全 文 ：固定化细胞有机相催化不对称还原!!羰基酯
何军邀，孙志浩!
（江南大学 生物工程学院生物催化研究室，工业生物技术教育部重点实验室，无锡 "#$%&’）
摘 要：将酵母细胞用海藻酸钙包埋后用于有机相催化不对称还原 $!氯乙酰乙酸乙酯制备光学活性的 $!氯!&!羟基
丁酸乙酯，从中筛选得到具有较高立体选择性和还原能力的菌株假丝酵母 ()%$%#，将此菌株的细胞固定化细胞作
为研究对象，系统考察了固定化条件、固定化细胞大小、反应溶剂、初始底物浓度、辅助底物、固定化细胞热处理和
抑制剂对还原反应的影响。结果表明，上述因素对反应的摩尔转化率和产物（ !）!*+,- 光学纯度有显著影响。固
定化时所用缓冲液的 .+值为 / 0% 时和固定化细胞颗粒平均直径为 " 01 22较合适，以正己烷为反应介质时反应的
摩尔转化率和产物光学纯度最优，初始底物浓度以 1$ 0/ 2234 5 6为宜，辅助底物以 #!己醇为佳。对固定化细胞的热
处理和添加抑制剂烯丙醇均能够明显改善产物的光学纯度，但对提高摩尔转化率有负面影响。
关键词：固定化细胞；有机相；不对称还原；$!氯乙酰乙酸乙酯；（ !）!$!氯!&!羟基丁酸乙酯
中图分类号：78%&&；81%&；9’$& 0& 文献标识码：: 文章编号：#’/" ; &’/<（"%%1）%$ ; %%"& ; %1
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收稿日期："%%1!%/!%<
基金项目：国家自然科学基金（"%$/&%$Y）和国家“Y/&”（编号 "%%&*,/#’%%<）资助
作者简介：何军邀（#Y/$!），男，浙江宁海人，博士研究生，研究方向：生物催化与手性技术。
联系人：孙志浩，男，教授，博士生导师，-!2AF4：L>?WZ .>G4FK4 0 WV0 [L 0 K?
第 & 卷第 $ 期
"%%1 年 ## 月
生 物 加 工 过 程
*EF?MLM =3>H?A4 3J ,F3.H3KMLL -?NF?MMHF?N
C3Q X "%%1
·"&·
万方数据
!"氯"#"羟基丁酸乙酯（$%&’）是一种重要有机
合成中间体，其两个对映体均可以被用于合成多种
手性药物［(］。制备光学活性 $%&’ 方法包括了化学
不对称合成［)］、外消旋体的生物拆分［#］和生物催化
不对称还原［!，*］。化学不对称合成所需的化学催化
剂价格昂贵，设备要求苛刻；生物拆分的缺点是对映
体选择性不够理想，理论收率不高于 *+,。而生物
催化不对称还原具有高效率、高立体选择性、反应条
件温和以及经济和社会效益好等优点，因此，利用微
生物细胞或酶作为催化剂来催化不对称还原 !"氯乙
酰乙酸乙酯（$-&’）制备具有光学活性的 $%&’ 的
方法最具吸引力，倍受研究者的青睐［. / 0］。
本文从本实验室保藏的几种酵母菌株中筛选了
一株立体选择性较高的假丝酵母，尝试将其细胞进
行固定化后用于在有机相中催化 $-&’ 的不对称还
原，并考察各种因素对还原反应的摩尔转化率和产
物光学纯度的影响，以期为改善生物催化不对称还
原反应提供一些参考数据。
! 材料与方法
( 1( 菌 种
菌株 !"##$"%&’(#)* #)%)+,*,") 23 ! 1(，!"##$"-
%&’(#)* #)%)+,*,") 23 *4，!"##$"%&’(#)* .+"%.’ 23 *5，
/"0*)0.1" "0&’"1" 62 ) 1#++，2"03,3" 78 1 23 +!+(，
4,#$," "0&’"1" 62 ) 1)#5 为实验室保藏菌种。
( 1) 试 剂
$-&’、!"$%&’ 和 5"$%&’ 标准品购自 69:;<=>
公司。底物 $-&’（00,）为西安太宝化工有限公司
产品。其他材料为市售色谱纯或分析纯试剂。
( 1# 培养基
种子培养基（? @ A）：葡萄糖 !+，酵母浸膏 )+，麦
芽提取物 (+，蛋白胨 (+。
发酵培养基（? @ A）：葡萄糖 .+，酵母浸膏 *，蛋白
胨 *，（B%!）)2-! *，C%)D-! )，E?2-!·4%)- + 14。
( 1! 细胞的固定化
在 )5 F、(.+ ; @ G 后，! F下离心
（5 +++ I ?，(+ G. ?湿菌体，悬浮于 #+ GA 不同 8%的缓冲液中，形成
的菌悬液与 #+ GA .,海藻酸钠溶液混匀，用注射器
滴入 + 1) GJ9 @ A的 $K$9)溶液中，形成胶珠，在 ! F下
硬化 #+ G! F下保存备用。
( 1* 不对称还原反应
在 *+ GA具塞三角瓶中，投入固定化细胞 5 ?、
有机溶剂 )+ GA，添加适量 $-&’ 和一定量添加剂
后，置于水浴摇床中 (5+ ; @ G。
分出有机相，固定化细胞用 )+ GA 水洗涤，水相用
(+ GA乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，干燥，定容，
加十六烷（内标）后用气相色谱分析。
( 1. 气相色谱分析
仪器为美国瓦里安 $D#0++，配备 2LK; 工作站，
氢火焰离子检测器。
$-&’ 和 $%&’ 的浓度测定采用 M6NO6B $D
36P *)$&极性色谱柱（#+ G I + 1)* GG I + 1)*!G），
分析条件为气化室温度 )*+ F，检测器温度 )*+ F，
柱温 (++ F保留 ) G持 ) G( Q *+。产物对映体过量值的测定：按文献［*］的方法
处理样品，具体操作为取样品溶液 * GA，减压蒸干
溶剂，加入乙酸酐 + 1) GA，无水吡啶 + 1( GA，密闭条
件下沸水浴中保持 ( >，冷却至室温，加入 ( GA乙酸
乙酯，用水洗涤两次（每次 ( GA），然后用同样体积
的饱和食盐水洗涤两次，分出有机层用无水硫酸钠
干燥过夜。用手性色谱柱 $D"$><;K7<9 RST $&（+ 1)*
GG I )* GG I + 1)*!G）分析，分析条件为气化室温
度 )*+ F，检测器温度 )*+ F，柱温 (++ F保留 )
GF @ G为) 1+ GA @ G( 14 摩尔转化率和产物光学纯度的确定
根据产物 $%&’ 的增加来计算摩尔转化率，产
物的光学纯度由对映体过量值（ ) 1 ) 1）来表征，产物
) 1 ) 1 值由 ) 1 ) 1 U（ 6 V 7）8（ 6 W 7）计算得到，其中
6 和 7 分别表示产物 $%&’的两种对映体的浓度。
" 结果与讨论
) 1( 不同酵母细胞有机相催化 $-&’ 的不对称
还原
由于酵母细胞中含有丰富的氧化还原酶，而且
许多酵母能够催化 $-&’ 的还原［(+］。因此本实验
从实验室保藏的酵母中筛选能够较高立体选择性和
反应活性的菌株，结果如表 ( 所示。所筛选菌株均
有还原 $-&’ 的能力，而且产物的立体构型相同。
·)!· 生物加工过程 第 # 卷第 ! 期
万方数据
在试验的菌株中，综合考虑摩尔转化率和产物的光
学纯度，认为假丝酵母 !"#$%$" !" # $% &’&( 的反应
效果最好，将此菌株用于下面的研究。
表 ( 不同酵母细胞有机相催化 )*+,的不对称还原
-./01 ( 2!34415678 619:857;< ;= )*+, 8.5.03>19 /3 744;/707>19
8100! ;= ?.67;:! 31.!5!
酶母细胞
摩尔转
化率 @ A
立体选择性
& # & # @
A
’"(()"*+,-(&. (&*&/%.%"& $% ’#( ’B #C ’ D& #E
’"(()"*+,-(&. (&*&/%.%"& $% DF DF #E ’ D’ #&
’"(()"*+,-(&. 0/"*0, $% DG ’’ #F ’ EG #C
1"#." "#+,"2" 2$ B #C&& EC #( ’ ’G #H
!"#$%$" !"# $% &’&( DH #C ’ G& #E
3%()%" "#+,"2" 2$ B #BCG ’( #D ’ DH #G
B #B 固定化条件和固定化 !"#$%$" !" # $% &’&( 颗
粒大小对反应的影响
固定化 !"#$%$" !" # $% &’&( 细胞过程中，所用
不同 "I 的缓冲溶液会影响不对称还原反应。结果
如图 ( 所示，发现 "I对反应的摩尔转化率和光学纯
度均有明显影响。当 "I’ #B 时产物（ ’）J)I+, 的对
映体过量值接近 (&&A，但反应的摩尔转化率很低。
这可能是因为 "I’ #B 时细胞中催化转化成 4 型产
物的酶（4 型酶）完全被抑制或者失活，而 ’ 型酶还
保留部分酶活力。"I值在 ’ #B 到 F #& 之间，随着 "I
的升高反应的摩尔转化率明显提高，但产物的对映
体过量值下降，"I 进一步升高，摩尔转化率开始下
降，而对映体过量值变化不明显。因此综合考虑反
应的摩尔转化率和产物的光学纯度，选择在 "IF #&
的缓冲液中进行细胞固定化。
!"!摩尔转化率；!#! & # & #
图 ( "I对还原反应的影响
K7L #( ,==185 ;= "I ;< 5M1 619:857;<
此外，由于细胞固定化后，将会影响反应过程中
的传质，从而影响还原反应的速度，因此，本实验对
固定化细胞颗粒大小（平均颗粒直径分别为
( #D 44、B #D 44、’ 44）对反应影响进行了考察。结
果发现（数据未显示），固定化细胞颗粒越大，还原反
应速度越小，说明固定化细胞内部存在传质限制。
但是固定化细胞颗粒大小对反应产物的光学纯度无
明显影响。本文选取平均直径为 B #D 44 的固定化
细胞用于其它实验。
B #C 不同反应介质的影响
有机溶剂影响酶的构象，从而影响酶的活性和
立体选择性。因此，选择合适的有机溶剂是改善有
机相生物催化不对称还原的关键之一。本研究选用
了比较常用的 D 种具有不同疏水性（用 0L3 表示）的
有机溶剂作为反应介质。结果如表 B 所示，在 0L3
较小的溶剂如乙酸正丁酯和环己烷中，反应的摩尔
转化率和产物的光学纯度均较低，这可能是这两种
溶剂生物相容性差而对细胞产生毒害作用的原因。
对于正己烷、正庚烷和正辛烷，随着 0L3 的增加，反
应的摩尔转化率和产物的光学纯度有所降低。因
此，选用正己烷作为此还原反应的反应介质。
表 B 有机溶剂对还原反应的影响
-./01 B ,==185 ;= ;6L.<78 !;0?1<5! ;< 5M1 619:857;<
有机溶剂 0L3 摩尔转化率 @ A & # & # @ A
#J*85.<1 ’ #D EE #( FE #B
#JI1"5.<1 ’ #& FB #’ FH #E
#JI1N.<1 C #D FF #G G& #E
)380;M1N.<1 C #& EC #H FC #D
#J/:530 .815.51 ( #F ’& #F FB #(
B #’ 初始底物浓度的影响
由于假丝酵母细胞内的酶系比较复杂，存在着
几个氧化还原酶的同工酶［((］，而不同同工酶的米氏
常数 54 和最大速度 64.N各异，因此反应介质中底
物浓度的变化对反应的立体选择性会产生影响，而
且底物浓度大小还与底物对细胞的抑制作用有关，
也会影响反应结果。如图 B 所示，随着有机相中初
始底物浓度的增加，摩尔转化率有所提高，在
D’ #F 44;0 @ O处达到最大值，产物对映体过量值也随
之略有增加。当底物浓度继续增大时，摩尔转化率
急剧下降，底物浓度越大，摩尔转化率越低，同时产
物对映体过量值也随之变小。因此，有机相初始底
物浓度为 D’ #F 44;0 @ O时对反应比较有利。
B&&D 年 (( 月 何军邀等：固定化细胞有机相催化不对称还原!J羰基酯 ·BD·
万方数据
!"!摩尔转化率；!#! ! ! ! !
图 " 初始底物浓度对还原反应的影响
#$% !" &’’()* +’ $,$*$-. )+,)(,*/-*$+, +’ 012& +, *3( /(45)*$+,
" !6 不同辅助底物的影响
由于绝大多数氧化还原酶是辅酶 789（:）; 依
赖型酶，还原反应的顺利进行需要有辅酶的再生体
系与其耦合［<"］。酵母细胞中往往含有醇脱氢酶，脂
肪醇类试剂可以作为辅酶再生的电子供体［<=］。实
验以未加辅助底物为对照，选用了 6 种醇作为辅助
底物，考察其对还原反应的影响。结果发现不同的
辅助底物对反应影响有较明显的差别（表 =）。尽管
以 ">丙醇和环己醇为辅助底物时反应的摩尔转化率
较高，但是产物的光学纯度均低于对照组的光学纯
度。而添加其余 = 种辅助底物能够增强反应的立体
选择性，其中以 <>己醇为辅助底物时，产物的光学纯
度最高（?@ !AB ! ! ! !），而且反应的摩尔转化率达到
CC !?B。因此认为正己醇为最适辅助底物。
表 = 不同辅助底物对还原反应的影响
D-E.( = &’’()* +’ )+>F5EF*/-*(F +, *3( /(45)*$+,
辅助底物 摩尔转化率 G B 立体选择性 ! ! ! ! G B
,+,( H< !" " C@ !A
(*3-,+. C= !? " CH !H
">I/+I-,+. CC !< " =? !=
">E5*-,+. C@ != " ?@ !C
<>3(J-,+. CC !? " ?@ !A
)K).+3(J-,+. ?" !C " H" !A
" !H 固定化细胞热处理的影响
酵母细胞通过热处理后，往往能改善反应的立
体选择性［H］。本实验将固定化细胞浸泡在 D/$F>;0.
缓冲溶液（@ !< L+. G M，I;C !@）中，在不同水浴温度下
处理 "@ L$,，取出固定化细胞，用定性滤纸吸干表面
水分，然后用于催化还原反应。结果如图 = 所示，发
现经过热处理后，反应的立体选择性增强。处理温
度为 H@ N时，得到产物（ "）>0;2& 的对映体过量值
达到 <@@B。可能是细胞中的 # 型酶几乎完全失
活，" 型酶仍有活力，但是细胞中大部分酶因高温而
失活，产物的摩尔转化率大幅下降。
!$!摩尔转化率；!%! ! ! ! !
图 = 固定化细胞的热处理对还原反应的影响
#$% != &’’()* +’ 3(-* */(-*L(,* +’ $LL+E$.$O(4 )(..F +, *3( /(45)*$+,
" !C 抑制剂对还原反应的影响
在生物催化羰基化合物不对称还原的反应中，
添加适当的抑制剂能够提高反应的立体选择性，其
中烯丙醇和烯丙基溴是比较常用的选择性抑制
剂［

摩尔转化率和产物光学纯度的影响。结果发现，添
加烯丙醇能改善反应的立体选择性，产物（ "）>0;2&
的对映体过量从 ?@ !HB提高到了 ?C !@B（表 P），认
为产生这个结果的原因是假丝酵母细胞中 # 型酶
受抑制的程度要高于 " 型酶。而烯丙基溴则对产物
（ "）>0;2&光学纯度的产生负影响，并且相同浓度
下，烯丙基溴的毒性要大于烯丙醇。另外，从表 P 中
可知，抑制剂浓度变化对反应的摩尔转化率的影响
要大于产物的光学纯度，浓度越高对反应的抑制越
明显。
表 P 抑制剂对还原反应的影响
D-E.( P &’’()* +’ $,3$E$*+/F +, *3( /(45)*$+,
$（抑制剂）G
（L+. G M）
摩尔转化率 G
B
立体选择性
! ! ! ! G
B
,+,( CC !? " ?@ !H
-..K. -.)+3+.（@ !< L+. G M） C< !< " ?H !"
-..K. -.)+3+.（@ !" L+. G M） H< !6 " ?C !@
-..K. E/+L$4(（@ !< L+. G M） C" !< " C? !@
-..K. E/+L$4(（@ !" L+. G M） P6 !@ " CH !P
! 结 论
实验发现所筛选的酵母菌均有还原羰基酯的能
·"H· 生物加工过程 第 = 卷第 P 期
万方数据
力，而且所得的产物均为 ! 型。其中一株假丝酵母
的立体选择性和还原能力相对较高，将此菌株的细
胞固定化细胞作为研究对象，考察了多种因素对反
应的摩尔转化率和产物（ !）!"#$% 光学纯度的影
响。结果发现，固定化时所用缓冲液的 &#值 ’ () 和
固定化细胞颗粒平均直径为 * (+ ,,较适合；以正己
烷为反应介质对反应有 利；初 始 底 物 浓 度 以
+- (’ ,,./ 0 1为宜；辅助底物以 2!己醇为佳。在上述
条件下反应的摩尔转化率和对映体过量值分别为
’’ (34和 3) (54。对固定化细胞的热处理和添加抑
制剂烯丙醇能够改善产物的光学纯度，但是摩尔转
化率降低。
参考文献：
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