全 文 ：离子液体对固定化 !"##$"%&’(#)* #)%)+,*,") 细胞催化 乙酰基三甲基硅烷不对称还原反应的影响 黄 敏，宗敏华! （华南理工大学 生物科学与工程学院，广州 !"#$%#）
摘 要：对比研究了 &%’()·*+%,缓冲液混合体系和缓冲液单相体系中固定化面包酵母 !"##$"%&’(#)* #)%)+,*,") 细胞 催化乙酰基三甲基硅烷不对称还原反应的特性，系统探讨了离子液体 &%’()·*+%对该反应的初速度、最大转化率和 产物对映体纯度的影响规律。在各自最优的反应条件下，固定化面包酵母细胞在缓冲液单相体系中催化乙酰基三 甲基硅烷不对称还原反应的初速度、最大转化率及产物 ) - ) - 值分别为 .% -. ))/0 1（2·3）、44 -56和"44 -46；而在 &%’()·*+%,缓冲液混合体系中，该反应的初速度、最大转化率及产物 ) - ) - 值分别为 .7 -# ))/0 1（2·3）、44 -#6和" 44 -46。离子液体的存在，提高了固定化面包酵母细胞催化该反应的速度，但降低了固定化酵母细胞的操作稳定 性。 关键词：乙酰基三甲基硅烷；不对称还原；固定化面包酵母细胞；离子液体 中图分类号：8."% 文献标识码：9 文章编号："$75 : ;$7.（5##!）#; : ##!5 : #$
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生 物 加 工 过 程
&3@AFKF ]/DPAE0 /H *@/VP/IFKK ^AG@AFFP@AG
第 ; 卷第 ; 期
5##! 年 . 月
万方数据
性，故称之为绿色溶剂（!"##$%&’(#$)）［*］。离子液替
代传统的有机溶剂作为绿色反应介质用于生物催化
与生物转化，近年来才引起人们的重视。+,,, 年，
-.’’ 等［+］首次报道了离子液体 */丁基/0/甲基咪唑六
氟磷酸盐（-1234·567）8水双相体系中 !"#$#%#%%&’ 90*+ 细胞催化 *，0/二氰基苯水解生成 0/氰基苯酰 胺这一反应，并发现 -1234·567对细胞的毒性远远 小于甲苯等有机溶剂。随后，有关离子液体中酶催 化反应的报道日渐增多［0 : ;］，大部分的研究表明，酶 在离子液中具有较高的活性、（立体、区域）选择性及 稳定性。可见，离子液体中的生物催化是一个崭新 的研究领域，其为生物催化的广泛应用提供了新的 可能和机遇，具有相当诱人的前景。 有机硅化合物是一类含有 -/<= 键的非天然化 合物，其不但在不对称合成及功能材料中具有重要 作用，且许多有机硅化合物具有特定的生物活性，作 为药物，较其碳结构类似物具有更强的药效、更高的 选择性及更小的毒性，“硅替代”是药物设计的一条 有效途径［>，*,］。有机硅化合物在诸多领域的重要 性，激发人们争相进行其合成和转化的研究。与化 学法相比，生物法因具有高效性、高选择性、条件温 和以及环境污染小等优点而日益受到有机化学家的 青睐。自 +, 世纪 ;, 年代末以来，?@AB#等［**，*+］一直 探索生物细胞催化有机硅化合物的转化作用，发现 酵母、细菌、藻类、悬浮培养植物细胞均能催化有机 硅化合物的不对称羰 8羟基转化。随后，人们相继报 道了醇脱氢酶、脂肪酶、醇腈酶等催化有机硅醇的脱 氢、酯化、转酯、氨解和转氰等反应［*0 : +,］及酵母细 胞催化有机硅酮不对称还原反应［+* : ++］。目前有机 硅化合物的生物合成与转化大都是在有机介质或有 机溶剂 8水双相体系中进行，这不仅增加了生物催化 剂回收和产物分离的困难，而且大量使用有机溶剂 将对环境造成严重污染。另外，有机溶剂对酶和微 生物细胞有一定的毒害作用，因此，探讨能否利用绿 色反应介质离子液体替代有机溶剂作为生物催化有 机硅化合物生物合成与转化的反应介质具有重要的 实践意义。 C&D@")E等［+0］率先报道了在 (（-1234·567）F ( （水）G *, F * 双相体系中用酵母细胞催化一系列潜 手性酮不对称还原反应制备对映体纯手性醇。近年 来，有关含离子液体介质中微生物细胞催化还原反 应的报道相继出现［+1 : +7］。大多数研究结果表明， 与有机溶剂相比，离子液体对细胞的毒性较小。迄 今，尚未见在含离子液体介质中酵母细胞催化有机 硅酮不对称还原反应的研究报道。本文通过对比研 究含离子液体和不含离子液体介质中固定化面包酵 母 )*%%"*+#,-%.’ %.+./0’0*. 细胞催化乙酰基三甲基硅 烷不对称还原反应的特性，探讨离子液体对该还原 反应的影响规律。 ! 材料与方法 * H* 材料 面包酵母 )*%%"*+#,-%.’ %.+./0’0*.，购自 <=I4@ 公 司。乙酰基三甲基硅烷（@A#)J’)"=4#)EJ’%=’@$#；K?2<），
（ L ）/*/三甲基硅乙醇（（ L ）/*/)"=4#)EJ’%=’J’#)E@$&’）， 正壬烷色谱纯购自 K’M"=AE 公司。离子液体 */丁基/ 0/甲基咪唑四氟硼酸盐（-1234·N61，>OP）购自 6’./ B@公司。其他化学试剂均为市售分析纯。 * H+ 方法 * H+ H* 面包酵母细胞固定化 离心（0 Q,, " 8 4=$，*, 4=$）分离培养 ; E 的面包 酵母细胞，洗涤两次，得到游离面包酵母细胞。把一 定量的游离面包酵母细胞分散在等质量的蒸馏水 中，然后将其加入含 +P海藻酸钠的蒸馏水中形成 细胞海藻酸钠悬浮液（边加入边搅拌），用注射器 （Q R针头）把悬浮液滴入 + P的 -@-’+溶液中（边滴边 搅拌），过滤收集固定化细胞颗粒。将粒径为 * HQ : + H, 44的固定化细胞悬浮在含 +,P葡萄糖、, H,QP （质量分数）-@-’+的溶液中，冷藏（1 S）备用。 * H+ H+ 不对称还原反应 在 *, 4T具塞三角瓶中分别加入 + 4T 含一定 浓度的 K?2<、, H*Q I 8 4T 固定化酵母细胞、+,P（质 量分数）葡萄糖和 , H,QP（质量分数）-@-’+、由 -1 234·N61与 ?"=%/C-’ 缓冲液（Q, 44&’ 8 T）组成的混 合溶剂，置恒温水浴振荡器中反应（*;, " 8 4=$），定时
取样 +,!T，用 *,,!T正己烷（含 Q H7 44&’ 8 T内标物
正壬烷）萃取残留底物和产物，用漩涡混合器振荡混
合 Q 4=$，静置后取上清液，供气相色谱分析。 * H+ H0 气相色谱分析 日本岛津公司 !-/+,*, 型气相色谱仪，配备 !- %&’.)=&$工作站，63U 检测器；C5/-E="@’ 毛细管柱，柱
长 0, 4，柱径 , H+Q 44，膜厚 , H+Q!4；分析条件：汽
化室和检测室温度均为 +Q, S；色谱柱初始温度为
71 S，维持 * 4=$后，以 * S 8 4=$ 的速率升至 O* S，
维持 * 4=$；载气为氮气，流速为 + HQ 4T 8 4=$，分流比
+,,Q 年 ; 月 黄 敏等：离子液体对固定化 )*%%"*+#,-%.’ %.+./0’0*. 细胞催化乙酰基三甲基硅烷不对称还原反应的影响 ·Q0·
万方数据
! " !##；进样量 !!$。在该分析条件下，乙酰基三甲 基硅烷、内标正壬烷、（ !）%!%三甲基硅乙醇和（ "）%!% 三甲基硅乙醇的保留时间分别为 & ’(#、) ’#*、) ’+* 和 + ’*, -./。最大相对误差小于 ! ’#0。 ! ’* ’1 转化率、反应初速度及产物对映体纯度的确 定 根据底物 2345 的减少量计算转化率，反应初 速度为反应初期单位时间内底物的减少量，产物对 映体纯度用对映体过量值 # ’ # ’ 来表征，即 # ’ # ’ 6 （$ 7 %）&（ $8 %），$ 和 % 分别表示产物 !%三甲基硅
乙醇的两种对映体的浓度。
! 结果与讨论
* ’! 914:-·;<1离子液体体积分数对反应的影响
据报道，混合体系中离子液体的浓度对细胞活
性有重要的影响［*&］。反应体系中存在少量的离子
液体对细胞的催化活性可能有促进作用，但当离子
液体含量超过一定值后，其将对细胞产生毒害作用，
导致细胞的生理活性显著下降。
表 ! 91 4:-·;<1体积分数对固定化面包酵母细胞催化
2345不对称还原反应的影响
3=>?@ ! ABB@CD EB 914:-·;<1 CE/D@/D E/ DF@ =GH--@DI.C I@JKCD.E/
EB 2345 C=D=?HL@J >H .--E>.?.L@J >=M@ING H@=GD C@??G
914:-·;<1 CE/D@/D O
0
’( O
（--E? O $·F） 9E/P@IG.E/ O 0 # ’ # ’ O 0 # !1 ’! QQ ’Q !QQ ’Q + ’( !1 ’& QQ ’Q !QQ ’Q !# ’# !) ’& QQ ’Q !QQ ’Q !* ’( !& ’, QQ ’Q !QQ ’Q !( ’# !* ’# QQ ’Q !QQ ’Q *# ’# 1 ’* Q# ’+ !QQ ’Q 反应条件：* ’# -$ 含有不同体积分数 914:-·;<1的 3I.G%R9?
缓冲液（(# --E? O $，SR + ’(）；&# T；!,# I O -./；# ’!( U O -$固定
化面包酵母细胞；!1 --E? O $2345 表 ! 为混合体系中离子液体 914:-·;<1体积分 数对固定化面包酵母细胞催化 2345 不对称还原反 应的影响，由该表可知，当 914:-·;<1体积分数在 # 到 + ’(0之间，离子液体体积分数的改变对反应初 速度影响不大；当 914:-·;<1体积分数从 + ’(0增加 到 !# ’#0时，反应初速度随离子液体体积分数的增 大而增大；当 914:-·;<1体积分数超过 !# ’#0后，反 应初速度随着离子液体体积分数的增加而下降。另 一方面，当 914:-·;<1体积分数低于 !( ’#0时，反应 的最大转化率几乎不随 914:-·;<1体积分数的变化 而变化；当 914:-·;<1体积分数超过 !( ’#0后，随着 914:-·;<1体积分数的继续增加，反应的转化率有 明显下降趋势。在所研究的离子液体体积分数范围 内，产物 # ’ # ’ 值均为 QQ ’Q0以上。可见，离子液体 对该反应的影响因其体积分数不同而异，适宜体积 分数的离子液体能提高反应的速度。 * ’* 缓冲液的 SR值对反应的影响 SR值不仅可以影响反应速度，而且还可以影响 反应的最大转化率和产物的对映体纯度［*!］。由图 ! 可知，在缓冲液单相体系中，当 SR值低于 ) ’( 时，反 应初速度随 SR 值的增大而增大；但 SR 值超过 ) ’( 后，反应初速度随 SR 的增大而降低。另一方面，在 所考察的 SR 值范围内，反应的最大转化率和产物 的对映体纯度几乎不随缓冲液 SR 值的变化而变 化，均达到 QQ ’Q0以上；对该反应体系，缓冲液的最 适 SR值为 ) ’(。在此条件下，反应 ( F 达到平衡，反 应初速度为 !) ’# --E? O（$·F），最大转化率为
QQ ’Q0，产物的对映体纯度大于 QQ ’Q0。
—"—9E/P@IG.E/（0）./ 3I.G >KBB@I；—#—9E/P@IG.E/（0）./
3I.G >KBB@I%914:-·;<1 CE%GE?P@/D GHGD@-；—$— ’(（--E? O$·F）./
3I.G >KBB@I；—%— ’(（--E? O $·F）./ DF@ 3I.G >KBB@I %914:-·;<1 CE%GE?P@/D GHGD@- 反应条件：* ’# -$ 不含或含 !#0（体积分数）914:-·;<1的不
同 SR 值的 3I.G%R9? 缓冲液（(# --E? O $）；&# T；!,# I O -./； # ’!( U O -$固定化面包酵母细胞；!1 --E? O $2345 图 ! SR值对缓冲液单相体系和 914:-·;<1%缓冲液混合体 系中固定化面包酵母细胞催化 2345不对称还原反应 的影响 <.U ’! ABB@CD EB SR E/ DF@ =GH--@DI.C I@JKCD.E/ EB 2345 C=D=?HL@J >H .--E>.?.L@J >=M@ING H@=GD C@??G ./ 3I.G >KBB@I =/J ./ 3I.G >KBB@I%914:-·;<1 CE%GE?P@/D GHGD@- 在 914:-·;<1%缓冲液混合体系中，当 SR 值低 于 + ’& 时，反应初速度随 SR 值的增大而明显增大； 当 SR 值继续上升，反应初速度却有所下降。与缓 ·(1· 生物加工过程 第 & 卷第 & 期 万方数据 冲液体系不同的是，反应的最大转化率随 !" 的变 化而改变。当 !"值小于 #$% 时，反应最大转化率随
!"值的升高而增大；在 !"# $% & ’$% 范围内，反应的
最大转化率几乎不随 !" 值的变化而变化，均为
(( $()；!" 值继续升高，最大转化率却下降。类似 于缓冲液体系，在所研究的 !" 值范围内，产物的对 映体纯度均为 (($()以上。对于该混合体系，反应
的最适 !"值为 ’ $*。离子液体的存在，提高了反应 的最适 !"值，这可能是因为离子液体的加入降低 了反应体系的 !"值。在最适 !"条件下，反应初速 度为 +#$’ ,,-. /（0·1），高于缓冲液体系中的对应
值，而最大转化率及产物的对映体纯度与缓冲液体
系中的相似，均达 (( $()以上。 —!—2-345678-3（)）83 9687 :;<<56；—"—2-345678-3（)）83 9687 :;<<56=2>?@,·AB> C-=7-.453D 7E7D5,；—#— !"（,,-. / 0·1） 83 9687 :;<<56；—$— !"（,,-. / 0·1）83 D15 9687 :;<<56 =2>?@,·
AB> C-=7-.453D 7E7D5,
反应条件：F $G ,0 9687="2. 缓冲液（%G ,,-. / 0，!" #$%）或含
+G)（体积分数）2>?@,·AB>的 9687="2. 缓冲液（%G ,,-. / 0，
!" ’ $*）；+HG 6 / ,83；G$+% I / ,0 固 定 化 面 包 酵 母 细 胞；
+> ,,-. / 0 J9?K
图 F 反应温度对缓冲液单相体系和 2>?@,·AB>=缓冲液混
合体系中固定化面包酵母细胞催化 J9?K 不对称还原
反应的影响
B8I $F L<<5CD -< 65MCD8-3 D5,!56MD;65 -3 D15 M7E,,5D68C 65N;CD8-3 -< J9?K CMDM.EO5N :E 8,,-:8.8O5N :MP56Q 7 E5M7D C5..7 83 9687 :;<<56 M3N 83 9687 :;<<56=2>?@,·AB> C-=7-.453D 7E7D5, F$* 反应温度对反应的影响
图 F 表明，在缓冲液单相体系中，在所研究的范
围内（F% & %G R），反应初速度随着温度的升高而加
快，这是传质速率加快、细胞膜对底物 /产物分子的
通透性增大等原因所致。同时也表明细胞在固定化
后，其热稳定性增强。当反应温度从 FG R升至 *%
R时，最大转化率保持在 (( $()；当反应温度高于 *% R时，最大转化率随温度的升高而降低。这可能 是因为该反应属于放热反应，温度的升高不利于产 物的生成［F+］。在所研究的温度范围内，产物 #$ # $值均为 (($()以上。该反应温度以 *% R为宜。在
此条件下，反应 > 1 达到平衡，反应初速度为 +H $# ,,-. /（0·1），最大转化率为 (($()，产物对映体纯
度大于 (( $()。 在 2>?@,·AB>=缓冲液混合体系中，反应温度从 F% R升至 >% R，反应随之加速，这是因为温度升高 有利于降低离子液体的粘度，减少传质阻力。然而， 与缓冲液体系不同的是，继续升温导致反应初速度 显著下降，说明离子液体的存在引起细胞热稳定性 下降，这与前人的研究结果恰恰相反，值得进一步研 究。类似于缓冲液体系，反应的最大转化率随温度 的升高而降低。在所研究的温度范围内，产物 #$ # $值均为 (($()以上。该体系的最适反应温度与缓
冲液体系相同（*% R），在该温度下两体系反应的最
大转化率及对映体纯度差别甚微，均大于 (( $()。 然在混合体系中反应初速度为 FG$H ,,-. /（0·1），大
于缓冲液体系中的对应值。
—!—2-345678-3（)）83 9687 :;<<56；—"—2-345678-3（)）83
9687 :;<<56=2>?@,·AB> C-=7-.453D 7E7D5,；—#— !"（,,-. / 0·1）
83 9687 :;<<56；—$— !"（,,-. / 0·1）83 D15 9687 :;<<56 =2>?@,· AB> C-=7-.453D 7E7D5, 反应条件：F$G ,0 9687="2. 缓冲液（%G ,,-. / 0，!" # $%）或含 +G)（体积分数）2>?@,·AB>的 9687="2. 缓冲液（%G ,,-. / 0， !" ’$*）；*% -2；+HG 6 / ,83；G $+% I / ,0固定化面包酵母细胞 图 * 底物浓度对缓冲液体系和 2>?@,·AB>=缓冲液混合体 系中固定化面包酵母细胞催化 J9?K不对称还原反应 的影响 B8I$* L<<5CD -< 7;:7D6MD5 C-3C53D6MD8-3 -3 D15 M7E,,5D68C 65N;CD8-3
-< J9?K CMDM.EO5N :E 8,,-:8.8O5N :MP56Q 7 E5M7D C5..7 83
9687 :;<<56 M3N 83 9687 :;<<56=2>?@,·AB> C-=7-.453D 7E7D5,
F $> 底物浓度对反应的影响 由图 * 可知，在缓冲液单相体系中，当 J9?K 浓 度由 ’ ,,-. / 0增至 +F# ,,-. / 0时，反应初速度随底 物浓度的增大而显著升高；底物浓度继续增大，超过 +F# ,,-. / 0后，反应初速度急剧下降，这可能是由于 高浓度的底物对细胞中的酶产生抑制作用。另一方 面，当底物浓度由 ’ ,,-. / 0增至 ’G ,,-. / 0时，最大 转化率变化不大，均达 (($G)以上；随着底物浓度
FGG% 年 H 月 黄 敏等：离子液体对固定化 $%&&’%(")*&#+ &#(#,-+-%# 细胞催化乙酰基三甲基硅烷不对称还原反应的影响 ·%%· 万方数据 的继续增大，最大转化率随之下降，这可能是由于产 物抑制作用所致；当底物浓度为 !"#$$%& ’ ( 时，反 应初速度和最大转化率均最小，这可能是底物抑制 和产物抑制联合作用的结果。在所研究的底物浓度 范围内，底物 ! ) ! ) 值均保持在 ** )*+以上。底物 浓度以 ,-$$%& ’ ( 为宜。在此条件下，反应 !. / 达 到平衡，反应初速度为 #0 )#$$%& ’（(·/），最大转化 率为 ** ).+，对映体纯度大于 ** )*+。 在 1023$·4506缓冲液混合体系中，底物浓度对
反应的影响规律与缓冲液体系相似。当底物浓度低
于 !." $$%& ’ (时，反应初速度亦随底物浓度的增大 而显著升高，而当底物浓度高于 !."$$ %& ’ ( 时，反
应初速度随底物浓度的增大而急剧降低；当底物浓
度小于 ,- $$%& ’ ( 时，最大转化率变化不大，均为 ** )-+；当底物浓度超过 ,-$$ %& ’ ( 时，最大转化率
随底物浓度升高明显降低。在所研究的底物浓度范
围内，产物 ! ) ! ) 值亦均达 ** )*+以上。该体系的
最适底物浓度与缓冲液体系相同，均为 ,- $$%& ’ (， 在该底物浓度下两体系反应的最大转化率及对映体 纯度差别甚微，均大于 ** )-+。然在混合体系中反 应初速度为 #, )-$$ %& ’（(·/），大于缓冲液体系中的
对应值。
—!—78&9:;<8 =>:;<;:?（+）;@ AB;C DEFF8B；—"—78&9:;<8 =>:;<;:?
（+）;@ AB;C DEFF8B61023$·450 >%6C%&<8@: C?C:8$
反应条件：. )- $( AB;C6G1& 缓冲液（H-$$%& ’ (，IG " )H）或含 !-+（ " # "）10 23$·450的 AB;C6G1& 缓冲液（H- $$%& ’ (，IG , )J）；JH %1；!#- B ’ $;@；- )!H K ’ $( 固定化面包酵母细胞；,-$$ %& ’ (=A2L；每批次反应时间为 !. /；定义第 ! 批反应的相
对细胞活性为 !--+
图 0 固定化面包酵母细胞在缓冲液体系和 1023$·4506缓 冲液混合体系中的操作稳定性 5;K )0 MI8B9:;%@9& C:9D;&;:? %F ;$$%D;&;N8O D9P8BQ C ?89C: >8&&C ;@ AB;C DEFF8B 9@O ;@ AB;C DEFF8B61023$·450 >%6C%&<8@: C?C:8$. )H 固定化面包酵母细胞的操作稳定性 图 0 为固定化面包酵母细胞在缓冲液体系和 1023$·4506缓冲液混合体系中的操作稳定性。由图
可知，在缓冲液体系中，固定化面包酵母细胞重复使
用 " 批次后仍能维持 #-+以上的相对活性。但超
过 " 批次后，酵母细胞的活性明显下降。反应 !! 批
次后，其相对活性为 "H+左右。在 1023$·4506缓冲 液混合体系中，固定化面包酵母细胞连续使用 H 批 次，仍能保持 #-+以上的相对活性。但重复使用超 过 H 批次后，酵母细胞的活性呈现明显下降趋势。 反应 # 批次后，其相对活性为 ". )0+；反应 !! 批次 后，其相对活性降至 H! )0+左右。 已有的报道表明离子液体可以提高酶或细胞的 操作稳定性［.,］。但我们的实验结果与之相反，这一 有趣的现象有待深入探讨。 ! 结论 在缓冲液体系中固定化面包酵母细胞催化 =A2L不对称还原反应的最适缓冲液 IG 值、反应温 度和底物浓度分别为 " )H、JH R和 ,-$$%& ’ (；其在 亲水性离子液体 1023$·4506缓冲液混合体系中催
化该反应的最适 10 23$·450体积分数、缓冲液 IG 值、反应温度和底物浓度分别为 !-+、, )J、JH R和 ,-$$%& ’ (。在各自最优的条件下，固定化面包酵母 细胞在缓冲液体系中催化 =A2L 不对称还原反应的 初速度、最大转化率及产物 ! ) ! ) 值分别为 #0 )#$$%& ’（(·/）、** ).+和#** )*+；在 1023$·4506缓冲
液混合体系中，该反应的初速度、最大转化率及产物
! ) ! ) 值分别为 #, )- $$%& ’（ (·/）、** )-+ 和 #
** )*+。离子液体 1023$·450的存在，提高了固定
化面包酵母细胞催化该反应的速度，但降低了固定
化酵母细胞的操作稳定性。
参考文献：
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·H"· 生物加工过程 第 J 卷第 J 期
万方数据
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