全 文 ：＊北京市自然科学基金资助(No.7952012)
中国医学学科学院基础所卢圣栋教授 ,北京红十字朝阳医院张鹏 ,肖白 ,周艳 ,李氢元 ,梁燕参加部分设计或实验。
1　现在中国科学院微生物所微生物分子遗传室 ,北京 100080。
收稿日期:1997-08-19 ,修回日期:1997-12-22
欧芹苯丙氨酸脱氨酶 cDNA 在乳酸乳球菌中的表达研究＊
向　华1 　刘敬忠　胡　维　祝　锦　朱章菱
(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院　北京　100020)
摘　要　将欧芹(Petroselinum crispum)苯丙氨酸脱氨酶(PAL)cDNA 亚克隆到组成型表达载
体 pMG36e启动子 P32 下游 ,电穿孔法转化乳酸乳球菌 ,获得有 PAL表达活性的乳酸乳球菌
工程菌(pMG36ePAL/ L.lactis MG1363)。通过递归 PCR合成了一段 120bp 的调控片段 , 用
以将 pMG36e改造为分泌型表达载体 pXHS , 以翻译偶联的方式表达 PAL ,可使 PAL的 N 末
端带上 usp45 信号肽 ,结果亦检测到 PAL 酶活性。自行分离克隆了乳酸乳球菌热休克蛋白
基因 dnaJ 的启动子区域 , 构建了热诱导表达载体 pXHJ ,获得 PAL 热诱导表达工程菌(pXHJ-
PAL/ L.lactis IL1403),经 30℃至 37℃热诱导 ,可使 PAL 表达活性提高至 2 倍。本文还就乳
酸乳球菌 PAL工程菌在经典型苯丙酮尿症防治中的应用进行了分析和讨论。
关键词　苯丙氨酸脱氨酶基因 ,乳酸乳球菌 , 基因表达 ,苯丙酮尿症
分类号　Q785　文献标识码 A　文章编号　0001-6209(1999)03-0196-04
　　乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是能在人小肠中短暂生活 ,对人体有益无害的食品级
微生物[ 1] 。本课题组在国际上首次提出以下治疗经典开型苯丙酮尿症(PKU)的新途径:
采用分子克隆技术 ,构建以乳酸菌为宿主菌的能表达苯丙氨酸脱氨酶(PAL)的工程菌 ,令
其在 PK U患者小肠内发挥 PAL 酶活性使尚未被吸收的苯丙氨酸(Phe)脱氨变成对人体
无毒副作用的肉桂酸(Cin),从而使患者在基本不限制饮食的情况下 ,通过控制 Phe 的摄
入而达到防治经典型 PKU发生的目的 。该途径一方面有可能使 PKU 患儿进食天然食
品的愿望得以实现 ,另一方面有可能解决 PKU孕妇胎儿的安全问题 。
本研究主要进行了 PAL 在乳酸乳球菌中克隆表达的基础性工作 ,首次构建了欧芹
PAL cDNA在乳酸乳球菌中的组成型 、分泌型及热诱导型三种重组表达质粒 ,并用电穿孔
技术转化乳酸乳球菌 ,均筛选到能表达活性 PAL 的工程菌 。为经典型 PKU 治疗新途径
的研究奠定了基础 ,具有理论意义和临床应用前景 。
1　材料和方法
1.1　实验材料
1.1.1　质粒 、菌株和培养基:所用质粒和菌株见表 1。大肠杆菌采用 NZCYM 培养基
(Gibco BRL)培养;乳酸乳球菌用 M17培养基(Difco)培养。氨苄青霉素(Amp)用量为
39 卷　3期
1999 年 6 月
微 生 物 学 报
Acta Microbiologica Sinica
Vol.39
June
　No.3
1999
DOI :10.13343/j.cnki.wsxb.1999.03.002
60μg/mL;红霉素(Em)在大肠杆菌培养中用量为 200μg/mL ,在乳酸乳球菌培养中为
5μg/mL 。
1.1.　引物:引物序列见表 2。其中 Pr 和 P2 可用于鉴定 PAL 组成型表达质粒
pMG36ePAL 和分泌型表达质粒 pXHS-PAL;SP1 、SP2 、SP3和 SP4用于递归 PCR合成分
泌型表达载体的翻译偶联调控片段;PJ1 和 PJ2用于分离克隆 L .lactis danaJ启动子区
域;PJ1和 P2还可用于鉴定 PAL 热诱导表达质粒 pXHJ-PAL。T7启动子引物(记为 T7)
用于 DNA测序 。
1.1.3　主要工具酶类:内切酶 EcolCR I , EcoR I ,Hinc I I , Nde I , SnaBI ,Sac I , Xba I 等及
T4 DNA连接酶购自 Promega公司;Taq DNA聚合酶为中国科学院遗传研究所产品 。
表 1　质粒和菌株
Table 1　Strains and plasmids
质粒和菌株
St rain and plasmid
有关特点
relevant features
来源
Reference or source
L.lact is MG1363 Derived f rom L.lactis subsp lactis NCDO712 by plasmid curing [ 2]
L.lact is IL 1403 Derived f rom L.lactis subsp lactis IL594 by plasmid curing [ 3]
E.col i DH 5α [ 4]
pET23b Ampr;unique cloning sites:Nde I , BamH I , EcoR I , Sac I , etc. Novagen
pMG36e
　
Em r;expression vector wi th P32 promoter , multiple cloning site(MCS)
and prtP t ranslational terminator.
[ 5]
　
pET23b-J Ampr;sou rce of dnaJ promoter this work
pBSPAL Ampr;sou rce of PAL cDNA [ 6]
pET23bPAL Ampr;sou rce of PAL cDNA [ 6]
pMG36ePAL Em r;const itu tive expression of PAL in L.lact is this work
pXHS-PAL Em r;secretory expression of PAL in L.lact is this work
pXHJ-PAL Em r;heat inducible exp ression of PAL in L .lacti s this work
表 2　引物名称和序列
Table 2　Names and sequences of primers
引物名称
Primer name
引物序列(5′※3′)
Primer seqence(5′※3′)
Pr TCACAAAATGCTATACTAGGTAGG
P2 TTAACAGATTGGAAGAGGAGC
SP1 GTAAT TCGAGCTCAAGGAGGTATACAATGAAAAAAA
SP2 GGTATACAATGAAAAAAAAGAT TATCTCAGCTATTT TAATGTCTACAGTG
SP3 CACCTGACAACGGGGCTGCAGCAGAAAGTATCACTGTAGACATTAAAAT
SP4 GGATCCGTCGACCAGCGTAAACACCTGACAACGACGGG
PJ1 ACGGAATTCTGT TATTT TAGATGGG
PJ2 ATTCATATGTAAAT TACTCACT TCCT
T7 TAATACGACTCACTATAGGG
1.2　实验方法
1.2.1　三种 PAL 表达质粒的构建:目的基因欧芹 PAL cDNA 经 RT-PCR获得 ,已克隆
至 pBluescript及 pET23b进行测序和保存(表 1)。本研究构建的三种 PAL 表达质粒均以
pMG36e[ 5]为基础 ,可在 L .lactis和E .coli中复制和表达 。实验的基本程序是在 E .coli
中完成 PAL 表达质粒的重组和鉴定 ,然后用电穿孔技术转化乳酸乳球菌进行表达研究 。
酶切 、连接和转化 E.coli DH5α的方法按文献[ 7] 。各 PAL 表达质粒构建程序如下:
1973 期 向　华等:欧芹苯丙氨酸脱氨酶 cDNA 在乳酸乳球菌中的表达研究
组成型表达质粒 pMG36ePAL:PAL cDNA 由 pBSPAL 经 SnaB I 和 XbaI 切得
(2.2kb);载体 pMG36e 经 EcolCR I和 Xba I 切开。目的基因片段和载体片段按 3∶1混
合 , T4 DNA连接酶 14℃连接 18h ,常规方法转化氯化钙致敏的 E .coli DH5α感受态细
胞。然后筛查和鉴定阳性克隆 。
分泌型表达质粒 pXHS-PAL:递归 PCR(引物 SP1∶SP4∶SP2∶SP3=10∶10∶1∶1)合成
长120bp的翻译偶联调控片段(含信号肽序列等),并用 SacI 和 Hinc II 酶切;PAL cDNA
仍由 pBSPAL 经 SnaB I和 Xba I切得;载体 pMG36e 经Sac I和 Xba I 切开 。PAL cDNA
酶切片段 、调控序列酶切片段和载体酶切片段按 3∶2∶1于 14℃连接 18h 。
热诱导型表达质粒 pXHJ-PAL:①热诱导启动子部分:制备乳酸乳球菌(L .lactis
IL1403)基因组 DNA ,采用 PCR(引物 PJ1和 PJ2)方法扩增 dna J启动子区域 ,将 PCR产
物克隆至载体 pET23b获得 dna J启动子克隆质粒 pET23b-J ,用 T7 启动子引物测序鉴
定 ,正确质粒用 Nde I 和 EcoR I 酶切得热诱导启动子部分(约 260bp)。②载体基本部分:
pMG36e经 EcoR I和 Sal I酶切去除其原启动子区域后获得。③目的基因 PAL cDNA部
分:pET23bTAL 经 Nde I 和Sal I切得(约 2.2kb)。 ④以上三部分按 2∶1∶3混合于 16℃
连接 16h。
1.2.2　PAL 重组表达质粒的筛查和鉴定(宿主 E .coli):①质粒大小比较法:小量制备质
粒 DNA 电泳[ 7] ,可判断有无插入片段。 ②菌落 PCR鉴定法[ 8] :PCR引物分别位于载体
启动子部位(Pr 或 PJ1)和插入片段 PAL cDNA 3′端(P2)。可判断插入片段是否为 PAL
及方向正确与否 。③PAL 酶活性检测法:取 20μL 菌液加 1.5μL85%磷酸酸化 , 3×200μL
乙酸乙酯抽提 ,真空挥发溶剂 , 100μL 甲醇溶解 , 20μL 用于 HPLC 分析 。流动相分为 A
相(5%乙酸)和 B 相(20%乙酸 +25%乙腈), AB 相由双泵按 1∶19 自动混合 ,流速为
1mL/min ,层析柱为 0.46×25cm 的 C18柱 ,检测波长为 290nm 。根据有无特异的 PAL
催化反应产物肉桂酸可判断重组质粒有无 PAL 表达活性。
1.2.3　重组 PAL表达质粒电穿孔法转化乳酸乳球菌:乳酸乳球菌电穿孔转化用细胞的
制备及转基因方法根据文献[ 9]改进:从具有 PAL 活性的大肠杆菌中常规方法提取重组
质粒 ,PEG 纯化 ,使 OD 260/OD 280达 1.8水平 ,取 250ng 质粒 DNA 与 80μL 乳酸乳球菌混
合 ,利用 Bio-Rad Gene Pulsor 电穿孔法将重组质粒转入乳酸乳球菌中 ,脉冲参数为
1.25kV/mm , 25μF 和 200Ψ, 恢复培养基用 SGM17MC[ 9](含 Em50ng/mL , Phe 250μg/
mL),铺平板固体培养基用 SGM 17+agar[ 9](含 Em 5μg/mL , Phe 250μg/mL), 30℃厌氧
培养 2 ～ 3d。
1.2.4　乳酸乳球菌工程菌 PAL 表达分析:①SDS-PAGE观察 PAL 表达:收集对数晚期
的乳酸乳球菌工程菌 , 按文献[ 7]方法进行 SDS-PAGE 分析 。②活菌 PAL 表达活性实
验:单菌落接种于GM17培养基[ 9](加phe至 2.5mg/mL ,加红霉素至5μg/mL),30℃培养
过夜。过夜培养物用相同培养基 1∶100稀释后继续培养 ,每 6h 一次取菌液 20μL ,HPLC
法测产物肉桂酸含量 ,研究 24h内 ,培养基中肉桂酸含量进行性增长情况 ,分析活菌 PAL
酶活性。设含空载体的乳酸乳球菌作对照。热诱导表达株经 30℃至 37℃热诱导 ,分析热
诱导表达效率。
198 微　　生　　物　　学　　报 39 卷
2　结果和分析
2.1　分泌型表达载体调控片段的递归 PCR合成
图1为递归PCR示意图及 PCR产物电泳结果 ,结果表明:递归 PCR合成的调控片段
与预期大小(120bp)相符合(图 1B)。图 2示该调控序片段的序列结构 ,有如下特征:两端
含有合适的酶切位点 Sac I和 Hinc II;含有一个新的 SD序列和一个 ATGA(起始编码和
终止密码相重叠)的翻译偶联序列[ 10] ;含有一个乳酸乳球菌分泌蛋白 usp45的信号肽序
列[ 11] 。可通过翻译偶联的方式使 PAL 的 N 末端带上 usp45信号肽 ,实现分泌表达 。含
有信号肽的翻译偶联调控片段的合成 ,为构建 PAL 分泌型表达质粒奠定了基础。
图 1　递归 PCR合成的分泌型载体 pXHS 翻译偶联调控片段(120bp)
A.示意图　　　　　　B.电泳结果
Fig.1　The DNA fregment(120bp)synthesized by progressive PCR used for
t ranslational coupling expression in secretory vector pXHS
A.Schema　　　　　　B.Electrophoresis results
图 2　分泌型载体 pXHS 翻译偶联调控片段各元件组成
　　浪线示酶切位点 Sac I 和 Hinc II ,双底线示 SD序列 ,单底线示信号肽起始密码 ATG , [ TGA] 为载体小肽的终
止密码 ,载体小肽密码子用数字标出 ,信号肽氨基酸序列用单字母缩写形式表示。
Fig.2　Nucleotide sequences of the translational coupling regulation fragment in secretory vector pXHS
　　The restriction enzyme recognition sites(Sac I and Hinc II)are indicated with wave lines;Shine-Dalgarno(SD)se-
quences are doubly underlined;underlined ATG , t ranslational start codon of the signal peptide;[ TGA] , t ranslational stop
codon of the vector peptide;the codon numbers of vector peptide are shown above the nucleotide sequences;the amino acids
of signal peptide are shown w ith one-letter codes under the nucleotide sequences.
1993 期 向　华等:欧芹苯丙氨酸脱氨酶 cDNA 在乳酸乳球菌中的表达研究
2.2　L.lact is IL 1403基因组 DNA制备及 dnaJ启动子区域的分离和克隆
L .lactis I L 1403基因组 DNA及 dnaJ启动子区域 PCR扩增产物电泳结果(267bp)
如图 3示。图 4为该 PCR产物(dnaJ启动子)的克隆质粒 pET23b-J的测序及分析结果 ,
与文献[ 12]报道的 dnaJ启动子区域相比存在一个碱基G※A 差异(图中 79位)。
dnaJ启动子区域的分离和克隆 ,为构建 PAL 热诱导表达质粒准备了条件 。
图 3　L.lactis IL 1403 基因组 DNA及 dnaJ 启动子区域 PCR扩增产物
A.IL1403基因组 DNA　　　　B.dnaJ启动子区域 PCR片段
Fig.3　L.lact is IL 1403 genomic DNA and the PCR product of its dnaJ promoter region
A.IL 1403 genomic DNA　　B.PCR product of dnaJ promoter region
图 4　pET23b-J dnaJ 启动子区域测序结果及调控元件分析(测序引物:T7)
　　浪线示两侧的酶切位点;小写字母示逆向重复调控序列(IR);单底线示-35及-10 区域;双底线
示 SD序列;ATG(S tart)为翻译起点 ,该处已引入一个单一酶切位点 Nde I ,可用以表达天然蛋白;图
中 79位多态碱基“A”(文献[ 12] 中为G)用方框标出)。
Fig.4　Sequencing results of the dnaJ promoter region of pET23b-J and
the deduced regulation elements(sequencing primer:T7 in Table 2)
　　The restriction enzyme recogni tion sites are indicated w ith wave lines;The small letters show the in-
verted repeat(IR);the -10 and -35 are underlined;the Shine-Dalgarno(SD)sequences are double-under-
lined;ATG(start), t ranslational start codon;the base“A”(79)dif fered from which in reference[ 12] is also
indicated.
200 微　　生　　物　　学　　报 39 卷
图 5　菌落 PCR法筛查各重组表达质粒的结果
A.组成型(引物 Pr/ P2), B.分泌型(引物 Pr和 P2),
C.热诱导型(引物 PJ1/ P2)
Fig.5　Direct PCR of bacterial colonies screening
for recombinant plasmids
A.Consti tutive expression type(primer:Pr/P2);
B.Secretory expression type(primer:Pr/ P2);
C.Heat inducible expression type(primer:PJ1/ P2).
2.3　重组 PAL表达质粒的筛查和鉴定
实验表明 ,所构建的 PAL 表达质粒在
DH5α中亦有 PAL 表达活性 ,工程菌 PAL
表达活性使质粒提取相对困难 ,因此“菌落
PCR筛查法”和“活菌 PAL 酶活性鉴定
法”因其简单有效而成为本研究筛查和鉴
定 PAL表达质粒的主要手段 。
图5示菌落 PCR法筛查三种重组表
达质 粒的结 果。 组成 型表 达(质 粒
pMG36ePAL)工程菌菌落 PCR可获得特
异的 2.2kb 特异产物(图 5A ,引物 Pr 和
P2)。同样的 PCR引物 ,分泌型表达(质粒
pXHS-PAL)工程菌经菌落 PCR法扩增可
获得特异的 2.3kb 的 PCR产物(图 5B 中
3 、4),比“阳性对照”组成型工程菌(图 5B
中 1号)长约 0.1kb ,说明调控片段和 PAL
cDNA均已插入 。热诱导表达(质粒 pX-
HJ-PA L)工程菌菌落 PCR 可获得 2.4kb
的特异 PCR产物 ,图 5C 示部分克隆筛查
结果(引物为 PJ1和 P2)。
　　PCR鉴定正确的表达质粒在 DH5α中
均检测到 PAL 表达活性 。
2.4　乳酸乳球菌 PAL工程的 PAL酶活
性分析
三种 PA L 表达质粒电穿孔法转化乳
酸乳球菌的效率均在 1×103(转化子/μg
质粒)以上 ,所得乳酸乳球菌 PAL 工程菌
均检测到 PAL 酶活性。
PAL 组成型表达工程菌(pMG36ePAL/ L .lactis MG1363)表达产物经 SDS-PAGE分
析检测到特定的 PAL 蛋白条带(约 79.1kD),约占菌总蛋白量的 0.9%;分泌型工程菌可
能由于表达量低而未发现明显的 PAL 条带;热诱导型表达工程菌(pXHS-PAL/ L .lactis
IL1403)经 30℃※37℃热诱导 , PAL 表达量相对于其在 30℃有明显提高 ,并可达总蛋白
的 1%以上。
　　图 6为通过 HPLC检测培养基中肉桂酸生成的方法对工程菌 PAL 酶活性进行分析
的结果。其中图6A为肉桂酸标准(肉桂酸特异峰出现在 8.92 ～ 8.96min)。图6B示组成
型工程菌(pMG36ePA L/ L .lact is MG1363)单菌落液体培养过程中 ,培养基中肉桂酸产量
递增的 HPLC分析结果。分析表明 ,24h 内培养基中的 Phe除细菌本身生长利用外 ,可大
部分脱氨生成了肉桂酸(Phe 初始浓度约 2.5mg/mL , 至 24h 时肉桂酸终浓度可达
2013 期 向　华等:欧芹苯丙氨酸脱氨酶 cDNA 在乳酸乳球菌中的表达研究
图 6　乳酸乳球菌 PAL工程菌的 PAL酶活性分析
A.肉桂酸标准　B.组成型　C.分泌型　D.热诱导型
Fig.6　The PAL activity of L.lactis(PAL engineering bacteria)determined by HPLC
A.Cinnamic acid standard;　　B.Const itut ive expression type;
C.Secretory expression type;　　D.Heat inducible exp ression type.
1.8mg/mL),说明该工程菌具有较好的 PAL 活性 。图 6C示一个乳酸乳球菌分泌型工程
菌(pXHSPAL/ L .lactis MG1363)单菌落液体培养12h ,检测培养液中PAL 代谢产物肉桂
酸生成量的HPLC结果 ,检测灵敏度提高了5倍 ,表明其酶活性约为相同菌量的组成型表
达工程菌的 1/5 ,而空载体菌对照未检测到肉桂酸 。图 6D 示热诱导工程菌(pXHJ-PAL/
L .lactis IL 1403)相同菌量(过夜培养)在新鲜培养基中经 30℃和 37℃分别培养 2h后 ,
培养基中肉桂酸的 HPLC 分析结果 。2h后测菌液 OD 600表明 ,二者细菌浓度无明显差
异 ,说明肉桂酸产量的不同主要由 PAL 酶表达量差异引起 。37℃培养物中肉桂酸含量为
P1=137μg/mL ,30℃培养物中肉桂酸含量为 P2=78μg/mL ,热诱导前原培养液中残留的
肉桂酸含量 P0=24μg/mL ,热诱导效率约为 K=(137-24)/(78-24)≈2.1 ,即 37℃热诱
202 微　　生　　物　　学　　报 39 卷
导可使 PA L表达增加至 2倍以上 。
3.讨论
经典型 PKU是一种常见的氨基酸代谢异常遗传病 。致病根源是患者苯丙氨酸羟化
酶(PAH)基因突变 ,肝内缺乏有活性的 PAH ,Phe不能正常羟化为酪氨酸 ,导致 Phe 及其
有害代谢物在体内大量积累 ,严重损害患儿神经系统发育致使智力低下和呆傻。现行低
苯丙氨酸食物疗法需要严格限制天然蛋白摄取 ,价格昂贵且味道难吃 ,患儿难以接受和持
久。本研究首次提出了用乳酸乳球菌 PAL工程菌在小肠内代谢 Phe 以防治经典型 PKU
的基因治疗新途径 ,并首次实现了欧芹 PAL cDNA在乳酸乳球菌中的克隆和表达。
本研究首先成功地组建了 PAL cDNA 在乳酸乳球菌中的组成型表达工程菌
(pMG36ePAL/ L .lact is MG1363),载体 pMG36e含有来自乳酸乳球菌染色体的强启动子
P32 ,结果表明可有效启动 PAL 的表达 ,使工程菌活菌具有较好的 PAL酶活性 ,有望用于
PKU治疗。
鉴于 PAL 的表达对工程菌本身的生长有一定的抑制作用 ,还研究了 PA L 在乳酸乳
球菌中的分泌型和热诱导型表达。一方面 ,构建了分泌型表达载体 pXHS ,采用翻译偶联
的原理在 pMG36e 多克隆位点 Sac I 处插入一个人工合成的调控片段 ,该片段含有新的
SD序列 、ATGA 翻译偶联序列和来自 usp45的信号肽序列[ 11] 。用以表达 PAL 时 ,可通
过偶联翻译使 PAL 的 N末端带上从新开始的 usp45信号肽 ,实现分泌表达 ,结果检测到
PAL 酶活性;但由于表达量较低 ,PAL 是否分泌到胞外尚需进一步研究。另一方面 ,自行
分离克隆了乳酸乳球菌热休克蛋白 dna J基因启动子区域 ,并用以构建了乳酸乳球菌热
诱导型表达载体 pXHJ ,进而重组获得 PA L热诱导型表达工程菌 pXHJ-PAL/ L .lactis I L
1403 ,经 30℃※37℃热诱导可使其 PAL表达活性提高至 2倍以上 。 L .lactis dna J 基因
是由 Van Asseldonk等 1993年首先分离克隆的 ,其分析表明:dnaJ基因的热诱导表达受
转录水平调控 ,而启动子前的一个反向重复序列AAT TAGCACTCTTATAAAAAGAGT-
GCTAAT T 对于表达调控起决定作用 。当用一个不含启动子的 usp45-amyS 融合基因作
为报告系统时发现 37℃热诱导可使表达约增加至 2倍 , 42℃热诱导表达则增加至 3 ～ 4
倍[ 12] ,与本研究中 PAL 热诱导表达效率相似 。PAL 热诱导表达在一定程度上缓解了
30℃培养工程菌时 PAL 对工程菌本身的生长抑制 。而进一步研究其热诱导表达机制 ,并
用以改造表达载体 ,进而提高热诱导表达效率则是值得深入研究的课题。
　　具有 PAL 活性的食品级乳酸乳球菌工程菌的获得 ,为口服工程菌制剂治疗经典型
PKU提供了可能 ,并将提供一条与现行基因治疗方法完全不同的 PK U治疗新途径 ,因此
该方法经过进一步完善将具有重要理论意义和应用前景。
致谢　荷兰Groningen大学 Prof.G.Venema和 Dr.J.Kok 分别惠赠质粒 pMG36e 和菌株
L .lactis MG1363 、L .lactis IL 1403 ,在此表示感谢。
参考文献
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EXPRESSION IN LACTOCOCCUS LACTIS OF CATALYTICALLY
ACTIVE PHENYLANINE AMMONIA-LYASE FROM PARSLEY
Xiang Hua　Liu Jingzhong　Hu Wei　Zhu Jin　Zhu Zhangling
(Beij ing Red Cross Chaoyang Hospital , Beij ing 100020)
Abstract 　The phenylalanine ammonia-lyase (PAL) cDNA of parsley (Petroselinum
crispum)was subcloned into constitutive expression vecto r pMG36e downst ream of the P32
promo ter.The resulting plasmid pMG36ePAL was introduced into Lactococcus lactis subsp.
lact is MG1363 by electroporation.The recombinant st rain show ed its PAL activity convers-
ing the L-phenylalanine in the culture medium into t rans-cinnamic acid.A new secretory vec-
tor pXHS was constructed by recombination of pMG36e w ith a Lactococcal usp45 secretion
leader coding sequence and a translational coupling sequence.Then the pXHSPAL was con-
st ructed and used for expression of PAL in L .lact is , the PAL activity w as also detectable.
The L .lact is dnaJ promoter sequence w as cloned and used to const ruct a heat inducible vec-
tor pXHJ.PAL cDNA was cloned into pXHJ and the L .lact is IL1403 w as t ransformed w ith
the recombinant plasmid pXHJPAL.After a heat shock from 30℃ to 37℃, the PAL act ivity
of the pXHJPAL strain could increase approximately onefold.The prospect of using these en-
gineering L .lact is strains fo r PKU therapy w as also discussed.
Key words 　Pheny lalanine ammonia-ly ase(PAL), Gene expression , Lactococcus lactis ,
Phenylketonureu(PKU).
＊Project Granted by Beijing National Natural Science Fund(No.7952012)
204 微　　生　　物　　学　　报 39 卷