全 文 ：第 1 4卷
1 9 8 1
实 验 生 物 学 报
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研 究 简 报
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长叶车前花叶病毒上海分离株 ( H R V 、 、 )
外壳蛋白功能的研究 `
郭惠民 郁操国 王鸣歧
(上海复旦大学生物系 )
孙玉 昆
(中国科学院上海生物化学研究所 )
植物病毒寄主的致病性是由病毒核酸
决定的 , 而 由病毒核酸编码的病毒蛋白的
功能则是保护病毒核酸不受外界物理及化
学因素的破坏作用 。 至于植物病毒外壳蛋
白在感染上是否起作用 , 是个尚未解决的
问题 。 郁操国等 (未发表 )曾报道了 H R vs 、
外壳蛋 白赖氨酸侧链被三硝基苯磺酸修饰
(T N P
一
H R V
。。 )后 , 感染力有明显的下降 ,
提出植物病毒外壳蛋白在感染上确有重要
作用 。 本文报道了修饰后的 T N P一 H R v s h
与天然的 H R V 日 h 对心叶烟的感染力有 干
扰作用 。 本 此 , 用 1 31 1 标记 H R Vs h 外 壳
蛋白 ( 1 “ 11一H R Vs h ) ,对 H R Vs h 外壳蛋白的
功能作了进一步的研究 。 观察到修饰的病
毒 ( T N P一 H R V S、 ) 或无感染力的病毒蛋白
( H R V
` h 一蛋白 )均与 1 3 11 标记的病毒 ( 1 3 11 -
H R Vs
h ) 之间对青菜原生质体质膜的吸着
有竞争作用 , 而牛血清白蛋白 与 1 31 -1 H -
R v
, 。 则否 。 从而显示 H R从 h 在感染寄主
细胞时 , 其寄主细胞膜上存在着对 H R vs h
外壳蛋 白有专一性的感染位点 。
T N P 一H R从、 对天然 病 毒 H R V 。 h 感
染力的干扰作用 : 将 T N P一 H R Vs h与天然
的 H R V ` ,、 棍合后 , 采用半 叶法感染 心 叶
烟 , 当混合样品中 , 天然 H R Vs h 浓度 与
对照样品浓度相同时 , 其感染力只有对照
样品的一半 (见表 1 ) 。
表 1 修饰后的 H R V北对 天然 H R V 由
感染力 的影响
枯斑数 /半叶
H R V
o h
(20 0微克 /毫川一 )
H R巩 h ( 20 0 微克 /毫升 )
+ T N P
一
H R讥 h (20 0微克 /毫升 )
l a l l
一
H R V
。 b的制备 : 参 照 S t二 n l e y 的
方法 l[] , 采用同位素一酶标记技术 ,将 13 , I
标记 到病毒外壳蛋白的酪氨酸上 。 于一硬
质小试管中 , 依次加入 : 0 . 1 毫升 H R 认 、
19 8 0年 12月 20 日收到 。
朴 本文在同位素测定中 , 曾得到彭励吾同志 的 帮
助 , 特此致谢 。
郭惠民 郁操国 王鸣歧 孙玉昆 1 4 卷
( 5毫克 /毫升 ) ;0 . 1 毫升 o . 0 5M磷酸 缓
冲液 ;N al 3 l lo 或 10 0 微升 ( l 毫居里 /毫
升 ) ;然后 , 加入 30 微升 ( 1 毫克 /毫升 )
辣根过氧化物酶* ( 2 5 0 0 0 单位 ) , 50 微升
H
Z
O
:
( A
.
R ) ( 3 0% H ZO: 稀释 10 0 0 倍 ) ,
反应 15 分钟后 , 加入 0 . 30 毫升 s x i o 一 ZM
D L 一胧氨酸 , 接着过 D E A E 一 S e p h a d e x A -
2 5 ( C I
一
)柱 ( l x l o 厘米 ) , 用含 o . SM N o C I
的 0 . 0 5M磷酸缓冲液 ( P H 7 . o )洗脱 , 收 集
液每管约 0 . 3 毫升 , 取 0 . 0 5 毫升铺样后 ,
在钟罩型探测仪上进行测定 。 绘制曲线于
图 1 。 得到 1 3 1 标记的 H R Vs 、 放射 性 强
度分布曲线 , 峰 ( I ) 为 1 3 11一H R认 h ; 峰
( I )为过量未标记的 1 31 1 。 测定 l “ 1 一H R 一
vs
h 的光谱 , 见 图 2 。 发现 1 31 卜 H R vs 、 与
天然的 H R Vs h 的光谱图是一致的。
3X 10
主
10 了 I 》 3 0
图 1 ’缸 I 一 H R V hs 的放射性 强度分布 曲线
峰 ( I )为 13 1 1一 H R V hs : 峰 ( l )为过剩的 1 , 11 .
病毒感染早期感染力的测定 : 将新鲜
制备的原生质体叫 (含 10 “ 个细胞 /毫升 )
各加入 0 . 1 毫升多聚鸟氨酸 10 微克 /毫升
10 分钟后 , 分别加入不同量的 T N P 一H R -
vs
h 、
H R Vs
h一蛋白以及牛血清白蛋 白 , 最
后各加入等量的 1 3 1卜 H R从 h , 摇匀 , 30 ℃
左右保温 20 一 30 分钟 , 并不时地加 以摇
动 。 接种后 , 用 o . o 6M磷酸缓冲液洗 涤 ,
。 门卜一峨r 一翁厂爪渝一一一一
波长 (毫微米 )
图 2 1. 1 1一 H R V s h 光谱图
离心 ( I O o o rP m )去上清液 ,反复洗 3一 4次 ,
直至洗出液测不出计数时 , 加入 0 . 1 毫升
水悬浮 , 取 0 . 1 毫升铺样 , 烘干 , 测定该
原生质体的放射性强度 。
表 2 结果表明 , 当单单用 1 3 1 一 H R矶 。
对原生质体接种时 , 测定出原生质膜吸着
标 记 病 毒 的计数 叩m 为 1 0 5 3 0 , 当在等
量的 l ” 1于H R vs h (最终浓度为 10 0 微克 )
中 , 若加入 T N R H R Vs 、 (最终浓度为 1 0
微克 ) 时 , 其计数 cP m 约 为 6 40 匀 若加入
T N F H R从 h (最终浓度为 2 0 微克 )时 ,则
计数 cP m 仅为 2 5 5 8 。 随着加入修饰 病 毒
量增加 , 其计数大大降低 。 当 在 等 量 的
l13 -l H R vs
h中 , 加入病毒蛋 白时 , 原生质
体质膜吸着标记病毒的计数也随之降低 。
因此 , 当在等量 1 “ l一H R vs 、 中 , 无论加入
若 此酶为美国 S ig m a 化学公司产 品 N o . 83 7 5 。
3 期 长叶车前花叶病毒上海分离株 ( H R V s h )外壳蛋白功能的研究
表 2 T N P 一H R V 山 、 H R V 由 蛋白及牛血清 白蛋 白与 1 . 王一 H R V 劝 , 对原生质体质膜 吸着 的影响
11昌 1一 H RVs h T N P
一
H R V
o il H R V
o h 蛋白 牛血清白蛋白 l : , 1一 H R从h 对原 相对吸着率
* 10 0召g (召g ) (月g ) (解g ) 生质体质膜的吸着 (多 )
( c Pm ) ( c P
, : 1 )
2
.
2 X 10
。
1 0 0 30 Q 1 0 5 3 0 10 0
2
.
2 只 10 . 20 0 6 4 0 4 6 1
2
.
2 x 10
.
2 55 8 2 4
2
.
2 x 10。 3 3 5 8 3 2
10 0 10 0 1 0 0
4 9
6 0
94
朴 为最终浓度
修饰病毒 , 还是加入 H R vs h- 蛋 白 时 , 则
原生质体质膜吸着标记病毒的计数显著下
降。 但在等量的 1 31 1一 H R vs h 中 , 加入牛血
清白蛋白时 , 原生质体质膜吸着标记病毒
的计数下降不明显 (约 6 % ) 。 由表 2 可见 ,
若单单加 1 31 1一H R从 h 时 , 相对吸着 率 作
为 10 0 % 的 话 , 则 加 入 T N卜H R Vs h 或
H R vs
h一蛋 白后 , 其相对吸着率下 降 50 一
60 %左右 , 而在加入牛血清白蛋白的样品
中 , 其相对吸着率则为 9 4 % 。
以上结果显示出 1 31 卜 H R Vs h 在 感 染
原生质 体 时 , T N P一 H R v 。 、 或 H R vs h一蛋
白对 1 “ 11一H R V s 。 吸着原生质膜有明 显 的
干扰作用 。 而牛血清白蛋白却没有明显的
干扰作用 。 从而 , 我们设想在寄主植物细
胞膜上存在着一定的感染位点 。 在感染早
期 , 这种感染位点与植物病毒外壳蛋 白的
吸着有关 。 当等量 1 3 11一 H R vs h 接种 原 生
质体时 , 加入不 同量的 T N P一 H R vs h 或 H
R Vs
h一蛋白时 , 由于感染位点被后者 占据 ,
使 又“ 11一 H R 从 、 对原生质体膜的吸着 能 力
大大下降 。 所 以 1“ ` I一 H R v o h 与 T N F H -
R vs
、 或 H R vs h一蛋白对原生质体 接 种 时
表现的这种干扰作用 , 实际上是它们对原
生质体质膜感染位点的竞争 。 因此 , 我们
推断 , 很可能在感染早期 , 病毒蛋白对于
寄主细胞膜上位点的识别有一定的作用 。
关于植物寄主细胞膜上存在感染位点的间
题尚待进一步深入研究 。
参 考 文 献
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[ 2 ] S
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5 4 0
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3 1 2郭惠民 郁操国 王鸣歧 孙玉 昆 14卷
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