全 文 ：第6卷第4期
2008年7月
生物加工过程
ChineseJoumalofBioprocessEngineering
JuJy2008
·25·
添加表面活性剂改善丁醇萃取发酵性能
杨 影，张龙云，史仲平
(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，无锡214122)
摘要：研究了各种表面活性剂对丁醇萃取发酵的影响。丁醇发酵中有大量H：、CO：气体生成，生成的气泡携带发
酵溶剂产物(丁醇、丙酮)进入萃取液相，促进了水相中发酵毒性产物向萃取液相的移动。研究发现，表面活性剂可
以降低气一液膜的表面张力，促使大气泡破碎，从而使发酵产气以较小气泡的形式穿过萃取液相。添加表面活性荆
可以强化发酵溶剂产物从水相到萃取相的移除速度，缩短发酵产物在油水两相中达到平衡的时间，有利于提高发
酵生产强度。以地沟生物柴油为萃取剂，吐温一舳的添加量为质量分数O．140％时，与对照相比(无表面活性荆的
萃取发酵)，相同发酵时间内萃取相中丁醇体积分数提高了21．2％，总溶荆生产强度也提高了16．5％。
关键词：生物柴油；丁醇；萃取发酵；表面活性剂
中图分类号：。rQ923 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)04—0025一06
IIIlproVementOf xtractiVefe珊 ntationperfo珊anceofbutanolby
addingsurfactactsint0fe珊entationmedium
YANGYing，ZHANGLong-yun，SHIZhong-ping
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1【eywords：bio—die∞l；butaIlol；e】【岫虻tivefemlentation；sud如tant
收稿日期：2007JD9．10
基金项目：国家重点基础研究发展规划资助项目(200r7CB714304)
作者简介：杨影(198l一)，男，江西瑞金人，项士研究生．研究方向：生物化工。
联系人：吏仲平，教授，博士生导师，E—md：印shi@呻．edu．∞。
万方数据
· 26· 生物加工过程 第6卷第4期
丁醇发酵是利用偏性厌氧性Czos‘砌um种属的
有孢子细菌，在培养基中生产丙酮丁醇的发酵。丁
醇发酵的产物抑制水平非常强，特别是主代谢产物
丁醇。当发酵液中丁醇质量浓度超过5g／L时，发
酵就会受到很大的抑制⋯。许多研究者采用原位
萃取技术来提高发酵强度，并取得了很好的效
果[2】。但是，即便使用对发酵产物有很高萃取系数
的萃取剂进行萃取发酵，发酵溶剂在萃取剂中的浓
度依旧很低(一般不超过5％一6％)。所以，无论是
从发酵液还是从萃取剂中回收产品都需要大量能
量。丁醇发酵大量产气，主要是cO：和H：。这些气
体在细胞周围形成一层气膜，对丙丁梭菌的生长起
保护作用。机械搅拌虽然可以提高发酵产物在油
水两相间的传质，但却会破坏正常的发酵体系。因
此，使用丙丁梭菌的丁醇发酵一般均不使用机械
搅拌。
有报道表明，使用棕榈油甲酯(生物柴油的一
种)为萃取剂进行丁醇发酵，可以提高发酵强度旧J。
更为重要的是，直接使用萃取有丁醇的生物柴油既
可以省去回收发酵产物所需的蒸馏能耗、提高丁醇
发酵的经济性；又可以改善原有生物柴油的许多缺
点，如输出功率低、黑烟多等HJ，进而提高生物柴油
的质量和竞争力。因此，生物柴油．丁醇耦联萃取发
酵是一项非常值得深入探讨的技术。然而，国内外
对上述技术的系统性研究还非常有限。
前期的研究结果表明，各种生物柴油对丙丁梭
菌的生长均有毒性，使用生物柴油为萃取剂无法有
效地提高生物柴油一丁醇耦联萃取发酵的生产强
度【5J。丁醇萃取发酵中，发酵溶剂产物(丁醇、丙
酮)在油水两相间的传质推动力主要来源于发酵产
气，即携带有溶剂产物的气泡。本研究的主要目的
就是探讨表面活性剂在萃取发酵中对气体泡沫的
稳定性作用o7l，寻找加快发酵溶剂从水相到萃取相
移除速度，提高丁醇萃取发酵生产强度的有效途径。
l材料与方法
1．1 菌种
本实验室保藏的丙酮丁醇梭状芽孢杆菌(呶一
f，1磁Ⅱm∞咖6舭Mm)ATCC824，于质量分数5％的
玉米醪中培养成孢子液，4℃冰箱保存。
1．2培养基
活化、保藏菌种和发酵均采用玉米醪培养基，
市售黄玉米40目过筛后糊化60lIIin，冷却至室温。
菌种活化和保藏用的玉米醪质量分数为5％，pH自
然；发酵用玉米醪质量分数为6％～7％，pH调至
9．0左右¨J，121℃灭菌60min。当需要在培养基中
添加表面活性剂时，按比例把表面活性剂添加到调
节好pH的培养基中，121℃灭菌60min。
1．3主要试剂
萃取剂(生物柴油)为地沟生物柴油、菜籽生物
柴油和棕榈生物柴油，由无锡华宏生物燃料有限公
司馈赠，制备方法为化学合成法。各类表面活性剂
均购于广东省肇庆市超能实业有限公司。
1．4主要仪器
发酵溶剂分析用气相色谱仪为Gcll2A(配有
nD)，上海精密科学仪器有限公司生产。使用
N2000型色谱工作站(浙大智达信息有限公司)分
析数据，色谱柱为ALPHA-Col型PEG(聚乙二醇)毛
细管柱(澳大利亚SGEInt’lPt)，．Ltd．)。ACII-2E厌
氧培养箱(用于厌氧条件下接种)，美国Sheldon
ManufacturingInc公司生产。SIGMA3K．15高速冷
冻离心机，德国SIGMA公司生产。
1．5 方法
1．5．1培养方法及条件
活化方法按文献[6]。发酵时，把活化好的菌
种接种到装有40mL玉米醪的100mL厌氧瓶中，接
种量为体积分数10％。随后抽真空2min以驱除培
养基中溶解的氧，置恒温培养箱或水浴锅中37℃培
养。当需要添加生物柴油的萃取发酵时，按前期研
究№1的最佳油水质量比(0．4：1)，将地沟生物柴油
添加到接种好的厌氧瓶中，抽真空后37cC静态恒温
培养。
1．5．2溶剂的测定方法
采用气相色谱仪内标法分析发酵产物丙酮、乙
醇、丁醇、乙酸和丁酸的浓度，以异丁醇为内标，色
谱分析条件按文献[5]。
1．5．3表面活性剂对丙丁梭菌的毒性作用
为了筛选出对丁醇发酵无抑制作用或抑制作用
小的表面活性剂，首先在传统的分批发酵中进行了表
面活性剂的毒性实验。在实验中，把各种表面活性剂
直接添加到培养基中，接种培养。由于培养基原料为
玉米粉，发酵液比较稠并在发酵中后期会形成醪盖，
细胞量无法测定，所以通过测定产气量(产气速度与
细胞增殖呈正关联)和最终丙酮、丁醇的产量来判断
各类表面活性剂对丙丁梭菌的毒性作用。
万方数据
2008年7月 杨影等：添加表面活性剂改善丁醇萃取发酵性能 ·27·
1．5．4表面活性剂对丁醇萃取发酵性能的影响
在萃取发酵的培养基中添加无毒性或毒性小
的表面活性剂，通过比较发酵产气量、溶剂在油水
两相中的浓度和溶剂总生产强度来判断表面活性
剂对丁醇发酵的影响。其中溶剂总生产强度计算
公式如下：
总溶剂生产强度(g／(L．h))=油水两相中丁
醇、丙酮的总质量／(水油两相总体积x发酵时间)
2结果与讨论
2．1 表面活性剂对丙丁梭菌的毒性作用
在传统的分批发酵过程中，考察了阴离子表面
活性剂(十二烷基硫酸钠和十二烷基苯磺酸钠)、非
离子表面活性剂(吐温一80)和高分子表面活性剂
(羧甲基纤维素钠(CMC)和海藻酸钠)对丙丁梭菌
的毒性作用。因为阳离子表面活性剂大多具有很
强的杀菌作用，所以没有选择这类表面活性剂。培
养基中表面活性剂的添加量均为质量分数0．1％，
在发酵过程中测定产气量，43h后结束发酵，测定
发酵液中产物浓度。表1和图1分别给出了添加各
种表面活性剂条件下每升发酵液产溶剂(丙酮、丁
醇)的总量和对应的产气曲线。
由表l可知，十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸
钠和海藻酸钠对菌体的生长均有很强的抑制作用，
培养基中即使含有微量的上述表面活性剂，菌体也
不能生长。与对照相比(无表面活性剂添加)，添加
吐温一80和CMC，最终的溶剂产量差别不大。另
外，丁醇发酵是典型的生长耦联型发酵，产气速度
反映了细胞生长速度。从图l可知，添加浓度下的
吐温一80对菌体生长略有毒性，羧甲基纤维素钠的
毒性稍大，但仍在容许范围之内。因此，在以后的
萃取发酵中，我们均采用这两种表面活性剂并探讨
其对发酵性能的影响。
表1各种表面活性剂作用下的溶剂产量
TableSolvem订eldunderthe胡ktofdi雎陀ntsu而ct锄ts
注：发酵时间为43h。
25
20
函15
粒lo
5
O 10 20 30 40 50
发酵时间／lI
图l 添加不同表面活性剂时的产气量
Fig．1’nIeg髓producti∞whenusingdifcb糟msu血ct彻l协
2．2表面活性剂对丁醇萃取发酵性能的影响
如前所述，在丁醇发酵过程中，产气速度实际
上反映了细胞的生长速度，所以，笔者首先通过测
定发酵产气量的变化来探讨表面活性剂对萃取发
酵的影响。以地沟生物柴油为萃取剂，在培养基中
添加质量分数O．101％的羧甲基纤维素钠进行萃取
发酵，测定产气速度，并与无表面活性剂的萃取发
酵(对照2)和无萃取剂无表面活性剂的传统分批发
酵(对照1)进行了比较，结果如图2所示。由图2
可知，因为CMC对丙丁梭菌有一定的毒性，添加微
量CMc进行萃取发酵，其产气速度均不如对照1和
对照2。因此，添加CMc无法改善丁醇萃取发酵的
性能。
同样，以地沟生物柴油为萃取剂，在培养基中
添加质量分数o．133％吐温一80时的产气曲线如图
3所示。由图3可知，由于生物柴油的毒性作用，产
气速度仍然不如对照1。但是与对照2相比，添加
有吐温一80的萃取发酵产气速度有所加快。图4和
图5是以菜籽生物柴油和棕榈生物柴油为萃取剂并
添加吐温一80进行(萃取)发酵时的产气曲线，吐
温一80对萃取发酵的促进效果与使用地沟生物柴油
万方数据
·28· 生物加工过程 第6卷第4期
为萃取剂时(图3)基本一致，使用棕榈生物柴油时
的促进效果更为明显，说明添加吐温一80对萃取发
酵有一定的促进作用。
发酵时间／lI
图2地沟生物柴油为萃取剂时
CMC对产气的影响
Fig．211le胡ktofCMCong∞producti∞usiIlgw∞te
c∞kingoilba∞dbiodiesed∞出e明由勘taIlt
品
￡
发酵时间，h
图3地沟生物柴油为萃取剂时吐温一舳对产气的影响
Fig．3ThefI毛!ctof7rween一80ong聃pmductionuB IIg
w鹊tec∞kingoilbasedbiodiesed∞tlle既tractant
20
15
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O lO 20 30 加 70
发酵时间，II
图4菜籽生物柴油为萃取剂时吐温一80对产气的影响
Fig．4ne舭t0f7rw唧一80∞g够producti∞岫irIg
mpes∞doilb88edbiodie∞I舾tIle衄：吮c诅m
分别以地沟、菜籽和棕榈生物柴油为萃取剂，
在培养基中添加不同浓度的吐温一80进行萃取发
酵，并以溶剂产量为评价指标，与无表面活性剂的
萃取发酵(对照2)和无萃取剂无表面活性剂的传统
2。
15
事。。
．}L
5
0 10 20 30 柏 50
发酵时间／lI
图5棕榈生物柴油为萃取剂时吐温一∞对产气的影响
Fig．5nee如ctof7rween一80∞g够pmducti∞u8iIlg
palmoilba∞dbiodie驼l酗tlIeextractant
分批发酵(对照1)进行了比较，结果见表2。由表2
可知，在发酵液相添加表面活性剂进行萃取发酵，
油相中的丁醇浓度和总溶剂生产强度均比对照2的
相应数值高。特别是以地沟生物柴油和菜籽生物
柴油为萃取剂，吐温一80的添加量质量分数为
0．14％时，与对照2相比，油相中丁醇浓度分别提高
了21．2％和22．0％，溶剂总生产强度分别提高了
16．5％和16．7％。但与对照1(分批发酵)相比，溶
剂总生产强度却有所降低。这是因为计算溶剂总
生产强度时必须加上油相的体积，同时生物柴油对
菌体生长还有一定的毒性。
图6为以不同生物柴油作为萃取剂，添加有不
同浓度吐温一80的、不同批次萃取发酵条件下的丁
醇总产量与对照2的丁醇总产量之比，图7是在此
条件下丁醇在发酵液相和萃取剂相中的萃取系数
变化曲线。由图6可知，与对照2相比，无论使用哪
种生物柴油作为萃取剂都能提高丁醇的总产量。
其中，使用地沟生物柴油作为萃取剂，吐温一80添加
量为o．136％时，丁醇总产量提高了13．1％；使用菜
籽生物柴油作为萃取剂，吐温一80添加量为
O．143％时，总产量提高的最多，幅度达到19．0％；
使用棕榈生物柴油作为萃取剂，吐温一80添加量为
O．148％时，丁醇总产量提高了12．4％。另外。由图
7可知，在以上3种生物柴油的萃取发酵过程中，吐
温一80的添加量对丁醇萃取系数影响都不大。在无
机械搅拌的萃取发酵体系中，发酵溶剂在油水两相
中的分配平衡是一定的，或者说要达到分配平衡是
需要时间的。添加吐温一80虽然不能提高丁醇在生
物柴油和发酵液中的分配系数，但是，它可以加快发
酵溶剂从发酵液相进入到萃取相的速度，从而诱发发
酵产物在发酵液相中的进一步生成。
笛
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万方数据
2008年7月 杨影等：添加表面活性剂改善丁醇萃取发酵性能 ·29·
注：油水体积比均为O．4：l
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0 O．06 0．12 0．18 O．24
"(吐温一80)，％
+萃取剂为地沟生物柴油+萃取剂为菜籽生物柴油
_卜萃取剂为棕榈生物柴油
图6 吐温一80添加量对丁醇总产量的影响
Fig．6111ee雎ctofTween一80啪ount叩
totalbutaIlolproduction
"(吐温一80)／％
+萃取剂为地沟生物柴油+萃取剂为菜籽生物柴油
—卜萃取剂为棕榈生物柴油
图7 吐温一80添加量对丁醇萃取系数的影响
Fig．7nee雎ctofTwe朗一80锄ouJltonu
butallolext眦tiveco 伍cient
图8是在以地沟生物柴油为萃取剂的萃取发酵
过程中拍摄到的实验现象照片。左边为添加有吐
温一80的萃取发酵，右边为无表面活性剂的萃取发
酵(对照2)。由图8可以看到，在添加吐温一80的
萃取发酵中，水相中产生的细小气泡能够比较缓慢
地穿过萃取相(油层)，而在对照2中，气泡先在油
水两相界面上大量聚集，待小气泡聚并成大气泡
后，再以较快的速度迅速穿过油层。另外，即便较
大气泡的破裂也可能生成小气泡并穿过萃取相，但
是，气泡破裂后所形成的力量会促使含有菌体的醪
盖进入到对菌体生长具有毒性的油层中，从而进一
步恶化了细胞的生长环境。以上分析表明，添加表
面活性剂增加了丁醇萃取发酵中溶剂产物在气一液
(萃取液相)两相间的传质表面，可以强化发酵溶剂
产物从水相到萃取相的移除速度，缩短发酵产物在
油水两相中达到平衡的时间，有利于提高发酵强度。
吐温一80对萃取发酵的促进作用，可能是由表
面活性剂的吸附特性所引起的。表面活性剂分子
一般由极性基团和非极性基团构成，即亲水基团和
疏水基团。表面吸附有利于气泡分散的稳定性，其
机制可能有多种¨o。在此，比较重要的因素是，表
面活性剂在气液界面上的吸附显著地降低了气泡
的表面张力，使得聚并而成的大气泡缓慢破裂形成
小气泡，同时削弱了气泡继续聚并的趋势。
3
2
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l
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籁垛釜将雹镳-L
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万方数据
30· 生物加工过程 第6卷第4期
图8有无表面活性剂的实验现象
Fig．8Experimentalphenomen叫witll／诵‰ut8山‰taIlt
使用的丁醇发酵萃取剂一生物柴油本身对菌体
有毒性，虽然可以通过添加表面活性剂来改善丁醇
萃取发酵的性能，但是其生产强度依然还达不到传
统分批发酵的程度，生物柴油．丁醇耦联萃取发酵的
结果并不尽如人意。另外，依靠使用比较昂贵的表
面活性剂来改善生物柴油的质量以及提高发酵强
度也还存在着实用上的问题。但是，从基础研究的
层面上讲，添加表面活性剂可加快发酵溶剂从发酵
液相到萃取相的移除速度，为强化丁醇萃取发酵的
性能提供了一种新的、可行的方式，值得进一步的
研究和探讨。
3结论
表面活性剂可以降低气泡在水溶液中的表面
张力，对微小气泡的存在具有稳定作用，可以使携
带有发酵溶剂的产气以较小气泡的形式穿过油层，
加快发酵溶剂从发酵液相到萃取相的传质速度、促
进发酵的进行。添加有吐温一80的萃取发酵，发酵
产气速度比无表面活性剂添加的萃取发酵快，萃取
相中的丁醇浓度及总溶剂生产强度也均有所提高。
以地沟生物柴油和菜籽生物柴油为萃取剂，吐温
一80的添加量为0．14％时，与无表面活性剂添加的
萃取发酵相比，萃取相中丁醇浓度分别提高了
21．2％和22．0％，溶剂总生产强度分别提高了
16．5％和16．7％。添加表面活性剂加快了发酵溶
剂从发酵液相到萃取相的移除速度，为强化丁醇萃
取发酵的性能提供了一种新的、可以借鉴的方式。
参考文献：
[1]陈鞠声，陆祖棋．发酵法丙酮和丁醇生产技术[M]．北京：化学
工业出版社，1991：238．239．
[2]1．ayaM，岫iis，Ko脚B幽T．M硼i州Ilg皿d∞Ⅱ州hex岫∞．石vef锄t撕佣0fc王哪t枷帆删呐‰[J]．Jo哪al0f
F．锄ent7Ikhnol，1985，63(2)：181．187．
[3]IsIlizBkiA，Michiwal【is，crabbeE， t且1．Ext瑚tiveaeet∞e-bu．
咖∞l一汕咖lfe唧entati∞u8iIlg眦tIIylated咖depalmod册既-
岫c咖tinbatch山他0fC如ltr“诅m知旧曲讲笛Ip盯6讲—伽咖Ec岍
N1．4(ATcc13564)[J]．Jd啊lal0fBioBci∞ce粕dBi∞ngin卅
iIlg，1999，87(3)：352-365．
【4]mm血b衄A．Biodie解lfuels知m"鲥ableoil8、，iacalalyticand
n伽一c删ytic叫p利ticalal∞hoItraIl嘟t盯ificationsandotlI盱
methodB：a蛐my[J]．EnergyCon哪i帆蛆dM蚰agelnent，
2003。44：2093．2109．
[5]胡翠英，堵益平，杨影．等．生物柴油耦联丙酮丁醇发酵的初步
研究[J]．生物加工过程，2007，5(1)：27．32．
HuCuiyiIlg，DuYipillg，Y肌gYiIlg，eta1．PreliIIliMrymIdy彻
∞啦phr培betW鲫biodie8e18alld鲥etolIe-but蚰olfeⅡn帅tation[J]．
Chine∞J叩m且IofBi叩r嗍BEngin∞ring．2007，5(1)：27-32．
[6]孙志浩，王舒，吴燕．固定化细胞直接发酵玉米粉生产丙酮丁
醇的初步研究[J]．工业微生物，1987，17(6)：18-22．
S明办ilIao，Wmgshu，wuYh．PmliIIli∞ry咖dy仰dimctly
produciIlg卵et仰e—bu咖1wimc咖powd日byi㈣bilized∞U
⋯．Mu蚵alMicmbiology，1987，17(6)：18-22．
[7]朱步瑶，赵振国．界面化学基础[M]．北京：化学工业出版社，
1996：77．80．
万方数据