全 文 ：构建重组乳酸乳球菌生产谷胱甘肽
傅瑞燕，陈 坚，李 寅!
（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江南大学生物工程学院，无锡 !"#$%&）
摘 要：以大肠杆菌染色体 ’()为模板，分别扩增得到编码!*谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的基因
!"#$和 !"#%。将 !"#$ 和 !"#% 基因克隆到质粒 +(,-"#- 中，电转化乳酸乳球菌 (,.$$$，获得重组菌 (,.$$$
（+(,%!$%）。在添加 "$ //01 2 3谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的 4"5培养基中培养该重组菌，当 &’&$$达到 $6#时用乳
酸链球菌素诱导 # 7，胞内谷胱甘肽含量达到 %8- 9/01 2 /:蛋白（胞内浓度相当于 "#$ //01 2 3），这是在革兰氏阳性菌
中生产谷胱甘肽的首例报道。
关键词：乳酸乳球菌；谷胱甘肽；半胱氨酸；!*谷氨酰半胱氨酸合成酶；谷胱甘肽合成酶
中图分类号：;5-# 文献标识码：) 文章编号："&5!*%&5-（!$$#）$!*$$%$*$&
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RAPMJ@9J6
5/1 6#"$4：0-)1.).))2" /-)1,"；:1?MBM7@09J；RAPMJ@9J；!*:1?MB/A1RARMJ@9J PA9M7JMBPJ；:1?MBM7@09J PA9M7JMBPJ
谷胱甘肽 :1?MBM7@09J（ZSD）是生物体内最主要
的非蛋白巯基化合物，主要用于保持胞内氧化还原
状态，并保护细胞免受氧胁迫伤害［"］。ZSD的生物
合成经历两个由 )X[参与的步骤［!］：3*谷氨酸和 3*
半胱氨酸在!*谷氨酰半胱氨酸合成酶（!*ZCS）的催
化下生成!*谷氨酰半胱氨酸（!*ZC），随后在谷胱甘
肽合成酶（ZS）的催化下，!*ZC 与甘氨酸缩合形成
ZSD。
在微生物中，ZSD主要存在于真核微生物和革
兰氏阴性细菌中。仅在少数低 ZC含量的革兰氏阳
性菌中发现 ZSD的存在，如链球菌属、乳球菌属、乳
杆菌属、肠球菌属、梭菌属和李斯特菌属［%*8］。分析
已公布的革兰氏阳性菌的基因组序列，未发现（或未
同时发现）编码!*ZCS 和 ZS 的基因 !"#$ 和 !"#%。
! 收稿日期：!$$#*$%*"!
基金项目：国家自然科学基金项目（%$%$$$$.）
作者简介：傅瑞燕（".5&*），女，博士研究生，研究方向：工业微生物生理学。
联系人：李 寅，E*/B@1：A@91@\ PAM?] JO?] R9，XJ1：$8"$ ^ 8--85!5，4BA !$$#
·%$·
生 物 加 工 过 程
C7@9JPJ F0?L9B1 0N Q@0+L0RJPP E9:@9JJL@9:
第 !卷第 !期
!$$#年 8月
万方数据
因此，革兰氏阳性菌中存在的 !"#很可能是从胞外
吸收而不是自身合成的。
作者在前期研究中已发现乳酸乳球菌不能合成
!"#，但可以从培养基中吸收 !"#［$］。采用乳酸乳
球菌乳脂亚种（ ! % "#$%&’ &&’% $()*+(&’）"())为研究对
象，作者发现被 "()) 菌株吸收到胞内的 !"#能够
提高细胞抵抗氧协迫的能力。因此，作者希望利用
代谢工程手段，将 !"#的生物合成能力导入乳酸乳
球菌，使其能够生产 !"#，进而评价工程菌对氧胁迫
的抵抗能力。本文报道构建重组乳酸乳球菌生产
!"#的研究结果。
! 材料与方法
)%) 试剂
!"#、!*!+、,-.和所有的氨基酸购自 "/012 公
司。3454674146/1258（1997）购自 +2:6/4;<81公司。
)%= 细菌菌株、质粒和培养基
用作染色体 >?,模板的 , % $+"& -!)在 @9培养
基中 ABC振荡培养 )$ <。乳酸乳球菌（! % "#$%&’ &&’%
$()*+(&’）?DEFFF在化学合成培养基（+>3）［$］或补充
G 0 H @葡萄糖的 3)B 培养基中 AFC无氧培养 )$ <。
根据实验需要，在培养基中加入氯霉素（)F"0 H 1@）
作为选择标记。利用乳酸链球菌素控制的表达系统
（?I+J）分析基因过量表达的效应［B］。待重组乳酸
乳球菌生长至光密度 -.$FF约为 F%K时，将培养物分
成两半，其中的一半加入 = 50 H 1@的乳酸链球菌素，
两部分培养物在相同条件下再培养 K <到 L <，以到
达稳定生长期，然后分析 !"#产量和相关酶活。
)%A 方法
)%A%) >?,操作
, % $+"& 染色体 >?,提取和常规的重组 >?,技
术按文献［L］进行。乳酸乳球菌的转化按文献［E］进
行。
)%A%= 菌株和质粒的构建
以 , % $+"& -!)染色体 >?,为模板用 /0+ 聚合
酶扩增 1’23 基因，G’端引物如下：G’*! , ! ! + + ,
- ! ! + , , - + + + ! ! , + ! - , - + , + , ! !
+ ! +*A’，A’端引物如下：G’*- - + - - + - , ! , - +
, ! ! + ! - ! - - - - - + + , ! + + , + , +*A’。
将引入 4$+I和 56#I位点识别序列（下划线）的长度
为 )GBK 6’的 .+M产物，克隆入 ’?DL)KL 相对应的
多克隆位点，得到 1’23 过量表达质粒 ’?DA=F)。
, % $+"& -!)染色体 >?,为模板用 /0+ 聚合酶
扩增 1’27 基因，G’端引物如下：G’*- - ! ! - + - ,
!!!!!
! , ! ! , ! , , ! , , - , , - ! , - + , , ! + -
+ !*A’，A’端引物如下：G’*, , ! ! , , ! + - - - -
, + - ! + - ! + - ! - , , , + ! - ! + - - +*A’。
将引入 56#I和 8&9:III位点识别序列（下划线）的长
度为 EL= 6’ 的 .+M产物（其基因上游含有 ">序列
（双线条）），分别克隆入 ’?DL)KL和 ’?DA=F)相对应
的多克隆位点，得到 1’27 过量表达质粒 ’?DA=F=和
1’23、1’27 双基因过量表达质粒 ’?DA=FA。
用电 转 化 法 将 质 粒 ’?DA=F)、’?DA=F= 或
’?DA=FA导入乳酸乳球菌。随后，用 #.@+测定重组
菌的硫醇产生能力。
)%A%A 无细胞提取物的制备和蛋白质分析
从 GF 1@ 培养液中离心收集乳酸乳球菌细胞
（)F FFF 0，)F 1/5，K C），用冰冷的生理盐水洗涤两
次，重悬于 ) 1@ =FF 114: H @的含有 = 114: H @ J>-,
的磷酸盐缓冲液（’# B%F）中。将 ) 1@ 细胞悬浮液
转入装有 ) 0 石英砂的小管中，K C下，用 N2&O.78’
>?,提取仪（N.)=F，"2P25O，?Q）破壁 AF &，随即离心
去除细胞碎片，得到无细胞提取物。
蛋白质浓度用 9+,蛋白质测定试剂盒测定，小
牛血清白蛋白作为标准品。
)%A%K 硫醇（!"#、!*!+和半胱氨酸）测定
参见文献［$］。
)%A%G 酶活测定
!*!+" 酶活用改进的 R2;S&45［)F］方法测定。反
应混合液总体积为 GFF"@，其中含有 AF 114: @*谷氨
酸、AF 114: @*半胱氨酸、AF 114: ,-.、=F 114: 30*
"TK·B#=T、=FF 114: (+:、=FF 114: 盐酸乙醇胺缓冲
液（’# E%)G）和无细胞提取液。在 ABC 下温育 )G
1/5。加入 L=G"@冰冷的 A%=U 磺基水杨酸终止反
应。离心去除蛋白沉淀后，EF"@ 样品上清液和对
照即可按照［$］测定胞内!*!+含量。
!"酶活根据 !V&反应混合液包含 G%F 114:!*!+、)F 114: 甘氨酸、)F
114: ,-.、)F 114: 30+:=、)FF 114: -7/&*#+: 缓冲液
（’# B%G）和无细胞提取物，ABC下反应 )G 1/5。加
入 GFF"@ 冰冷的 A%=U 磺基水杨酸以终止反应。
离心去除蛋白沉淀后，EF"@ 样品上清液和对照按
照［$］测定胞内!*!+含量。
在上述两种测定方法中，除了磺基水杨酸是在
加无细胞提取物之前加入外，对照组成与反应混合
=FFK年 G月 傅瑞燕等：构建重组乳酸乳球菌生产谷胱甘肽 ·A)·
万方数据
液相同。一个酶活单位定义为每 !"蛋白每 !#$催
化生成 % $!&’的!()*或 )+,所需的酶量。
! 结果
-.% */0中 )+,的生产
因为大部分革兰氏阳性菌中不存在 )+,［1］，并
且在现有的革兰氏阳性菌基因组序列中几乎没有
!"#$ 和 !"#% 基 因（ 2334：5 5 666. "7$&!7. 89. :4 5
;7"" 5）。因此扩增 & . ’()* 中的 !"#$ 和 !"#% 基因并
克隆入质粒 4<=>%?> 中，电转化乳酸乳球菌
<=@AAA。如图 % 所示，经乳酸链球菌素诱导后，在
<=@AAA（4<=1-A%）菌株中产生大量的!()*，而在
<=@AAA（4<=1-A1）菌株中产生了少量的 )+,。在
<=@AAA（4<=1-A%）和 <=@AAA（4<=1-A-）菌株的无细
胞提取物中检测不到 )+,，表明乳酸乳球菌 <=@AAA
中不存在!()*+和 )+。
图 % 生长在 */0（未标出）或 0%B培养基（图中标出）中含有不同质粒的乳酸乳球菌 <=@AAA胞内硫醇含量
C#".% D$3E8F7’’G’8E 32#&’ F&$37$3 &H + . ),’-*" <=@AAA 28EI&E#$" 9#HH7E7$3 4’8J!#9J "E&6$ #$ */0（$&3 #$9#F8379）&E 0%B IE&32（#$9#F8379 #$
327 H#"GE7）. *7’’J 67E7 28EK7J379 8H37E #$9GF79 IL - $" 5 !M $#J#$ H&E ? 2.
为了评价!()*+ 和 )+的表达水平，将含有质
粒 4<=>%?>（作 为 对 照）、4<=1-A%、4<=1-A- 和
4<=1-A1的乳酸乳球菌 <=@AAA 在乳酸链球菌素诱
导的条件下生长，制备培养物的无细胞提取物后，用
+/+(NO)P 分析（图 -）。
在乳酸链球菌素存在的情况下生长，<=@AAA
（4<=1-A%）菌株和 <=@AAA（4<=1-A1）菌株胞内产生
了一条分子量明显约为 Q>(;/8的蛋白带，这与 !"#$
预期大小相符；此外，<=@AAA（4<=1-A-）和 <=@AAA
（4<=1-A1）菌株胞内产生了额外的一条分子量明显
约为 1R(;/8 的蛋白带，这与 !"#% 预期大小相符。
!"#$基因的强烈表达导致了 <=@AAA（4<=1-A%）菌
株胞内产生了超高水平的!()*（图 %），而 !"#$ 和
!"#% 在 <=@AAA（4<=1-A1）菌株中的表达导致了 )+,
的产生。值得注意的是，<=@AAA（4<=1-A1）菌株胞
内的!()*含量只有 <=@AAA（4<=1-A%）菌株的一半，
且 <=@AAA（4<=1-A1）菌株中 )+,含量很低（图 %）。
这可能是因为 <=@AAA（4<=1-A1）菌株中 !"#$ 和
!"#% 的共表达水平与单独表达水平相比，要相对低
一些（图 -）。另外，<=@AAA（4<=1-A-）菌株中 !"#%
表达水平显著比 <=@AAA（4<=1-A%）菌株中 !"#$ 低，
表明在基因上游插入一个额外的序列降低了转录效
率。
-.- 提高乳酸乳球菌乳脂亚种 <=@AAA（4<=1-A1）
菌株的 )+,产量
<=@AAA（4<=1-A1）菌株胞内 )+,产量低，可能
归因于 */0所提供的营养物质贫乏。由于 <=@AAA
菌株不能从 0%B培养基中吸收 )+,，故作者用 0%B
·1-· 生物加工过程 第 -卷第 -期
万方数据
图 ! 含有不同质粒的乳酸乳球菌 "#$%%% &’&()*+,图谱
-./0! 1223455.6 7896(5:4.;6< /68 4=:6> &’&()*+, 2= 1-, 2= ! 0
"#$%&’"#$%%% ?4>72>.;/ @"#ABCA（84;6 !），@"#D!%B（84;6
D），@"#D!%!（84;6 C），@"#D!%D（84;6 E 4;< F）/>2G; .;
1’H .; :?6 @>656;I6 2= ;.5.;（84;6 !，D，C 4;< E）4;< .;
:?6 4756;I6 2= ;.5.;（84;6 F）0 J4;6 B I2;:4.;6< 4 56: 2=
@>2:6.; 5:4;<4><5 G.:? 3286I984> 345565（.; K’4）.;<.I4:6<
2; :?6 86=:0 *<<.:.2;48 74;<5 >6598:.;/ =>23 ;.5.; .;<9I:.2;
4;< >6@>656;:.;/!(+1& @>2:6.;（84;6 D 4;< E）4;< +& @>2(
:6.;（84;6 C 4;< E）4>6 .;<.I4:6<0
培养基替换 1’H去评价 "#$%%%（@"#D!%D）菌株产
生 +&L的能力。加入乳酸链球菌素诱导，在 HBM培
养基中生长与 1’H相比，+&L产量提高近 A 倍（图
B），表明营养物组成能大大影响 +&L的产量。
表 B 添加氨基酸混合液对于乳酸乳球菌 "#$%%%（@"#D!%D）
硫醇生产的影响
N4786 B ,==6I: 2= 4<<.:.2; 2= 43.;2 4I.<5 3.O:9>6 2; :?6 @>2<9I:.2;
2= :?.28 7P ! 0 "#$%&’ "#$%%%（@"#D!%D）0 4
12;I6;:>4:.2;
（3328 Q J）7
R;:>4I688984> :?.28 I2;:6;:（;328 Q 3/ @>2:6.;）
1P5:6.;6 !(+1 +&L +&L Q!(+1
% $ S ! CF S M CM S E B
%0E DD S C DC S E MB S $ !
E $E S C BE S C !$C S !E !%
B% B!B S BE D S B DEA S BM B!%
4 16885 G6>6 />2G; .; HBM 7>2:? 4;< ?4>T65:6< 4=:6> .;<9I6< 7P ! ;/ Q 3J
=2> F ?0
7 * I2;I6;:>4:6<，=>65? @>6@4>6< 3.O:9>6 I2;:4.;.;/ /89:434:6，IP5:6.;6，
4;< /8PI.;6（!%% 3328 Q J 2= 64I?）G45 =.8:6>(5:6>.8.U6< 4;< 4<<6< :2 :?6
I98:9>6 :2/6:?6> G.:? ! ;/ Q 3J ;.5.; G?6; 4; ()F%% 2= %0C G45 4I?.6T6<0
引人注目的是，在 1’H 中的培养物胞内 +&L
与!(+1的摩尔比为 B V$，而在 HBM培养基中生长细
胞内 +&L与!(+1的摩尔比降至近 B VB（图 B）。从先
前的研究中知道，* 0 $+"& 培养基中添加三种 +&L前
体氨基酸，即 J(谷氨酸（+89），J(半胱氨酸（1P5）和
甘氨酸（+8P）能提高 +&L产量［B!］。因而，作者试验
了在乳酸乳球菌 "#$%%%（@"#ABCA）菌株培养基中，
添加 E 3328 Q J和 B% 3328 Q J的上述三种前体氨基
酸，与未添加氨基酸的对照组相比，+&L产量分别提
高了 F倍和 A倍（表 B）。更重要的是，随着氨基酸混
合液浓度的增加，+&L和!(+1 的比率也相应增加。
当添加 B% 3328 Q J 氨基酸混合液时，得到了一个极
高的比率 B!% VB（表 B），表明前体氨基酸的添加明显
刺激了!(+1 转化成 +&L。
为研究究竟是哪种氨基酸对于 +&L的大量产
生起主要作用，将不同氨基酸 +89、1P5和 +8P（每种
添加量为 E 3328 Q J）加入到培养基中。图 D表明，加
入氨基酸混合液使得 +&L产量增加应完全归因于
半胱氨酸。对 "#$%%%（@"#D!%D）菌株中!(+1& 和
+& 酶活的分析发现，当培养基中添加 E 3328 Q J和
B% 3328 Q J半胱氨酸后，+&酶活大约提高了 C倍和 E
倍。半胱氨酸的添加导致 +& 酶活提高，这可以解
释为什么添加半胱氨酸会将更多的!(+1 转变成
+&L，但是半胱氨酸提高 +&酶活的机制还不清楚。
! 讨论
乳酸乳球菌对于代谢工程研究来说，是一个极
好的原核细胞宿主［BD］。+&L生物合成相对较简单，
但在乳酸乳球菌中不存在。在本研究中，作者利用
"R1,系统，通过过量表达来源于 * 0 $+"& 的 ,’-. 和
,’-/ 基因，将 +&L的生物合成能力引入乳酸乳球菌
乳脂亚种 "#$%%%。大量产生一种“全新”化合物的
能力，扩展了乳酸乳球菌作为细胞工厂的应用范围。
克隆来源于 * 0 $+"& 的 ,’-. 和 ,’-/ 基因并不具
新意，但从未有人在革兰氏阳性菌中同时表达过两
种基因。大约在二十年前，,’-. 和 ,’-/ 基因分别被
克隆［BC，BE］、测序［BF，BM］。虽然含有 ,’-. 和 ,’-/ 基因
的质粒 @+&E%%被导入 * 0 $+"& W1$B!后，导致!(+1&
酶活（B% 倍）和 +& 酶活同时增加（BC0E 倍），但
* 0 $+"& W1$B!（@+&E%%）中 +&L产量与野生型相比只
提高了 B0D倍［BA］。主要归因于* 0 $+"&中!(+1& 的酶
活特异地受 +&L的抑制，因为达到 E%X抑制所需的
+&L浓度（!0E 3328 Q J），与* 0 $+"&Y稳定生长期细胞
胞内 +&L含量相当［BA，B$］。
添加 B% 3328 Q J 半胱氨酸后，乳酸乳球菌
"#$%%%（@"#D!%D）菌株中!(+1& 和 +& 的酶活与
* 0 $+"& N+B细胞相比，增加了 $倍和 D倍（表 !），表
明乳酸乳球菌中以上两种基因均过量表达。然而，
与* 0 $+"& W1$B!（@+&E%%）胞内酶活相比［BA］，乳酸乳
球菌 "#$%%%（@"#D!%D）中!(+1& 和 +&的酶活并不
特别高：!(+1& 的酶活为 !0M 倍，而 +& 酶活只有
* 0 $+"& W1$B!（@+&E%%）的五分之一。尽管如此，乳
!%%C年 E月 傅瑞燕等：构建重组乳酸乳球菌生产谷胱甘肽 ·DD·
万方数据
酸乳球菌 !"#$$$（%!"&’$&）胞内的 ()* 含量 &+,
-./0 1 .2蛋白（约为 34$ ../0 1 5）（表 3），约为! 6 "#$%
78#3’（ %()+$$）［3,］的 ’$ 倍和酿酒酵母 9!!’:
（%();3’$<）［’$］的 & 倍。乳 酸 乳 球 菌 !"#$$$
（%!"&’$&）菌株胞内出乎意料的 ()*高浓度表明：
（3）在乳酸乳球菌胞内没有谷氨酰转肽酶存在，而在
! 6 "#$%和 &’""(’)#*+",- ",),.%-%’, 中这种酶会降解
()*；（’）乳酸乳球菌 !"#$$$（%!"&’$&）菌株中不存
在 ()* 对 于 !=(8) 的 反 馈 抑 制 作 用，因 为
34$ ../0 1 5 的 ()*浓度明显高于反馈抑制所需的
正常浓度。
图 & 谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸不同组合添加对菌株 !"#$$$（%!"&’$&）胞内硫醇含量的影响
>?26 & <@@ABC /@ D?@@AEA-C B/.F?-GC?/- /@ 20HCG.GCA，BIJCA?-A，G-D 20IB?-A（+ ../0 1 5 /@ AGBK）/- CKA %E/DHBC?/- /@ CK?/0 FI / 6 $’"0%-
!"#$$$（%!"&’$&）6
表 ’ 生长在补充不同浓度半胱氨酸的 L3:培养基中的乳
酸乳球菌 !"#$$$（%!"&’$&）胞内!=谷氨酰半胱氨酸合
成酶和谷胱甘肽合成酶的酶活
MGF0A ’ NBC?O?C?AJ /@!=(8) G-D () ?- / 6 $’"0%- JJ%6 "),*#)%-
!"#$$$（%!"&’$&）2E/P- ?- L3: FE/CK JH%%0A.A-CAD
P?CK D?@@AEA-C B/-BA-CEGC?/-J /@ BIJCA?-A6 G
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（../0 1 5）
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$6+ 3’+ R 3, &6: R $6:
+ 33: R 3+ #6S R 36#
3$ 334 R , 3’ R ’
! 6 "#$% M(3F 33 R 3 &6$ R $6+
G 8A00J PAEA 2E/P- ?- L3: FE/CK G-D KGEOAJCAD G@CAE ?-DHBAD FI ’
-2 1 .0 @/E S K6
F ! 6 "#$% M(3 PGJ @EAJK0I ?-/BH0GCAD ?-C/ M9T G-D BH0C?OGCAD H-=
C?0 JCGC?/-GEI %KGJA PGJ GBK?AOAD6
总的来说，重组乳酸乳球菌 !"#$$$（%!"&’$&）
能产生大量 ()*的结果具有工业应用价值。此外，
乳酸乳球菌所具有的引入全新合成途径来产生某种
高浓度代谢产物的能力，再一次展现出其作为超级
细胞加工厂所具有的巨大潜力。
致谢：
本文部分工作在荷兰 UG2A-?-2A- 8A-CEA @/E >//D
)B?A-BA 完成。感谢 VE6 WAE/A- *H2A-K/0CQ，VE6V/HPA
L/0A-GGE，VE6U?0FAEC )IFAJ.G 参与本项研究，并感谢
LE6 WG- OG- 7?A0在 *X58分析中所提供的帮助。
参考文献：
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·&4· 生物加工过程 第 ’卷第 ’期
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QGGS年 !月 傅瑞燕等：构建重组乳酸乳球菌生产谷胱甘肽 ·R!·
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