全 文 ：Vol． 34 高 等 学 校 化 学 学 报 No． 7
2013 年 7 月 CHEMICAL JOUＲNAL OF CHINESE UNIVEＲSITIES 1739 ～ 1742
doi:10． 7503 /cjcu20120965
氯过氧化物酶修饰电极用于
岩白菜素的电催化氯化
王 珂，吴霞琴，李 琳，田海涛，陆中庆
(上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234)
摘要 将氯过氧化物酶(CPO)与双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)混合后滴涂于玻碳(GC)电极表面，制得
CPO-DDAB /GC修饰电极． 循环伏安结果显示，固定在电极表面的 CPO 可与电极之间发生直接的电子传递
作用． 利用高效液相色谱-质谱联用技术对反应产物进行表征，结果显示，以该 CPO 修饰电极为工作电极，
在氧气饱和的氯化钾-岩白菜素溶液中，利用 CPO催化氧还原生成的过氧化氢可进一步驱动 CPO 对岩白菜
素的催化氯化反应． 经估算总转化数(TTN)达到 13600，即 1 mol CPO可催化 13600 mol岩白菜素．
关键词 氯过氧化物酶;修饰电极;岩白菜素;生物酶催化;电催化;氯化
中图分类号 O646 文献标志码 A
收稿日期:2012-10-25．
基金项目:国家自然科学基金(批准号:20973114)资助．
联系人简介:吴霞琴，女，教授，主要从事生物电化学和电化学催化等方面的研究． E-mail:xqwu@ shnu． edu． cn
随着生物酶技术的发展，生物酶在有机合成及药物合成中的应用越来越广泛［1］． 生物酶催化反应
具有高效、绿色、条件温和、区域选择性和立体选择性高等优点［2，3］． 氯过氧化物酶(CPO)是一种特殊
的具有多种不同催化活性的过氧化物酶，可催化底物氧化、氯化、环氧化或脱卤化等反应［4］． 目前
CPO催化的有机合成反应通常在均相反应体系中进行，需要加入大量的 CPO 和过氧化氢来保证生物
酶催化反应的进行［5，6］． 本课题组［7 ～ 12］近年来一直致力于生物酶在电极表面的固定化，并利用修饰电
极上原位电催化氧还原反应产生的过氧化氢进一步驱动 CPO 对底物的催化反应，探索生物酶催化在
Fig． 1 Molecular structure of bergenin
药物合成中的应用．
岩白菜素(Bergenin)是一种多酚类化合物(图 1)［13］，
具有抗菌、消炎、抗病毒等效用［14，15］，可抗肝炎病毒保护
肝脏［16］，对心律失常也有良好的疗效［17］，并对神经系统
有保护作用［18］． 此外，岩白菜素对艾滋病毒(HIV)也有一
定的疗效，应用前景广阔［19］．
近年来，科研工作者致力于对岩白菜素分子中不同位置的羟基进行催化醚化或催化酯化的功能化
反应［20，21］，以提高岩白菜素的药物活性． 朱维良等［22］发现，氯、溴和碘等卤素的存在会影响不同构象
的生物分子中活性部位的生物活性，所以，卤族元素的引入也可以提高药物的活性，这为高性能药物
的合成提供了一个新思路． Krstenansky 等［23］曾报道了用 CPO 催化岩白菜素的氯化反应，但需加入大
量 CPO，成本很高;同时，还要外加 H2O2 来催化反应，操作复杂，难以实际应用．
本文应用电极上固定化的 CPO对岩白菜素苯环上的活性位点(见图 1 箭头所指位置)进行定位催
化氯化，旨在探索一种生物酶催化的“绿色”、环保的药物合成新方法．
1 实验部分
1． 1 试剂与仪器
氯过氧化物酶(CPO，from Caldariomyces fumago，Sigma公司) ;双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB，
分析纯，纯度 98%，Aldrich公司) ;岩白菜素(纯度≥98%，中国标准试剂品公司) ，使用时超声溶于
pH =3. 0 的磷酸缓冲溶液(PBS)中，配置成浓度为 1. 53 × 10 －3 mol /L 的溶液;其它试剂均为分析纯，
所用溶液均用二次超纯水(Heal Force超纯水发生器，上海康雷分析仪器有限公司)配置．
CHI-650A型电化学工作站，上海辰华公司;高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用仪(Agilent 1200
型高效液相色谱仪，Agilent 6400 triple quad LC /MS联用质谱仪) ，Agilent Technologies公司．
1． 2 修饰电极的制备
将玻碳(GC)电极( = 5 mm)先在 6#金相砂纸上打磨，用高纯水冲洗后再依次用 0. 3 和 0. 05 μm
的氧化铝粉末在麂皮上打磨抛光至镜面，分别用无水乙醇及高纯水超声清洗后再经高纯氮气吹干;取
5 μL DDAB溶液(超声分散于二次蒸馏水，10 mmol /L)与 1 μL CPO(2. 93 × 10 －4 mol /L)充分混合均
匀，滴于上述处理干净的玻碳电极表面，室温自然干燥，制得的修饰电极记作 CPO-DDAB /GC．
1． 3 修饰电极的电化学行为
采用三电极体系进行循环伏安测量(CV) ，工作电极为制得的 CPO-DDAB /GC修饰电极，辅助电极
为铂片电极，参比电极为饱和甘汞电极(SCE)． 在 0. 05 mol /L PBS(pH =3. 0，含 0. 1 mol /L KCl作支持
电解质)中考察修饰电极的电化学行为，在氮气饱和(通入高纯氮气充分除氧，并在 CV 测量过程中持
续通氮气)或氧气饱和(持续通入高纯氧气)2 种氛围下进行 CV测量．
1． 4 修饰电极对岩白菜素的催化氯化
以 CPO-DDAB /GC修饰电极为工作电极，将三电极体系组装于电解池中，加入 3 mL 1. 53 × 10 －3
mol /L的岩白菜素溶液(其中加入 0. 1 mol /L的 KCl作为支持电解质，同时作为催化氯化反应的氯离子
源) ，通入高纯氧气并在整个反应过程中持续通入氧气，于室温、－ 0. 6 V 下进行恒电位电解，对产物
进行 HPLC-MS分析． HPLC-MS 测试条件:Agilent C18极性柱(300 mm × 5. 0 mm) ，紫外检测波长 254
nm，柱温 30 ℃，流速 0. 8 mL /mim，进样量 20 μL，流动相为 0. 01 mol /L的醋酸铵水溶液-甲醇，采用
梯度洗脱，有机相(甲醇)从 0 ～ 25 min内在流动相中的体积比为 5% ～15%，同时进行质谱分析．
2 结果与讨论
2． 1 CPO-DDAB /GC修饰电极的循环伏安行为
图 2 为修饰电极在磷酸缓冲溶液中的循环伏安曲线． 从图中可以清楚地看到，CPO-DDAB /GC 修
饰电极在 N2 饱和的(即充分除氧的)PBS中有一对氧化还原电流峰［图 2(A)曲线 a］，而 DDAB /GC 电
极在该电位窗口内无任何氧化还原电流峰［图 2(A)曲线 b］，所以该峰可归因于 CPO 自身的催化活性
中心高铁原卟啉发生的直接电子传递反应［11］． 修饰电极在氧气饱和的 PBS中测得的 CV曲线则显示了
典型的催化氧还原为过氧化氢的反应电流［图 2(B)曲线 b］． 根据法拉第定律 Q = nFAΓ* (其中，Q为
电量，n为电子转移数，F为法拉第常数，A 为电极表面积，Γ* 为单位面积上电活性组分的覆盖率) ，
计算得到修饰电极上 CPO的覆盖率为 3. 82 × 10 －10 mol /cm2 ．
Fig． 2 Cyclic voltammograms of CPO-DDAB/GC electrode in N2-saturated［(A) ，(B)curve a］ and
O2-saturated［(B)curve b］PBS(pH =3． 0)and DDAB/GC electrode in N2-saturated［(A)curve
b］PBS(pH =3. 0)with a scan rate of 100 mV/s
2． 2 岩白菜素催化氯化反应产物的 HPLC-MS表征
图 3 为 1. 53 × 10 －3mol /L的岩白菜素标准品溶液的 HPLC谱图与对应的 MS谱图． ［图 3(A) ］中在
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保留时间为 14. 1 min处出现一个吸收峰，其相应质谱图［图 3(B) ］的最大质荷比峰为m/z 327. 2，为岩
白菜素分子的准分子离子峰(岩白菜素的分子量为 328. 2) ，由此可确认图 3(A)中保留时间 14. 1 min
处为岩白菜素标样的吸收峰．
Fig． 3 HPLC chromatogram(A)and mass spectrum(B)of the bergenin standard solution
图 4 是以 CPO-DDAB /GC 为工作电极，在 － 0. 6 V 下恒电位电解 2 h 后产物的 HPLC-MS 表征结
果． 从 HPLC谱图中可发现 2 个保留时间的吸收峰［图 4(A) ］，与标样图谱［图 3(A) ］相对照可确认，
其中保留时间为 14. 1 min的吸收峰对应于还未反应完全的底物岩白菜素，而保留时间为 21. 6 min 的
峰是催化产物的峰． 图 4(B)为保留时间 21. 6 min 处的质谱图，可以看到，最大质荷比峰为 m/z
363. 1，与预期得到的岩白菜素的氯化产物的分子量 362. 1 相近，因此推测该物质应为岩白菜素的氯化
产物． 图中最大质荷比峰 m/z 363. 1 与相近的碎片离子峰 m/z 327. 2 之间的差值为 m/z 35. 9，推测 m/
z 327. 2 应为岩白菜素氯化产物苯环上失去一个 Cl －的碎片离子峰，这是一个合理的碎片丢失，因此可
以判定质荷比峰 m/z 363. 1 应为岩白菜素氯化产物的准分子离子峰(MH +)． 此外，质谱图中离子峰
m/z 363. 1 与 m/z 365. 2 的相对强度为 3∶ 1，与 Cl同位素 35Cl与 37Cl的相对丰度 3∶ 1［24］相一致． 因此
可进一步确定保留时间为 21. 6 min的物质为岩白菜素的氯化产物．
Fig． 4 HPLC chromatogram(A)and mass spectrum of peak b in (A) (B)of the bergenin
solution electrolyzed with CPO-DDAB/GC electrode for 2 h
(A)Peak a:Unreacted substrate;peak b:the reaction product．
从理论上分析，本方法中岩白菜素的催化氯化反应是一个亲电取代反应，CPO 首先在 H2O2 的作
用下结合 Cl －形成活性中间体［25］，然后与岩白菜素中苯环上的部位(图 1 箭头所指部位)发生亲电取
代反应，得到岩白菜素的氯化产物．
以上理论和实验结果的分析表明，利用本文提出的生物酶结合电化学的方法可定位催化岩白菜素
的氯化反应． 对 HPLC的峰面积进行积分，计算得到反应 2 h后有 22. 49%的岩白菜素被催化为氯化产
物，经估算 150 mg CPO可催化氯化得到 12. 5 mmol氯化岩白菜素，与文献［23］的结果(150 mg CPO催
化得到 0. 8 mmol氯化岩白菜素)相比，相同时间内 CPO的催化效率提高约 15 倍． 且本方法中电极上
的 CPO还可反复利用，从而大大提高生物酶的催化效率． 经初步计算，催化反应的总转化数(TTN)［26］
为 13600，即 1 mol CPO可催化 13600 mol岩白菜素．
综上所述，本文制备的 CPO-DDAB /GC修饰电极上固定化的 CPO兼具有催化氧还原的电化学活性
和生物催化活性:利用修饰电极可催化还原 O2 产生 H2O2，在氯离子存在下可催化岩白菜素的氯化反
应，得到定位的氯化产物． 本方法 CPO用量少，成本低，催化效率高，反应的转化数达到 13600，且反
应操作更加简便．
1471No． 7 王 珂等: 氯过氧化物酶修饰电极用于岩白菜素的电催化氯化
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Electrochemical Catalytic Chlorination of Bergenin by
Chloroperoxidase Modified Electrode
WANG Ke，WU Xia-Qin* ，LI Lin，TIAN Hai-Tao，LU Zhong-Qing
(College of Life and Environment Science，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China)
Abstract A chloroperoxidase(CPO)modified electrode was fabricated by drop-coating the mixture solution of
CPO and didodecyldimethylammonium bromide(DDAB)onto the glassy carbon electrode surface． Direct
electron transfer of immobilized CPO was observed from cyclic voltammogram． The CPO modified electrode was
further used as the working electrode for electrocatalytic chlorination of bergenin in O2-saturated bergenin solu-
tion containing potassium chloride． The chlorinated product was confirmed by HPLC-MS． The total turnover
number(TTN)of the reaction is estimated to be 13600．
Keywords Chloroperoxidase;Modified electrode; Bergenin; Biocatalysis; Electrochemical catalysis;
Chlorination ( Ed． : S，Z，M)
2471 高 等 学 校 化 学 学 报 Vol． 34