全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
6;CE@G@SDK2E3JDF/CDA2DL@GG^ E4CE@@2CE4
dDJ>! ,D>#
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IDC"&%>(5 7`>CGGE>&5*$ ?(5*!>$%&%>%#>%&$
收稿日期"$%% ?&& ?&
基金项目"科技部资助项目#$%%QSP&%%.*$)天津市科委资助项目#%*O+\+,6%.#%%&%O6OR0)%.$%%$
作者简介"李 丽#&!(%$&女&山东烟台人&硕士研究生&研究方向"纳米生物传感器)张娟琨#联系人$&教授& 1^M3CJ":;3E4`afBKGB>@IK>LE
新型青霉素生物传感器的研究
李"丽&张娟琨&赵"晶&吴"艳&王达飞
#天津科技大学 生物工程学院&教育部工业微生物重点实验室&天津市工业微生物重点实验室&天津 (%%.#*$
摘"要"以青霉素为模板分子&采用溶胶 凝胶法合成分子印迹膜&以浸泡的方法移除印迹分子&制备青霉素分子印
迹膜电极 本印迹电极能有效地避免类似物对其测定的干扰 通过循环伏安法研究传感器对青霉素的响应特性&
结果表明"富集时间为$%% G&在 %h& j&h!
#
47Z质量浓度范围内&青霉素在磷酸缓冲液#度呈良好的线性关系 吸附后的膜电极用甲醇洗脱后再生&可以重复利用 ( 次&可以应用到实际检测中
关键词"修饰电极)分子印迹膜)青霉素
中图分类号"8#%(""""文献标志码"P""""文章编号"&5*$ ?(5*!#$%&%$%# ?%%#( ?%5
E409545F.2/2790/.:.6./.J94./F0IJ0JH45/0060:F42:-0J.:5610/124
Z_ZC&O+P,QSK3E1aKE&O+P-SCE4&TX]3E&TP,QR31F@C
#6DJ@4@DF/CD@E4CE@@2CE4&c@HZ39D23BD2HDF_EIKGB2C3JbCL2D9CDJD4HDFbCECGB2HDF^ IKL3BCDE&
c@HZ39D23BD2HDF_EIKGB2C3JbCL2D9CDJD4HDFYC3E C`E&YC3E C`E XEC[@2GCBHDF0LC@EL@3EI Y@L;EDJD4H&YC3E C`E (%%.#*&6;CE3$
*H1F45:F"bDJ@LKJ32JHCMA2CEB@I M@M923E@N3GA2@A32@I 9HKGCE4A@ECLCJCE 3G3B@MAJ3B@MDJ@LKJ@9H
GDJ14@JGHEB;@GCG3EI 2@MD[CE4B;@CMA2CEB@I MDJ@LKJ@>6HLJCL[DJB3MM@B2HN3GKG@I BDM@3GK2@B;@2@1
GADEG@BDA@ECLCJCE>Y;@@E2CL;M@EBBCM@DFMDJ@LKJ32JHCMA2CEB@I M@M923E@@J@LB2DI@N3G$%% G>_E B;@
LDEL@EB23BCDE 23E4@F2DM%h&
#
47ZBD&h!
#
47Z& B;@LK2@EBCEB@EGCBHDFA@ECLCJCE CE JCE@322@J3BCDEG;CA NCB; CBGI@EGCBH>Y;@G@EGD2@JKB@I NCB; M@B;3EDJLDKJI 9@2@KG@I B;2@@BCM@G>Y;@CM1
A2CEB@I MDJ@LKJ32M@M923E@GLDKJI @EGK2@B;@GB39CJCBH3EI B;@GA@LCFCLCBHNCB;CE 3N@@a>
L0G K24I1"@J@LB2DI@)CMA2CEB@I MDJ@LKJ32M@M923E@)A@ECLCJCE
""分子印迹技术 #MDJ@LKJ32JHCMA2CEBCE4B@L;1
ECUK@G&b_Y$ 是通过模板分子与功能单体的共价键
或非共价键作用&根据待测分子的结构和官能团来
进行,量身定做- #B3CJD2M3I@$&在交联剂的存在下
将模板分子固定在交联的聚合物网络上&聚合后移
去模板分子&留下与模板分子形状和功能基相匹配
的孔洞的一种技术 形成的分子印迹聚合物具有
高度交联的结构&有高亲和力和高选择性的分子识
别位点*& ?.+ &其稳定性好&能够在高温(高压(有机溶
剂(酸(碱等苛刻环境中使用&且寿命长(应用范围
广(造价低廉&在手性化合物的色谱分离(固相萃
取(仿生传感器等研究领域应用广泛 分子印迹聚
合物的这种选择性识别分子的功能&与天然的生物
分子识别系统如单克隆抗体或受体相比&具有很高
的选择性和稳定性&且制备简单&因此非常适于用
作传感器的识别元件
""分子印迹溶胶 凝胶技术是利用溶胶 凝胶过程
将分子模板引入到无机网络结构中&形成一种刚性
材料的分子印迹技术 一旦模板分子从主体中除
去&就会对模板分子显示出较好的亲和性 分子印
迹溶胶 凝胶材料克服了分子印迹有机聚合物的刚
性与惰性较差的缺点&已成为生物化工领域制备高
分子材料的重要研究方向*#+
""青霉素为
!
内酰胺类抗生素&因抗菌作用较强
而被广泛应用于兽医临床中 美国食品药品监督
总局#)RP$规定青霉素的安全限量为#
#
47Z&欧盟
# X^$将牛奶中的青霉素最大残留量#bWZ$定为
.
#
47Z
*5 ?*+
我国农业部规定&青霉素在可食组织
中的bWZ为#% E474 在养殖过程中如不合理使用
青霉素&将导致可食用组织和产品中青霉素的残留
超标&残留的青霉素能引起敏感人群的过敏或可诱
导产生耐药的菌株 目前报道检测动物产品中抗
生素的方法有微生物法*!+ (免疫法* ?&(+ (高效液相
法*&.+ (质谱法*&#+ (紫外检测法*&5+ 其中&微生物法
中的纸片法检测限可达%h%& X7MZ&而 YY6法最低
检出量为%h%%. X7MZ*!+ &操作简单&但是不适宜对
现场试样检测 免疫法的检出量也可达到
%h$# X7MZ&但是免疫法时间较长&不能满足快速检
测的要求 仪器分析法对青霉素的检测虽然具有
较高的精确性&检测限可低于(
#
47Z&这些方法设
备昂贵&对试样处理要求也高
""生物电化学传感器由于具有测定快速(灵敏(
经济等优点&比较适合现代化畜产品检测的需要
本研究利用分子印迹技术&采用溶胶 凝胶法制备以
青霉素为模板分子的分子印迹膜电极&考察印迹膜
电极对青霉素及其类似物的电化学行为&以建立高
选择性检测青霉素的分析方法
C?材料与方法
CMC?仪器与试剂
""Zc$%%#P电化学工作站#天津市兰力科化学电
子高技术有限公司$&实验采用三电极系统"玻碳电
极(印迹或非印迹膜修饰的玻碳电极为工作电极
#
%
l. MM$&以P47P46J电极为参比电极&以 $&( 型
铂电极为对电极)Xd $.%& 型紫外可见分光光度计
#日本岛津公司$)真空干燥箱#天津市三水科学仪
器有限公司$)0/($%%RY超声波清洗机#宁波新芝
生物科技股份有限公司$
""青霉素钠#哈药集团制药总厂$(( 氨丙基三乙
氧基硅烷#P
#,+
(
!+
$
-$( 双 氧 水 # +
$
-
$
$ 和 铁 氰 化 钾
#c
(
*)@#6,$
5
+$均购自天津市永大化学试剂开发
中心)其他试剂均为分析纯&实验用水均为双蒸水&
所有溶液均用双蒸水配制
CMA?电极的预处理
""将玻碳电极依次在砂纸上由粗到细打磨电极
至平&然后在麂皮上抛光&再在双蒸水中超声处理&
最后在c
(
*)@#6,$
5
+ 的磷酸盐 #*h%$中在%h5 j?%h& d下循环伏安扫描&峰电位差
在!% Md左右说明电极已经打磨好
CMQ?分子印迹膜传感器的制备
""将P
素的甲醇溶液&通,
$
除氧并混合&% MCE后得到印迹
溶胶 将溶胶涂抹在玻碳电极表面&过夜形成凝胶
""将电极放在甲醇中浸泡&并更换洗脱液&直至
用循环伏安法扫描电流强度不再变化&并且洗脱后
电极的电流强度和裸玻碳电极的电流强度很接近&
说明分子印迹膜中的模板分子已经被洗脱完全&即
制得青霉素的分子印迹膜传感器
CMR?非印迹膜传感器的制备
""除了不加模板分子青霉素外&其他步骤与制备
印迹膜传感器相同
CM@?分子印迹膜的表征
&h#h&"印迹膜的特异性实验
""先配制 %h& j$h(
#
47Z的青霉素 洗脱后的印迹膜电极和非印迹膜电极分别浸入相
同质量浓度的青霉素的行循环伏安扫描#扫描电压范围为 %h5 j?%h& d&
扫描速率为&%% Md7G$&记录电流强度与青霉素溶
液浓度间的关系&比较印迹膜与非印迹膜对青霉素
的吸附 为了比较印迹膜与非印迹膜分别对其他
相似抗生素的吸附&用牛奶配制 % j$h(
#
47Z质量
浓度的青霉素和四环素溶液&将印迹膜和非印迹膜
依次放入上述浓度的溶液中&进行循环伏安扫描&
再以青霉素的质量浓度和电流强度绘制标准曲线
将上述步骤重复 ( 次以保证结果的准确性
&h#h$"印迹膜的重现性实验
""印迹膜在甲醇中洗脱后可以将原来制备溶胶
时加入的青霉素从膜中解离出来&在印迹膜上形成
青霉素的孔穴&再一次吸附后将青霉素又洗脱下来
的分子印迹膜仍然可以吸附并检测青霉素 将洗
脱的分子印迹膜再一次吸附&然后洗脱&依此重复
几次直到印迹膜对青霉素的吸附量减少时停止&重
复的次数即为印迹膜的重复使用次数
.# 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
A?结果与讨论
AMC?模板分子(功能单体及交联剂的配比
""功能单体和交联剂的比例对聚合物的性能也
有很大的影响 当交联剂的用量较低时&聚合物会
因没有足够的交联度而无法保持稳定的孔穴构型&
导致聚合物识别能力降低)但是过高浓度的交联剂
会破坏印迹效果&使单位质量聚合物内含有的功能
单体数目低而减少聚合物的识别位点&尤其是对于
非共价键结合作用&适量的交联剂既可以减少聚合
物在不同溶剂中的溶胀问题&提高选择性&尤其是
可以增强对结构类似物的区分能力&又能增大聚合
链的空隙使待测物较快地通过扩散作用进入识别
位点
""本实验以青霉素为模板分子&P
比&筛选最佳功能单体和交联剂的比例&确定最佳
效果的聚合物 设计了 5 种聚合物中试剂配比
#b_<$1 #模板分子$k1 #功能单体$k1 #溶剂$k
1#Y^-0$k1#催化剂$不同比例对青霉素吸附前后
电流强度变化#图 &$
b_<1&%$k&k&k$k%h%#)b_<1$%$k&k&k$k%h&)b_<1(%$k&k&k&k%h$)
b_<1.%$k&k&k&k%h%#)b_<1#%&k&k&k&k%h&)b_<15%&k&k&k$k%h$
图 C?聚合物中试剂配比对吸附的影响
T.;=C?#70:F127F-0926GJ04405;0/F45F.2 2/5H1249F.2/
""对不同比例合成的凝胶涂覆的电极吸附青霉
素前后的电流强度比较如图 & 所示 由图 & 可知"
当模板与功能单体(溶剂(交联剂和催化剂的物质
的量比例为 &k&k&k&k%h& 时&所得的 b_<1# 具有较
好的选择性和识别能力&在吸附青霉素前后电流强
度的变化值较大 说明当模板分子和功能单体的
物质的量相同时&可以尽可能利用功能单体上的位
点&并且催化剂的量远远少于溶剂&可以保证聚合
环境的弱酸性
AMA?模板分子的洗脱
""在印迹聚合物能获得实际应用前&必须从聚合
物中尽量将聚合时引入的模板分子去除干净&通常
用索式提取的方法&但是由于凝胶是涂覆在电极上
的&不适于索式提取器&所以选择浸泡的方法
""洗脱时洗脱剂的选择至关重要&一般选择对模
板分子溶解性大的溶剂&使模板分子能够尽量地被
洗脱下来&要达到洗脱效果好又不能破坏聚合物结
构的目的 选 +o作为模板分子青霉素的置换剂&
将模板分子青霉素从聚合物中置换出&同时用甲醇
溶解置换出的青霉素 为了能够将模板分子尽可
能除去&比较了甲醇(体积比为 k&的甲醇和乙酸(
%h& MDJ7Z+6J( 种洗脱剂&以 5 种聚合物分别在 (
种不同洗脱剂中洗脱# ;和&% ;前后电流强度差#图
$$ b_<1& 和 $ 分别为用甲醇洗脱# ;和&% ;&b_<1(
和 . 分别为用甲醇乙酸混合液洗脱# ;和&% ;&
b_<1#和 5 分别为用盐酸洗脱# ;和&% ;
&%b_<1&用甲醇洗脱 # ;) $%b_<1$用甲醇洗脱 &% ;) (%b_<1(
用甲醇乙酸混合液洗脱 # ;) .%b_<1. 用甲醇乙酸混合液洗脱
&% ;) #%b_<1#用盐酸洗脱 # ;) 5%b_<15用盐酸洗脱 &% ;
图 A?洗脱液的选择
T.;=A?,-2.:0270630/F1
""由图 $ 可知"当选择甲醇作为洗脱剂时&虽然
# ;时电流强度变化与其他 $ 种洗脱液相差不大&但
是&% ;时甲醇做洗脱液的电流强度变化值要明显高
于其他 $ 种洗脱液&即甲醇洗的时间多于# ;就能显
示出洗脱的效果 其他 $ 种可能由于酸性太强&破
坏了共用电子对和
1
共轭后&时间越长对膜的物
理作用越大&最终导致洗脱的效果不佳 因此洗脱
时选择甲醇作为洗脱液
""为了进一步确定甲醇洗脱的时间&每隔& ;在紫
外 可见分光光度计下检测洗脱液的吸光度&在吸光
度达到最高时即为洗脱完全#图 ($
""由图 ( 可知"! ;时洗脱液中的青霉素浓度最
##"第 # 期 李"丽等"新型青霉素生物传感器的研究
3%洗脱 ! ;)9%洗脱 * ;)L%洗脱 ;)I%洗脱 5 ;)
@%洗脱 &% ;)F%洗脱 # ;)4%洗脱 . ;);%洗脱 ( ;)
C%甲醇空白液
图 Q?紫外检测洗脱液的吸光度
T.;=Q?
由于洗脱时间过长&分子印迹膜中的其他成分被甲
醇浸泡下来 为了既能保证洗脱效果又不破坏印
迹膜的物理结构&本实验洗脱的最佳时间定为! ;
AMQ?聚合物表征
$h(h&"吸附时间的确定
""吸附时&青霉素离子进入分子印迹膜中需要一定
的时间&时间太短不能吸附足够的青霉素&时间太长
会降低效率甚至有部分青霉素游离&因此通过时间电
流曲线来确定吸附青霉素的最佳时间#扫描电位为
%h&! d&扫描速度为#% Md7G$ 在$%% G的时候电流
值趋于稳定&即吸附青霉素达到平衡稳定&每当增加
&个浓度值&就会引起电流的变化&待$%% G后再一次
达到稳定 这是由于青霉素印迹的聚硅氧烷交联在
电极的表面进行&该聚硅氧烷在对模板分子的印迹吸
附时避免了向聚合物内部深处的传质&能达到快速的
吸附平衡&作为传感器应用于在线吸附检测具有较大
的优势 由此确定吸附时间为$%% G&即吸附( MCE后
青霉素离子全部进入印迹膜中
$h(h$"吸附平衡结合
""为了将电流值和吸附的青霉素浓度关联&分别
配制青霉素的 #
47Z&将涂覆青
霉素分子印迹膜的电极依次放入其中吸附&进行循
环伏安扫描 将裸玻碳电极(涂膜电极(洗脱后电
极(吸附%h&
#
47Z后电极(吸附$h(
#
47Z后电极的循
环伏安曲线叠加&结果如图 . 所示
""以青霉素的质量浓度为横坐标&电流强度为纵
坐标&拟合出青霉素分子印迹膜在 吸附的平衡曲线&结果见图 #
""由图 # 可知"在 %h& j&h!
#
47Z范围内&随着青
3%裸电极循环伏安曲线) 9%洗脱后循环伏安曲线) L%吸附
%h&
#
47Z后循环伏安曲线) I%吸附$h(
#
47Z后循环伏安曲线)
@%涂分子印迹膜后的循环伏安线
图 R?循环伏安曲线叠加图
T.;=R?,-54F27:G:6.:N26F5JJ0F4G
图 @?E8!中青霉素的吸附
T.;=@?*I1249F.2/2790/.:.6././E8!
霉素质量浓度增加&电流强度降低&当青霉素质量
浓度大于&h!
#
47Z时&随着浓度的增加&电流值就不
再降低&即达到吸附饱和
""因此在 %h& j&h!
#
47Z范围内&以青霉素质量
浓度和电流强度作图&拟合出质量浓度和电流强度
的线性关系&由此可以通过电流强度求出吸附青霉
素的质量浓度&结果如图 5 所示
图 V?初始青霉素浓度与印迹电极电流响应的线性关系
T.;=V?X./0544065F.2/1-.9H0FK00/F-0./.F.56
:2/:0/F45F.2/2790/.:.6./5/IF-0:3440/F
27J260:36546G .J94./F0I060:F42I0
5# 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
""由图 5 可知"青霉素的质量浓度增大时&电流强
度在均匀减小&而且质量浓度和电流强度之间呈良
好的线性关系&因此检测时可以根据电流值计算出
吸附的青霉素质量浓度
$h(h("印迹与非印迹聚合物的平衡结合
""为了评价所合成的聚合物对模板分子青霉素
的结合能力是否有特异性&测定了室温下印迹聚合
物和非印迹聚合物对#
47Z范围
内的溶液&印迹膜和非印迹膜随青霉素质量浓度的
电流强度变化趋势#图 *$
图 [?印迹膜与非印迹膜吸附青霉素动力平衡
T.;=[?)J94./F0IJ0JH45/05/I/2/W.J94./F0I
J0JH45/0IG/5J.:0P3.6.H4.3J5I1249F.2/
2790/.:.6./
""由图 * 可知"随着青霉素质量浓度的增大&
印迹膜对青霉素的吸附容量逐渐增大&电流强度
逐渐降低 非印迹膜对青霉素虽然也有少量的
吸附&但是这种吸附量很小&为无效吸附&相对于
青霉素的吸附可以忽略 在相同条件下印迹聚
合物对模板分子的吸附容量明显高于非印迹聚
合物对模板分子的吸附容量&说明印迹聚合物具
有比较强的印迹效应&对青霉素具有较好的选择
性吸附
""印迹聚合物对青霉素具有选择性结合的原因
是由于制备过程中使配体进行了有序排列&聚合物
内部形成了形状与官能团位置均与青霉素相配合
的空腔&正是由于这些空腔的存在&使分子印迹膜
对模板分子具有良好的选择性结合能力
$h(h."印迹聚合物对青霉素的特异性
""由上述实验可以看出&电极上的印迹膜在 溶液中对青霉素的吸附有特异性&印迹膜与非印迹
膜的吸附量差异很大&膜中的空穴对青霉素分子有
特异识别性 为了更广泛地应用青霉素传感器&在
青霉素的常见介质牛奶中检测青霉素的特异性
因此&分别将印迹膜传感器和非印迹膜传感器在
%h& j$h(
#
47Z青霉素(四环素的牛奶溶液中吸附&
达到平衡时采用循环伏安法扫描吸附后的溶液&电
流强度的变化反映了传感器对青霉素(四环素的吸
附&于是分别以吸附溶液的质量浓度和电流强度作
图 !&比较印迹膜在牛奶中吸附青霉素(四环素&非
印迹膜在牛奶中吸附青霉素的特异性
图 >?印迹膜对青霉素(四环素及非印迹膜对
青霉素的特异性吸附比较
T.;=>?,2J954.12/27F-0190:.7.:.FG 5I1249F.2/27
.J94./F0IJ0JH45/072490/.:.6./&F0F45:G:6./0
5/I90/.:.6.//2/W.J94./F0IJ0JH45/0
""由图 ! 可知&印迹膜在牛奶中对青霉素同样具
有特异吸附性 原因是在凝胶中存在固定排列的
结合基团的立体空腔&空腔的大小决定于模板分子
的立体结构&空腔内结合基团的位置决定于模板分
子中结合基团的位置&二者互补&从而对模板分子
有,记忆-功能&对模板分子具有高选择性 印迹膜
对青霉素吸附量明显高于非印迹膜对青霉素的吸
附量&而印迹膜对四环素的吸附相差不大&而非印
迹膜虽然对青霉素有吸附&但是形成的溶胶由于具
有孔状结构&而四环素由于结构中有与青霉素相似
的部分&所以有的空穴对四环素有吸附&但是吸附
量不大&不会影响印迹膜的特异性 印迹膜中有青
霉素分子留下的空穴&因而对非模板分子如四环素
吸附量很少&说明该分子印迹膜对青霉素具有较高
的选择特异性
$h(h#"印迹聚合物对青霉素的吸附重现性
""溶胶凝胶分子印迹膜修饰的电极具有对青霉
素的特异选择性&为了扩大该传感器的应用&本实
验对分子印迹膜的重复利用进行了研究 将涂覆
有分子印迹膜的电极在吸附青霉素后用甲醇洗脱
! ;&将吸附的模板分子洗脱出来&再一次得到青霉
素的分子印迹膜&如此反复&结果如图 所示
*#"第 # 期 李"丽等"新型青霉素生物传感器的研究
图 ^?分子印迹膜的重现性
T.;=^?S0942I3:.H.6.FG 27J260:3654
.J94./F0IJ0JH45/0
""由图 可知"将分子印迹膜吸附后洗脱再利用
到第 . 次的时候&吸附容量有所降低&但是在前 . 次
中增加相同质量浓度&电流强度的降低相差不多&
证明再生后印迹膜对青霉素的特异性吸附并没有
降低&所以该传感器可以被重复利用 ( 次
Q?结?论
""以分子印迹技术和溶胶凝胶方法相结合&以青
霉素为模板分子&P
(
6--+为催化剂在电极表面制
得分子印迹膜&发现青霉素在 特异性吸附&且在 %h& j&h!
#
47Z范围内电流强度
与浓度呈良好的线性关系&富集时间只有 $%% G&而
且可以用甲醇重生并重复利用 ( 次&因此能够被广
泛应用于青霉素检测
参考文献"
*&+"\C@6Q&ZCK /+&T3E4O]&@B3J>bDJ@LKJ32CMA2CEBCE43BN3JG
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@B;3EICDJ@GB@2M3B2CVMDJ@LKJ32CMA2CEBCE4L;C23JG@A323BCDE M@IC1
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G@M9JHGB23B@4HFD2Y,YCMA2CEBCE4DFADJHM@2E3EDNC2@7E3EDBK9@
323HG*S+>PE3J6;@M&$%%5&*!"!((1!(.5>
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9CGA;@EDJPCMA2CEB@I ADJHM@2MCL2DGA;@2@G3EI B;@C2L;2DM3BD1
423A;CLA2DA@2BC@G*S+>6;CE SPE3J6;@M&$%%!&(5#!$"&%!1&%$>
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*5+"QDBDY&_BD]&]3M3I30&@B3J>+C4;1B;2DK4;AKB3E3JHGCGDFB@B23LH1
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