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RAPD analysis of genetic differentiation in the different hosts and geographic populations of Drosicha corpulenta

草履蚧不同寄主和地理种群遗传分化的RAPD分析



全 文 :第 36 卷第 2 期
2016年 1月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.36,No.2
Jan.,2016
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:河北省自然基金(C2009000592)
收稿日期:2013鄄06鄄13; 摇 摇 网络出版日期:2015鄄06鄄10
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: baojiagao@ 163.com
DOI: 10.5846 / stxb201306131697
刘军侠,刘全超,姜文虎,宋晓英,高宝嘉.草履蚧不同寄主和地理种群遗传分化的 RAPD分析.生态学报,2016,36(2):298鄄305.
Liu J X, Liu Q C,Jiang W H,Song X Y,Gao B J.RAPD analysis of genetic differentiation in the different hosts and geographic populations of Drosicha
corpulenta.Acta Ecologica Sinica,2016,36(2):298鄄305.
草履蚧不同寄主和地理种群遗传分化的 RAPD分析
刘军侠1,2,刘全超1,姜文虎1,宋晓英1,高宝嘉1,2,*
1 河北农业大学林学院, 保定摇 071000
2 河北省林木种质资源与森林保护重点实验室, 保定摇 071000
摘要:应用随机扩增多态性 DNA(RAPD)技术对草履蚧保定、石家庄、邯郸 16个不同寄主地理种群遗传多样性和种群分化进行
研究,结果显示 4个 RAPD引物共扩增出 41个多态性位点,多态位点比率为 100%。 遗传距离指数在 0.701—0.4360,平均为 0.
2395。 其中以邯郸枫杨和邯郸垂丝海棠为寄主的草履蚧种群遗传距离最小(0.0701);以石家庄紫叶李和邯郸木槿为寄主的种
群遗传距离最大(0.4360)。 遗传一致度系数在 0.6466—0.9290。 说明草履蚧不同种群遗传多样性丰富并存在遗传差异。 聚类
分析结果表明草履蚧种群遗传多样性同时受到寄主和地理因素的双重影响,且不同寄主草履蚧种群已产生明显的遗传分化。
关键词:草履蚧;寄主植物;种群分化; RAPD
RAPD analysis of genetic differentiation in the different hosts and geographic
populations of Drosicha corpulenta
LIU Junxia1,2, LIU Quanchao1,JIANG Wenhu1,SONG Xiaoying1,GAO Baojia1,2,*
1 College of Forestry,Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, China
2 Key Laboratory of Germplasm Resources of Forest Trees and Forest Protection College of Forest of Hebei, Baoding 071000,China
Abstract: The genetic diversity and population differentiation among geographic populations of 16 different Drosicha
corpulenta host collected from Baoding, Shijiazhuang, and Handan in Hebei were analyzed by RAPD. The results showed
that four RAPD primers were amplified out of 41 polymorphism loci, and that the percent of polymorphic loci was 100%.
The genetic distance index of the populations ranged from 0.0701 to 0.4360 and the average value was 0.2395. The genetic
distance index for D. corpulenta populations on Pterocarya stenoptera and Malus halliana (Voss.) Koehne in Handan was
the smallest (0.0701). The genetic distance index for D. corpulenta populations on Prunus cerasifera in Shijiazhuang and
Hibiscus syriacus in Handan was the largest of all, and the similarity coefficients ranged from 0.6466 to 0.9290.The genetic
diversity of the different D. corpulenta populations was classified as abundant, and genetic differences were found. According
to the results of cluster analysis, the genetic diversity of D. corpulenta populations was affected by both host and geographic
location, and the different host populations of D. corpulenta showed obvious genetic differentiation.
Key Words: Drosicha corpulenta; host plant; population differentiation; RAPD
随着分子生物学发展,应用分子系统分析的方法研究昆虫种群分化和遗传多样性,从分子水平探讨寄主、
环境因子等对昆虫适应进化的影响,以明确昆虫适应进化的分子机制。 蚧虫作为一类营相对固定生活的刺吸
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类害虫,呈聚集型空间分布,扩散能力弱,其发生与寄主种群以及地理环境有着密切的关系[1鄄4],在长期的系
统发育中形成了相对稳定的区系组成以适应不同环境,不同的寄主种群、生态地理种群间差异明显。 高宝嘉
等对皱大球蚧 ( Eulecanium kuwana i)和瘤坚大球蚧(E. gigan tean)地理种群的 RAPD遗传分化的研究发现,
已发生种内遗传变异,但尚未达到亚种水平[5]。 Burban 等通过对松干蚧的研究指出松干蚧种群变异与寄主
植物的遗传结构有关[6]。 本研究选取河北省不同草履蚧 Drosicha corpulenta(kawana)种群,对其遗传分化进行
RAPD分析,揭示寄主植物、地理环境等生态条件对蚧虫遗传分化的影响,为深入探讨植物昆虫协同进化关系
和昆虫适应潜力提供依据。
1摇 材料和方法
1.1摇 供试昆虫
2011年 4—5月于保定、石家庄、邯郸不同寄主上采集雌成虫(表 1)。 不同寄主相距 50m以上,每种寄主
东、南、西、北方向的上、中、下部枝条分别取样。 将采集的蚧虫饥饿 24h以上,使其消化道内的物质充分消化,
以防外源 DNA干扰实验结果;-20益冰箱中保存。
表 1摇 供试草履蚧材料来源
Table 1摇 Sources of D. corpulenta materials for trial
种群代码
Population cord
寄主
Host plant
地点
Site
采样时间
Date
种群代码
Population cord
寄主
Host plant
地点
Site
采样时间
Date
BB 白蜡 保定 20110506 HS 华桑 邯郸 20110509
BBT 紫叶碧桃 保定 20110506 HZ 紫叶李 邯郸 20110509
BY 月季 保定 20110506 HF 枫杨 邯郸 20110509
BZ 紫叶李 保定 20110507 HL 梨树 邯郸 20110509
SB 紫叶碧桃 石家庄 20110507 HM 木槿 邯郸 20110509
SZ 紫叶李 石家庄 20110508 HC 垂丝海棠 邯郸 20110509
SX 悬铃木 石家庄 20110508 HW 紫薇 邯郸 20110509
SC 稠李 石家庄 20110508 HB 紫叶碧桃 邯郸 20110509
摇 摇 BB: 白蜡 Fraxinus chinensis;BBT: 紫叶碧桃 Prunus persica f. atropurpurea;BY: 月季 Rosa chinensis;BZ: 紫叶李 Prunus ceraifera cv. Pissardii;
SX: 悬铃木 Platanus acerifolia (Ait.)Willd; SC: 稠李 Prunus padus L.;HL: 梨树 Pyrus sorotina;HF: 枫杨 Pterocarya stenoptera C. DC;HM: 木槿
Hibiscus syriacus;HC: 垂丝海棠 Malus halliana Koehne;HW: 紫薇 Lagerstroemia indica;HS: 华桑 Morus cathayana
1.2摇 主要试剂与仪器
本实验所用的 TaqDNA聚合酶、dNTP、蛋白酶 K、RAPD引物、DNA标记(DL2000)均由上海生物工程有限
公司生产。
1.3摇 研究方法
1.3.1摇 提取 DNA
参照 Boyce等的方法[7],并做适当修改。 取 1只蚧虫于灭菌的研钵(每个种群取 28个样本),加入液氮迅
速研磨成粉末,放入 1.5mL的离心管中,加入 700滋L 预冷的 2伊CTAB(0.1mol / L Tris2鄄HCl,1.4mol / L NaCl ,
0.2mol / L EDTA,0.2%茁巯基乙醇,0.05mol / L CT AB,pH8.3),加入蛋白酶 K至终浓度为 100滋g / mL,65益下水
浴 1h,用 12000r / min离心 5min,取上清液,加入等体积得酚颐氯仿颐异戊醇(25颐24颐1)轻轻混匀,反复抽提两次。
再经等体积的异丙醇沉淀 1h,4益下 10000r / min 离心 10min,去上清,70%的乙醇清洗 1—2次,干燥后加入适
量 TE溶液溶解 DNA,加入 RNaesA至终浓度为 2滋g / L后,37益下水浴 1h,-20益 保存待用。
1.3.2摇 RAPD扩增及产物检测
经预试验筛选出 4条可用引物,其引物名称及序列见表 2。 参照Williams的方法[8],反应体系 25滋L,其中
模板 50ng,10伊Buffer2.5滋L,Mg2+114—210 mmol / L (因座位而异),dNTP200滋mol / L,引物(0.8滋mol / L),Taq 酶
1.5U反应条件为:94益预变性 1min;92益变性 1 min,37益退火 1 min(因座位而异),72益延伸 2 min,45 个循
环;72益再延伸 10min;4益终止反应。
992摇 2期 摇 摇 摇 刘军侠摇 等:草履蚧不同寄主和地理种群遗传分化的 RAPD分析 摇
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表 2摇 随机引物编号及序列
Table 2摇 RAPD primer codes and their sequences
引物编号
Primer No.
序列(5忆鄄3忆)
Sequence(5忆鄄3忆)
H9 TGTAGCTGGG
H16 TCTCAGCTGG
S64 CCGCATCTAC
S67 GTCCCGACGA
摇 摇 扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶(含 1%核酸显色剂)
分离,电泳缓冲液为 0.5伊TBE,上样量为 10滋L。 电泳结
束后,用凝胶成像仪拍照。
1.3.3摇 数据分析
RAPD为显性标记,同一引物的扩增产物在琼脂糖
凝胶电泳中迁移律相同的条带被认为是同源性的,属于
同一位点的条带按清晰可见的强带或反复出现的弱带
记为 1,无带记为 0,形成二元数据。 应用 Popstream32
和 NTSYSpc2.1软件,计算种群遗传多样性参数并根据遗传相似系数进行 UPGMA种群聚类分析。
图 1摇 引物 H9对 16个草履蚧种群的 RAPD鄄PCR结果
摇 Fig. 1 摇 RAPD鄄PCR results of primer H9 for 16 populations of
D. corpulenta
1—4:HL、HF、HZ、HS;5—8:HB、HW、HC、HM;9—12:SC、SX、SZ、
SB;13—16:BY;BB;BZ;BBT;17:DL2000
2摇 结果与分析
2.1摇 遗传多态位点分析
引物扩增结果见图 1,不同种群遗传多样性统计见
表 3。 供试引物对 16个种群 448个个体进行扩增,共产
生 41条清晰、稳定的片段,平均每条引物扩增10.25条
片段,各片断分子量大小在 200—2000bp 之间,种群内
和种群间并未产生各自特征性带谱。 实验共检测出 41
个多态位点,多态位点比率为 100%,说明草履蚧种群
遗传多样性丰富。 但不同种群的扩增产物多态性结果
不同,各种群多态位点比率在 31.71%—63.41%之间,其
中邯郸紫薇寄主种群多态位点比率最低(31.71%),邯
郸紫叶李寄主种群(63.41%)和邯郸桑树寄主种群(60.98%)多态位点最高,遗传多样性较其它种群丰富。
表 3摇 不同种群遗传多样性统计
Table 3摇 Statistics on the genetic diversity of different populations
种群
Population
样本数
Sample size
总位点数
Total loci
多态位点数
Polymorphic loci
多态位点比率
Proportionof polymorphic
loci(P)
Nei忆s多样性指数
Nei忆s gene diversity
index(H)
Shannon信息指数
Shannon忆s information
index( I)
BB 28 41 22 53.66% 0.1374 0.2149
BBT 28 41 16 39.02% 0.1101 0.1724
BY 28 41 22 53.66% 0.1638 0.2503
BZ 28 41 21 51.22% 0.1740 0.2619
SB 28 41 21 51.22% 0.1596 0.2449
SZ 28 41 19 46.34% 0.1244 0.1952
SX 28 41 22 53.66% 0.1687 0.2543
SC 28 41 19 46.34% 0.1419 0.2145
HS 28 41 25 60.98% 0.1991 0.2967
HZ 28 41 26 63.41% 0.1705 0.2677
HF 28 41 21 51.22% 0.1747 0.2608
HL 28 41 16 39.02% 0.1421 0.2112
HM 28 41 20 48.78% 0.1223 0.1938
HC 28 41 20 48.78% 0.1708 0.2538
HW 28 41 13 31.71% 0.1167 0.1708
HB 28 41 23 56.10% 0.1417 0.2260
总数 Total 448 41 41 100.00% 0.1511 0.2306
摇 摇 种群代号同表 1 (See table 1 for explanation of population code)
003 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 36卷摇
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2.2摇 遗传多样性分析
Nei指数估计的不同种群间遗传距离和遗传一致度结果见表 4。 由表 4 可知,16 个种群 Shannon 信息指
数的变化范围在 0.1708—0.2967之间,平均值为 0.2306。 邯郸桑树种群的 Shannon 信息指数最高,邯郸紫薇
种群最低。 16个种群 Nei忆s基因多样性指数变化范围在 0.1101—0.1991之间,平均值为 0.1511。 邯郸桑树种
群的基因多样性最高,保定紫叶碧桃种群最低,这与 Shannon 信息指数估计的遗传多样性稍有差异。 说明同
一物种不同种群遗传多样性存在差异。
2.3摇 遗传相似度与遗传距离分析
由表 4可知,16 个草履蚧种群的遗传相似度在 0. 6466—0. 9290 之间,平均值为 0. 7873;遗传距离在
0.0701—0.4360之间,平均值为 0.2395,说明不同种群间遗传差异较大。 其中以邯郸枫杨和以邯郸垂丝海棠
为寄主的草履蚧种群最相似,遗传距离最小(0.0701);以石家庄紫叶李和以邯郸木槿为寄主的种群遗传距离
最大(0.4360),说明二者的遗传差异最大。
紫叶李邯郸种群与石家庄种群遗传距离为 0.3330,与保定种群遗传距离为 0.3426;紫叶碧桃邯郸种群与
石家庄种群遗传距离为 0.3170,与保定种群遗传距离为 0.3816;即同种寄主不同地理种群随地理距离的增加
遗传距离增加。
2.4摇 种群遗传相似度聚类分析
用 NTSYSpc2.1 对草履蚧种群的遗传相似系数进行 UPGMA 聚类分析,进一步分析种群间遗传关系(图
2)。 结果显示:同一地理寄主种群绝大多数个体都能聚为一类,说明同一种群中个体间的遗传特性相似程度
高,遗传稳定性;草履蚧相同寄主种群首先聚类,遗传相似系数在 0.67水平,说明寄主因素对草履蚧的种群分
化产生明显的影响;保定、石家庄、邯郸的紫叶碧桃种群各自聚类,且遗传距离较远;同样以上 3地的紫叶李种
群也各自聚类,说明地理因素对种群的分化产生影响;草履蚧不同寄主的三大地理种群并未产生明显地理聚
类,说明相对于地理因素,寄主因素对草履蚧种群分化的影响更加明显。 同一地区不同寄主种群聚类见图 3、
图 4、图 5,可见同一地区同一寄主的个体聚为一类,而同一地区不同寄主间聚类规律不明显。
3摇 结论与讨论
本文通过以上对草履蚧不同寄主和地理种群遗传分化的 RAPD分析,表明: Shannon信息指数和 Nei忆s基
因多样性指数显示草履蚧不同地理种群以及不同寄主种群遗传多样性丰富程度不同,草履蚧不同寄主种群之
间存在不同程度的遗传差异,并已产生种群分化。 草履蚧相同寄主不同地理种群之间存在遗传差异,地理因
素对草履蚧种群分化产生影响。 聚类分析结果显示,草履蚧种群分化同时受到寄主因素和地理因素的双重影
响,相对于地理因素,寄主对草履蚧种群分化的影响更加明显。
草履蚧寄主植物广泛,主动扩散距离有限,因此其发生与寄主植物关系十分密切。 本研究表明草履蚧不
同寄主种群之间已经产生了明显的种群分化,这与草履蚧寄主生态条件、环境胁迫有密切关系。 寄主植物自
身的物理、化学等因素可影响植食性昆虫的生物学习性和遗传特性,促进昆虫种群分化,而昆虫对寄主植物具
有选择性,对于不同寄主植物喜好程度也不尽相同[9鄄10]。 昆虫学家认为植食性昆虫可因嗜食的寄主不同而造
成遗传隔离,由此形成不同的物种。 Takada、Blackman、Weber等研究表明烟蚜在不同寄主植物上存在着种群
分化[11鄄13]。 本实验中寄主植物分类科属不尽相同,其生物学特性和化学成分各异,我们推测寄主植物种类不
同是造成草履蚧种群分化的重要原因。
此外,大气污染以及昆虫群落结构[14鄄15]等环境胁迫均能影响寄主植物与昆虫的关系,本实验寄主植物除
受到草履蚧危害外,同时受到其他不同种昆虫取食。 不同寄主植物上昆虫的种类、数量以及植物所处环境的
不同可能都对草履蚧种群分化期作用,下一步有待从多因素分析探讨草履蚧种群分化原因。
103摇 2期 摇 摇 摇 刘军侠摇 等:草履蚧不同寄主和地理种群遗传分化的 RAPD分析 摇
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图 2摇 16个草履蚧种群聚类分析图
Fig.2摇 The UPGMA dendrogram cluster of 16 Drosicha corpul populations
种群代号同表 1 (See table 1 for explanation of population code); 为了方便比较查看,本图中每个种群采用 5个样本的聚类分析; 其聚类分析
趋势与全部个体聚类图相一致,具有代表性
303摇 2期 摇 摇 摇 刘军侠摇 等:草履蚧不同寄主和地理种群遗传分化的 RAPD分析 摇
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图 3摇 石家庄草履蚧种群聚类分析图
Fig.3摇 The UPGMA dendrogram cluster of Drosicha corpul populations of Shijiazhuang
图 4摇 保定草履蚧种群聚类分析图
Fig.4摇 The UPGMA dendrogram cluster of Drosicha corpul populations of Baoding
403 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 36卷摇
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图 5摇 邯郸草履蚧种群聚类分析图
Fig.5摇 The UPGMA dendrogram cluster of Drosicha corpul populations of Handan
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