质纤
维素微生物发酵生产乙醇的过程中起着关键作用；
在体外可转化葡萄糖形成果糖，并已经用于高果糖
浆的工业生产［!］。木糖异构酶作为微生物利用木糖
的关键酶一直受到国内外科研工作者的关注，早期
)UPL 4VV )UILM［"］等 将 ! # "#$% 012/ 基 因 引 入
&"’%(#)*""’*+#,-".) /#,0. 中，测得乙醇的最终浓度可
达到 ’ #D_，并提出乙醇产生的限速步骤是木糖到
木酮糖的转化。 ‘UPLM 等［’］将 ! # "#$% 中的 012/，
0129，Y^Y/，YP29四个基因克隆到 1-,#,#2*) ,#0%$%) 中
并表达，重组细菌可以发酵木糖并生产乙醇。由于
该酶具有重要的工业应用价值以及其在高效发酵
-6木糖生产酒精方面的研究意义，近年来在酶学性
质研究、基因工程和蛋白质工程等方面取得了很大
的进展［&］。本文设计对 ! # "#$% 012/ 基因进行克隆
并高效表达活性，为研究酶学性质与酶的结构之间
! 收稿日期："$$A6$>6!A
基金项目：国家“%D’”项目（编号为 "$$’)9D!E$$$）
作者简介：许 伟（!%DE6），女，讲师，博士研究生，研究方向：酶工程。
联系人：许 琳，女，教授，研究方向：基因工程，5I2：$"A6>’A>DE%&
第 ’ 卷第 & 期
"$$A 年 !! 月
生 物 加 工 过 程
)UJLIXI +NZVLP2 NR 9JN3VNSIXX 4LMJLIIVJLM
.NW Q "$$A
·&A·
万方数据
关系，以及酶的改良奠定基础。
! 材料与方法
! "! 质粒与菌株
质粒 #$%&’’(（ ) ）购自美国 *+,-./0 公司，%&
,/12+3 购自美国 43+5/.- 公司，菌株 67’!（8$9）、
:;!<=、8>?!为实验室保藏。
! "’ 酶与试剂
限制性内切酶购自英国纽英伦公司（*$6）、%@
8*A连接酶及低熔点琼脂糖购自美国 43+5/.- 公
司；4BC反应试剂、%-D 8*A聚合酶及 8*A ;-3E/3均
购自大连宝生生物公司；氨苄青霉素，F4%G 购自北
京博大泰克公司，酵母提取物，胰蛋白胨为 HIHF8
公司产品，木酮糖为 JK.5- 公司产品。其余为国产
分析纯。
! "9 培养基
大肠杆菌完全培养基为 76（蛋白胨 !< . L 7；酵
母提取物 ? . L 7；氯化钠 !< . L 7，#> M N "<）。
质粒转化所用培养基为 JHB（蛋白胨 ’< . L 7，酵
母抽提物 ? . L 7，!< 55+O L 7 *-BO，’ "? 55+O L 7 PBO，!<
55+O L 7 ;.BO’，!< 55+O L 7 ;.JH@，’< 55+O L 7葡萄糖）。
!"@ 分子克隆技术
8*A 酶切、连接、转化和细菌感受态制备等基本
基因操作技术参照文献［?］及有关公司提供的操作手
册进行。基因组 8*A提取采用上海华舜生物工程有
限公司的试剂盒，经琼脂糖凝胶电泳分离的 8*A 片
段回收采用德国宝灵曼公司的 8*A 回收试剂盒回收
纯化。4BC反应采用 6K+5/23-公司 4BC仪。
! "? 木糖异构酶的诱导表达及表达产物分析
将经鉴定后的 #$%&’’(&QROA重组质粒转化到表
达宿主大肠杆菌 67’!（8$9）菌株，同时以空白质粒
转入相同宿主作为对照，挑取单菌落到含 !<<". L 57
A5#的 76培养液，9N S振荡培养过夜，然后按 !T
接种到新鲜培养液中，9N S培养至 !"U<<约为 < "U
时［U］，加入 F4%G 至终浓度 < "V 55+O L 7，诱导表达
U W，取一定体积菌液 V <<< 3 L 5K0，@ S离心 !< 5K0，
沉淀用生理盐水洗涤两次，重悬于 46J（#> N "’）缓
冲液后于冰浴中超声破碎。用 J8J 聚丙烯酰胺凝
胶电泳考察蛋白的表达情况。
! "U 木糖异构酶的活性检测
! "U "! 粗酶液制备
取 @57诱导后培养液 V <<< 3 L 5K0 离心 ? 5K0收
集菌体，用灭菌水洗涤两次后，菌体重悬于 ! 57 46J
（#> N "’）缓冲液于冰浴中超声破碎细胞，离心取上
清即为粗酶液。
! "U "’ 酶活力测定
酶活力测定采用半胱氨酸&咔唑法［N］< "! 5+O 8&
木糖 ?<"7，粗酶液 ?<"7，!< 55+O L 7 ;0BO’ ?<"7，缓
冲液（46J #> N "’）?<"7，?< S，反应 ! W，沸水浴终
止反应；取 ?<"7立即加入 !9 5+O L 7 的 >’JH@ U 57，
! "?T的半胱氨酸盐酸盐 < "’ 57，< "!’T的咔唑酒精
溶液 < "’ 57，混匀，’? S反应 9< 5K0 于 ?@< 05处测
定光吸收，据木酮糖标准曲线求得木酮糖量。
在标准反应混合物中，酶活力单位（X）定义为
每 5K0 催化产生 !"5+7木酮糖所需的酶量。
! "N IROA基因的克隆
参照由 G/0/(-0E 数据库中查到的 # " $%&’ QROA
基因序列，设计如下 4BC引物：正向引物 ?Y&GBA%G&
BAAGBB%A%%%%GABB&9Y 反 向 引 物Y&B%AABB%&
%A%%%G%BGAABAG&9Y由上海博亚公司合成。采用
上海华舜生物工程有限公司的试剂盒，提取 :;!<=
基因组。以 :;!<= 总 8*A为模板，4BC 扩增木糖异
构酶基因 QROA。 4BC 循环参数为：=@ S，! 5K0；
?? S，?< Z；UV S，! "? 5K0，共进行 9? 个循环。
" 结果与讨论
’ "! QROA基因扩增结果鉴定
4BC产物在 < "VT琼脂糖凝胶上电泳检测扩增
片断，结果见图 !。结果显示扩增片段大小约为
7-0/ !&’：4BC #3+[\12；7-0/ ;-3E/3：8*A ;-3E/3 87’<<<
图 ! 木糖异构酶基因（QROA）4BC扩增产物
]K. "! 4BC #3+[\12 +^ QROA ./0/
! "9 E(，与预期一致。用宝灵曼的琼脂糖 8*A 回收
试剂盒回收纯化。回收 4BC 产物与 43+5/.- 的
%&,/12+3连接并转化 8>?!菌株，对重组质粒利用 %N
引物做 4BC 进行鉴定。确认的阳性克隆经测序分
·@U· 生物加工过程 第 9 卷第 @ 期
万方数据
析，与所报道的序列一致。
! "! 表达重组子的构建、筛选与鉴定
对阳性克隆（#$%&’()*$+,-.）和 /0#$!!1（ 2 ）分别
用 3’)4和 56’4 限制性内切酶双酶切，结果如图 ! 所
示，其中 768& 9 中约 9 ": ;1的条带为目的基因。然
后将切下的目的基因及同样处理过的 /0#$!!1（ 2 ）
载体进行连接，连接后转化到大肠杆菌 <=>!感受
态细胞。提取质粒经 56-4 酶切、电泳结果见图 ?。
结果表明外源片段已经连接到表达质粒上。
768& 9：#$%&’()*$+,-. @ 3’)4 2 56’4；768& !：/0#$!!1（ 2 ）@ 3’)4 2
56’4；768& A：<3. A6*B&* <7!CCC
图 ! 阳性克隆（#$%&’()*$+,-.）和 /0#$!!1（ 2）双酶切
DEF "! 3’)4 68G 56’4 GEF&H( )I J)HE(E%& #$%&’()* 68G /0#$!!1（ 2）
768& 9$?：/0#$!!1（ 2）$+,-. @ 56-4；768& A：<3. A6*B&* <7!CCC
图 ? 表达重组子 /0#$!!1（ 2）$+,-.的酶切鉴定
DEF "? 56-4 GEF&H( )I *&’)K1E868( /-6HKEG /0#$!!1（ 2）$+,-.
! "? 外源基因（+,-.）表达产物的分析
取诱导 > L 后的菌液离心，收集菌体进行 5<5$
J.M0电泳。与未插入基因的空载体 /0#$!!1（ 2 ）
相比，在 :> B<上方有明显的诱导蛋白带，与基因序
列推测所得的理论相对分子质量一致。表达重组质
粒见图 :，表达产物的 5<5$J.M0见图 >。
! ": 表达条件的初步优化
! ": "9 诱导剂 4J#M量的优化
在诱导培养温度为 ?C N，诱导时间为 O L 的情
况下，考察不同 4J#M终浓度对重组菌诱导表达的影
响。结果显示，诱导剂 4J#M 终浓度在 C "P KK)- @ 7
时重组菌发酵液酶活力最高为 C "Q:9 R @ K7，而
C "S KK)- @ 7的情况下最低，为 C ":>S R @ K7。
图 : 表达重组质粒构建图
DEF ": JL,HE’6- K6/ )I *&’)K1E868( /-6HKEG /0#$!!1（ 2）$+,-.
768& 9，?$>：*&’)K1E868( H(*6E8 )I ! " "#$% T7!9（<0?）@ /0#$!!1
（ 2）$+,-.；768& !：*&’)K1E868( H(*6E8 )I ! " "#$% T7!9（<0?）@ /0#$
!!1（ 2）；768& A：J*)(&E8 A6*B&*
图 > 表达产物的 5<5$J.M0分析
DEF "> 5<5$J.M0 686-,HEH )I (L& &+/*&HHE)8 /*)GU’(H
图 S 4J#M终浓度对重组菌酶活力的影响
DEF "S 48I-U&8’& )I 4J#M IE86- ’)8’&8(*6(E)8
! ": "! 诱导时间的优化
在诱导培养温度为 ?C N，4J#M 终浓度为 C "P
!CC> 年 99 月 许 伟等：! " "#$% 木糖异构酶基因的克隆及表达条件的优化 ·:O·
万方数据
!!"# $ %的条件下，对重组菌分别诱导表达 &、’、(、)、
* +，结果如图 ) 所示。由图 ) 可以看出，随着诱导
时间的延长，重组菌株发酵液的酶活力呈缓慢升高
的趋 势，在 诱 导 ) + 后 酶 活 力 达 到 最 高 为
, -*&. / $ !%。
图 ) 诱导时间对重组菌酶活力的影响
012 -) 345#67487 "5 14968:1"4 :1!7
! 结论与展望
实验克隆了 ! - "#$% ;<#= 基因并利用表达载体
>?@A..B（ C）在大肠杆菌 D%.E 中进行了高效表达，
实验表明，在 3F@G 终浓度为 , -H !!"# $ %，诱导 ) +
后，每 !%发酵液酶活力最高为 , -*&. /，略高于同
类文献报道［*］。目前本实验室在进行酶学性质研究
以及该酶的同源建模和生物信息学分析，对木糖异
构酶的活性及稳定性进行改造，为该酶进一步工业
应用奠定基础。
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