全 文 ：第 １２卷第 ２期
２０１４年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０２􀆰 ００６
收稿日期：２０１２－１０－３０
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１１ＣＢ７０７４０５）
作者简介：张恒丽（１９８５—），女，河北邢台人，硕士研究生，研究方向：微生物学，基因工程；蔡 　 恒 （联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｃｈｅｎｇ＠
ｎｊｔｅｃｈ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
代谢木糖重组谷氨酸棒杆菌的构建
张恒丽，蔡　 恒， 汪　 晨，张　 凯，周志惠
（南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 ２１１８００）
摘　 要：为了使谷氨酸棒杆菌较好地利用木糖生产有机酸，将来自 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ １２的木糖异构酶基因 ｘｙｌＡ构
建到表达载体 ｐＸＭＪ１９中，导入 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２ Δｌｄｈ中，成功表达了该酶基因。 结果表明：
重组菌株在以木糖为唯一 Ｃ源进行发酵时，木糖的消耗速率为 ０􀆰 ５４ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），木糖异构酶比酶活约为 ０􀆰 ５４ Ｕ ／ ｍＬ；
在以木糖和葡萄糖的混合糖为 Ｃ源进行发酵时，菌株优先利用葡萄糖，在葡萄糖完全消耗后，菌株开始有效利用木
糖；以木糖为唯一 Ｃ源进行两阶段发酵时，琥珀酸的收率可达（０􀆰 ６２±０􀆰 ００３）ｇ ／ ｇ。
关键词：谷氨酸棒杆菌；琥珀酸；木糖异构酶基因；木糖
中图分类号：Ｑ７８６　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０２－００２８－０５
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌｏｓｅ⁃ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｓｔｒａｉｎ
ＺＨＡＮＧ Ｈｅｎｇｌｉ，ＣＡＩ Ｈｅｎｇ，ＷＡＮＧ Ｃｈｅｎ，ＺＨＡＮＧ Ｋａｉ，ＺＨＯＵ Ｚｈｉｈｕｉ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｘｙｌｏｓｅ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ
ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄｓ，ｔｈｅ ｘｙｌＡ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ⁃１２，ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｘｙｌｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ｗａｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｐＸＭＪ１９􀆰 Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２
Δｌｄｈ ｓｔｒａｉｎ􀆰 Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｏｎ ｘｙｌｏｓｅ ａｓ ａ ｓｏｌｅ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ，ｔｈｅ ｘｙｌｏｓｅ
ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ０􀆰 ５４ ｇ ／ （ Ｌ·ｈ） 􀆰 Ｔｈｅ ｘｙｌｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅａｃｈｅｄ ０􀆰 ５４ Ｕ ／ ｍＬ􀆰 Ｉｎ ｍｅｄｉｕｍ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｘｙｌｏｓｅ， ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｃｏｎｓｕｍｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｆｉｒｓｔ， ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｗａｓ
ｃｏｎｓｕｍｐｅｄ ｅｎｔｉｒｅｌｙ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌｏｓｅ ｗａｓ ｓｔａｒｔｅｄ􀆰 Ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｗａｓ （０􀆰 ６２ ±
０􀆰 ００３） ｇ ／ ｇ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｔｗｏ⁃ｓｔａｇｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｎ ｘｙｌｏｓｅ ａｓ ａ ｓｏｌｅ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ；ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ；ｘｙｌＡ；ｘｙｌｏｓｅ
　 　 随着全球经济的高速发展，以石油为主体的化
石能源危机正日益严峻，可持续替代资源的开发和
利用已成为当务之急。 木质纤维素是地球上最丰
富的可再生资源之一，广泛存在于工农业废弃物
中，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，利用酸
解或酶解的方法可将其转化为还原性糖，产生大量
的五碳糖（Ｄ 木糖和 Ｌ 阿拉伯糖）和六碳糖（葡萄
糖、半乳糖和甘露糖），其中六碳糖约占 ２ ／ ３，五碳糖
约占１ ／ ３。 在半纤维素的水解产物中，Ｄ 木糖约
占 ９０％［１－３］。
谷氨酸棒杆菌广泛分布在自然界中，是工业生
产的优良菌株，对木质纤维素中的抑制物，如 ４ 羟
基苯甲酸、香草醛、丁香醛等具有较好的耐受性，在
利用木质纤维素降解成分方面具有极大的优
势［４－５］。 谷氨酸棒杆菌在进行工业生产时通常以葡
萄糖、蔗糖等作为底物，由于缺乏转化木糖的酶系
而不能有效地利用木糖，但能发酵其异构体木酮
糖［６］，而木糖的利用是微生物利用木质纤维素类降
解组分生物转化为乙醇、琥珀酸等大宗化学品的一
个关键环节，因此构建可以利用木糖的谷氨酸棒杆
菌重组菌株极为重要。 当前，日本的 ＲＩＴＥ 研究所
对 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ木糖的利用进行了
研究，实验发现，将大肠杆菌的木糖异构酶和木酮
糖激酶基因整合至 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ 基因组上，可以
实现其代谢木糖的能力，在以 ４０ ｇ ／ Ｌ 葡萄糖、２０
ｇ ／ Ｌ Ｄ 木糖和 １０ ｇ ／ Ｌ Ｄ 纤维二糖作为 Ｃ 源时，重
组菌株在 １２ ｈ可以将其完全消耗，且无碳代谢阻遏
效应的存在［７］。
笔者以 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２ Δｌｄｈ 为出发
菌株，通过克隆 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ １２木糖异构酶基因 ｘｙｌＡ，
将其连接于诱导型表达载体 ｐＸＭＪ１９ 上，电转化
Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２ Δｌｄｈ，实现木糖的利用，
以期为后续的谷氨酸棒杆菌的进一步构建和改良
奠定基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株与质粒
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２ Δｌｄｈ、
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ 均为笔者所在实验室保藏，质粒
ｐＸＭＪ１９由德国科隆大学 Ａ Ｂｕｒｋｏｖｓｋｉ教授惠赠。
１􀆰 ２　 酶与试剂
限制性内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶、ＰＣＲ 反应试
剂、Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ＤＮＡ聚合酶及 ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，均购自
大连 Ｔａｋａｒａ 公司；氯霉素，购自南京生兴生物技术
有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨，Ｏｘｏｉｄ 公司产品；
其余为国产分析纯；引物合成与测序由南京金斯瑞
生物科技有限公司完成。
１􀆰 ３　 培养基与培养条件
１􀆰 ３􀆰 １　 培养基
培养菌体培养基为 ＬＢ（ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０、酵母提
取物 ５、ＮａＣｌ １０、ｐＨ ７􀆰 ０，固体培养基再加琼脂 ２０。
电转化所用 ＳＯＣ 培养基（ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 ２０，酵
母提取物 ５，ＮａＣｌ ０􀆰 ５，ＫＣｌ ０􀆰 １９，ＭｇＣｌ２·６Ｈ２Ｏ ０􀆰 ２，
葡萄糖 ３􀆰 ６。
发酵用 ＢＴ 培养基 （ ｇ ／ Ｌ ）： （ ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４ ７，
ＫＨ２ＰＯ４ ０􀆰 ５，Ｋ２ＨＰＯ４０􀆰 ５，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ５，ＦｅＳＯ４·
７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ００６，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０􀆰 ００４，生物素 ０􀆰 ０００ ２，维
生素 Ｂ１０􀆰 ０００ ２。
发酵用 Ａ培养基（ｇ ／ Ｌ）：尿素 ２，酵母粉 ２，酪蛋
白氨基酸 ７，（ＮＨ４） ２ＳＯ４７，ＫＨ２ＰＯ４０􀆰 ５，Ｋ２ＨＰＯ４０􀆰 ５，
ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ５，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ００６，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ
０􀆰 ００４，生物素 ０􀆰 ０００ ２，维生素 Ｂ１０􀆰 ０００ ２。
大肠杆菌培养用抗生素质量浓度为 ５０ μｇ ／ ｍＬ，
谷氨酸棒杆菌培养用抗生素质量浓度为 １０ μｇ ／ ｍＬ 。
１􀆰 ３􀆰 ２　 培养条件
１）种子培养条件 　 在平板中将一环菌接入至
装有 ５０ ｍＬ培养基的 ２５０ ｍＬ 锥形瓶中，３０ ℃、２００
ｒ ／ ｍｉｎ培养 １２ ｈ。
２）有氧培养条件　 将种子液按 ５％的比例接种
到装有 １００ ｍＬ培养基的 ５００ ｍＬ 锥形瓶中，３０ ℃、
２００ ｒ ／ ｍｉｎ培养。
３）厌氧培养条件 　 将有氧培养后的菌液室温
８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ，弃上清，用无菌水洗涤 ２次
后用少量厌氧培养基重悬菌泥，并接入装有 ５０ ｍＬ培
养基的血清瓶中，通入 ＣＯ２气体 １ ｍｉｎ，确保血清瓶中
为厌氧环境，３０ ℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ条件下厌氧发酵 １８ ｈ。
１􀆰 ４　 目的基因的克隆
ＤＮＡ酶切、连接、转化和大肠杆菌感受态制备
等基本基因操作技术参照文献［８］及有关公司提供
的操作手册进行，电转化感受态细胞制备参照文献
［９］。 基因组 ＤＮＡ 提取采用天根生化科技有限公
司的试剂盒，ＰＣＲ 反应采用 Ｂｉｏｍｅｔｒａ 公司 ＰＣＲ 仪，
电转化采用 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ公司高压脉冲电击转化仪。
１􀆰 ５　 目的基因 ｘｙｌＡ的克隆
参照 ＮＣＢＩ 数据库中已公布的 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ １２
ｘｙｌＡ基因序列，分别设计含有 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ和 Ｘｂａ Ｉ酶切
位点 及 其 保 护 碱 基 的 上 下 游 引 物。 Ｆ： ５′⁃
ＧＡＴＡＡＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＴＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＡＡＴ⁃３′， 下 划
线部 分 为 引 入 的 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 酶 切 位 点； Ｒ： ５′⁃
ＧＡＴＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＣＧＡＴＣＧＴＴＣＣＴＴＡＡＡ⁃３′， 下 划
线部分为引入的 Ｘｂａ Ｉ酶切位点。
以 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ １２ 基因组 ＤＮＡ 为模板，采用
Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ＤＮＡ 聚合酶进行 ＰＣＲ 扩增，５０ μＬ 体
积反应体系为：上下游引物（１００ ｐｍｏｌ ／ μＬ）各 ２ μＬ；
模板 ＤＮＡ ０􀆰 ５ μＬ；５ ×Ｐｒｉｍｅ ｂｕｆｆｅｒ １０ μＬ；ｄＮＴＰ ４
μＬ；Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ０􀆰 ５ μＬ；双蒸水 ３３ μＬ。
ＰＣＲ循环参数为：预变性 ９５ ℃，５ ｍｉｎ；（９５ ℃，１
ｍｉｎ，５６ ℃，１５ ｓ，７２ ℃，２ ｍｉｎ），３０个循环；７２ ℃，１０ ｍｉｎ。
９２　 第 ２期 张恒丽等：代谢木糖重组谷氨酸棒杆菌的构建
１􀆰 ６　 谷氨酸棒杆菌中木糖代谢途径的构建
将纯化的 ＰＣＲ 产物和 ｐＸＭＪ１９ 质粒分别使用
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ和 Ｘｂａ Ｉ双酶切后进行连接、转化，通过酶切鉴
定阳性克隆子，命名为 ｐＸＭＪ１９ ｘｙｌＡ。 将 ｐＸＭＪ１９
ｘｙｌＡ电转化到 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２ Δｌｄｈ中，经氯
霉素抗性平板筛选后，提取质粒进行 ＰＣＲ和酶切鉴定
阳性重组子，命名为 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＣ ２。
１􀆰 ７　 木糖异构酶的活性检测
１􀆰 ７􀆰 １　 粗酶液的制备
取 ５ ｍＬ 菌液于 ４ ℃、５ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ
收集菌体，用无菌水洗涤 ２ 次后，菌体重悬于 １ ｍＬ
ＰＢＳ（ｐＨ ７􀆰 ２）缓冲液，于冰浴中超声破碎细胞，离心
取上清液即为粗酶液。
１􀆰 ７􀆰 ２　 酶活力的测定
酶活力测定采用半胱氨酸 咔唑法［１０］。 ＰＢＳ 缓
冲液（ｐＨ ７􀆰 ２） ５０ μＬ ，０􀆰 １ ｍｏｌ Ｄ 木糖 ５０ μＬ，１０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＭｎＣｌ２５０ μＬ于 ５０ ℃反应 １ ｈ 后，沸水浴终
止反应；取 ５０ μＬ立即加入 １􀆰 ５％的半胱氨酸盐酸盐
０􀆰 ２ ｍＬ，１３ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 Ｈ２ ＳＯ４ ６ ｍＬ，混匀，２５ ℃反应
３０ ｍｉｎ后于 ５４０ ｎｍ处测定光吸收，根据木酮糖标准
曲线求得木酮糖含量。
在标准反应混合物中，酶活力单位（Ｕ）定义为
每分钟催化产生 １ μｍｏｌ 木酮糖所需的酶量。
１􀆰 ８　 分析方法
１􀆰 ８􀆰 １　 菌体密度的测定
采用 ＵＶ ３０００ 扫描型紫外可见分光光度计
（上海美谱达仪器有限公司 ）于 ６００ ｎｍ 处测定吸光
值 ＯＤ６００。
１􀆰 ８􀆰 ２　 糖浓度的测定
葡萄糖浓度采用 ＳＢＡ ２４０Ｃ 型生物传感分析仪
（山东省科学院生物研究所）测定，木糖浓度测定采
用 ３，５ 二硝基水杨酸（ＤＮＳ）比色法［１１］。
１􀆰 ８􀆰 ３　 发酵产物的测定
采用 ＨＰＬＣ 测定发酵产物，色谱条件：美国
Ａｌｌｔｅｃｈ 公司 Ｐｒｅｖａｉｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｃｉｄ 色谱柱（２５０ ｎｍ×
４􀆰 ６ ｍｍ， ５ μｍ），柱温 室温，流动相 ２５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ ２􀆰 ５，流速 １ ｍＬ ／ ｍｉｎ，进样量 ２５ μＬ；检
测器为紫外，检测波长 ２１５ ｎｍ ［１２］。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 目的基因 ｘｙｌＡ的克隆
以 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ １２基因组为模板，ＰＣＲ 扩增的产
物通过琼脂糖凝胶电泳分析显示，所克隆片段大小
约为 １􀆰 ４ ｋｂ（图 １），与预期片段大小一致，经过测序
分析，与 Ｇｅｎｅｂａｎｋ中已知基因序列一致。
Ｍ—λ ＥｃｏＴ１４ Ｉ ｄｉｇｅｓｔ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ； １—ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ
图 １　 木糖异构酶基因（ｘｙｌＡ）ＰＣＲ扩增产物
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｘｙｌＡ ｇｅｎｅ
２􀆰 ２　 重组菌株 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＣ ２的构建
将酶切后的 ｘｙｌＡ 片段和载体 ｐＸＭＪ１９ 进行连
接，转化感受态 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＪＭ１０９，经氯霉素抗性平板筛
选，提取质粒通过 ＥｃｏＲＩ单酶切验证，通过琼脂糖凝
胶电泳分析显示，酶切后的片段大小约为 ８ ｋｂ，与预
期结果一致，结果见图 ２。 将该重组质粒电转化到
Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２ Δｌｄｈ中，经氯霉素抗性筛
选，提取质粒进行 ＥｃｏＲ Ｉ 单酶切鉴定，获得重组菌
株 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＣ ２。
２􀆰 ３　 重组菌株 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＣ ２对木糖的利用
在添加 ２０ ｇ ／ Ｌ木糖或者葡萄糖的 ＢＴ发酵培养
基中，３０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 有氧培养 ２４ ｈ，考察重组菌
株 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＣ ２对木糖的利用情况，并与利
用葡萄糖的情况进行比较，结果见图 ３。
由图 ３ 可 知： 在 好 氧 条 件 下， 重 组 菌 株
Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＣ ２ 与对照菌株 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
ＡＴＣＣ１３０３２ Δｌｄｈ利用葡萄糖的生长情况大致相同，
但是在以木糖为唯一 Ｃ 源的培养基中生长时，对照
菌株 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２ Δｌｄｈ 不能有效地利
用木糖生长，而重组菌株 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＣ ２ 经过
２４ ｈ的培养后其菌体生长量超过其利用葡萄糖的
菌体水平，木糖的消耗速率达到 ０􀆰 ５４ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），略
低于葡萄糖（０􀆰 ６２ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）），经检测重组菌木糖异
构酶比酶活约为 ０􀆰 ５４ Ｕ ／ ｍＬ。 表明 ｘｙｌＡ 的基因表
０３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
Ｍ—λ ＥｃｏＴ１４ Ｉ ｄｉｇｅｓｔ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；
１—ｐＸＭＪ１９ ｘｙｌＡ（＋） ／ ＥｃｏＲ Ｉ
图 ２　 表达重组子 ｐＸＭＪ１９（＋） ｘｙｌＡ的酶切鉴定
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＥｃｏＲＩ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｌａｓｍｉｄ ｐＸＭＪ１９⁃ｘｙｌＡ（＋）
图 ３　 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２ Δｌｄｈ和
Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＣ ２利用葡萄糖或
木糖的生长情况
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２ Δｌｄｈ ａｎｄ
Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＣ⁃２ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ ｍｉｎｅｒａｌ ｍｅｄｉｕｍ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｅｉｔｈｅｒ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｒ ｘｙｌｏｓｅ
达使菌株 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２ Δｌｄｈ 具有利用
木糖生长的能力，拓宽了其底物利用范围。
２􀆰 ４　 重组菌株 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＣ ２ 利用混合糖
的生长情况
　 　 在添加 １２ ｇ ／ Ｌ 木糖和 １４ ｇ ／ Ｌ 葡萄糖的 ＢＴ 发
酵培养基中，３０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 有氧培养 ３６ ｈ，考察
重组菌株 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＣ ２ 利用混合糖的生长
情况，结果如图 ４所示。
由图 ４可知：在混合糖发酵过程中，重组菌株首
先利用葡萄糖，在发酵 ２４ ｈ 时，葡萄糖几乎被消耗
完，而木糖为 ９􀆰 ８ ｇ ／ Ｌ，仅消耗了 １５％，发酵至 ３６ ｈ
时，６０％的木糖被利用，该结果表明，由于碳代谢阻
遏效应的存在［１３ １４］，菌株不能够同时对葡萄糖和木
糖进行利用。
图 ４　 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＣ ２利用混合糖的生长情况
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＣ⁃２ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ
ｍｉｎｅｒａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｉｘｅｄ ｓｕｇａｒ
２􀆰 ５　 重组菌株 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＣ ２ 的两阶段发
酵情况
　 　 为了考察重组菌株利用木糖生产有机酸的情
况，本研究采用两阶段发酵模式，即利用添加 ２０ ｇ ／ Ｌ
木糖的 １００ ｍＬ Ａ培养基，３０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ培养 １８ ｈ
进行好氧发酵，然后通过添加 ４０ ｇ ／ Ｌ 木糖的 ５０ ｍＬ
ＢＴ培养基，３０ ℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ 培养 １８ ｈ 进行厌氧发
酵产酸，结果如表 １所示。
由表 １可知：对照菌株 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２
Δｌｄｈ不能够以木糖作为唯一 Ｃ 源生产有机酸，而重
组菌株 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＣ ２在厌氧条件下发酵 １８ ｈ
内，可消耗（２６􀆰 ０±０􀆰 ０８）ｇ ／ Ｌ木糖，发酵产物主要是琥
珀酸，其收率可达到（０􀆰 ６２±０􀆰 ００３）ｇ ／ ｇ，与对照菌株相
同条件下消耗葡萄糖发酵结果大致相同。
在谷氨酸棒杆菌中，运输己糖主要通过磷酸转
移酶系统［１５］，但是机制尚不清楚，对于其他革兰氏
阳性菌中戊糖转运的机制已有报道［１６］：比如，突变
的枯草芽胞杆菌通过 ＡｒａＥ 蛋白运输木糖，自身的
１３　 第 ２期 张恒丽等：代谢木糖重组谷氨酸棒杆菌的构建
Ｈ＋同向运输载体负责阿拉伯糖的转运［１７］；几种重
组的酿酒酵母菌株通过非特异性的单糖运输系统
吸收木糖，但是对木糖的亲和力比葡萄糖低将近
２００倍［１８］。 本研究则通过表达 ｘｙｌＡ 基因实现了谷
氨酸棒杆菌对木糖的利用，表明在谷氨酸棒杆菌中
存在与木糖吸收有关的运输载体。
表 １　 菌株两阶段发酵结果
Ｔａｂｌｅ １　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｗｏ⁃ｓｔａｇｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
菌株 ρ（耗糖） ／（ｇ·Ｌ－１）
ρ（产物） ／ （ｇ·Ｌ－１） 收率 ／ （ｇ·ｇ－１）
琥珀酸 乙酸 丙酮酸 琥珀酸 乙酸 丙酮酸
Δｌｄｈ
（以葡萄糖为唯一 Ｃ源） ２４􀆰 ５±０􀆰 ０５ １７􀆰 ２６±０􀆰 １９ ３􀆰 ０３±０􀆰 １ ２􀆰 １７±０􀆰 ０４ ０􀆰 ７０±０􀆰 ００３ ０􀆰 １２±０􀆰 ００４ ０􀆰 ０９±０􀆰 ００４
ＮＣ ２
（以木糖为唯一 Ｃ源） ２６􀆰 ０±０􀆰 ０８ １６􀆰 ０５±０􀆰 １１ ３􀆰 １±０􀆰 ０６ ０􀆰 ８２±０􀆰 ０６ ０􀆰 ６２±０􀆰 ００３ ０􀆰 １２±０􀆰 ００８ ０􀆰 ０３±０􀆰 ００６
Δｌｄｈ
（以木糖为唯一 Ｃ源） — — — — — — —
３　 结　 论
以拓宽谷氨酸棒杆菌底物利用谱进行有机酸发
酵为目标，将 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｘｙｌＡ 基因成功构建到诱导型表达
载体 ｐＸＭＪ１９，酶活测定证明转入 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
ＡＴＣＣ１３０３２ Δｌｄｈ中的酶基因得到了活性表达。 实验
表明，该工程菌株 Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＣ ２ 可以在木糖
为唯一 Ｃ源的培养基中进行生长，培养 ２４ ｈ 后的菌
体生长量与利用葡萄糖的菌体水平基本相同，木糖的
消耗速率达到 ０􀆰 ５４ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），与葡萄糖消耗速率相比
略低。 在添加葡萄糖和木糖的 ＢＴ 培养基中发酵时，
重组菌优先利用葡萄糖，在葡萄糖完全消耗后开始有
效利用木糖，以木糖为唯一 Ｃ 源进行两阶段发酵时，
产物主要为琥珀酸，收率为（０􀆰 ６２±０􀆰 ００３）ｇ ／ ｇ。 木糖
异构酶对于木糖利用起着极为重要的作用。
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（责任编辑　 荀志金）
２３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷