全 文 :第7卷第3期
2009年5月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.7No.3
May2009
收稿日期:2008-05-13
基金项目:福建省科技计划重点资助项目(2008N0120);泉州市科技计划重点资助项目(2006G05)
作者简介:肖美添(1968—),男,福建泉州人,博士,副教授,研究方向:生物催化与生物合成,Email:mtxiao@hqu.edu.cn
重组基因工程菌在不对称还原羰基化合物中的应用
肖美添1,2,张亚武2,黄雅燕2,叶 静2
(1.华侨大学 福建省高校工业生物技术重点实验室,厦门 361021;
2.华侨大学 化工学院,厦门 361021)
摘 要:手性醇是药物合成的重要手性砌块,利用生物催化剂不对称还原羰基化合物是手性醇制备的重要方法。
介绍了生物催化还原羰基化合物的反应原理及特点,综述了重组基因工程菌的构建及其在不对称还原羰基化合物
中的应用情况,展望了今后研究发展的方向。
关键词:重组基因工程菌;不对称还原;生物转化;羰基化合物
中图分类号:TQ4603 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2009)03-0001-08
Applicationofrecombinantgeneticengineeringstrainsinasymmetric
reductionofcarbonylcompounds
XIAOMeitian1,2,ZHANGYawu2,HUANGYayan2,YEJing2
(1.KeyLaboratoryforIndustrialBiotechnologyofFujianProvince,HuaqiaoUniversity,Xiamen361021,China;
2.InstituteofChemicalEngineering,HuaqiaoUniversity,Xiamen361021,China)
Abstract:Chiralalcoholsareimportantbuildingblocksfordrugsynthesis.Theasymmetricreductionof
carbonylcompoundswithbiocatalystsisanimportantmethodforproducingchiralalcohols.Thereaction
mechanismandcharacteristicsofasymmetricreductionofcarbonylcompoundswiththebiocatalystswere
presented.Theconstructionofrecombinantgeneticengineeringstrainsandtheirpracticalapplicationsin
theasymmetricreductionofcarbonylcompoundswerereviewed.Theprospectiveofasymmetricreduction
withrecombinantstrainswasalsopointedout.
Key words:recombinantgenetic engineering strain; asymmetric reduction; biotransformation;
carbonylcompound
近年来含手性中心的药物、农药及其他精细化学
品,在日常生活和工农业生产中的作用越来越受到人
们的重视[1]。单一手性药物的生产和销售年均增长
率达到13%,2008年全球销售额约2000亿美元[2]。
羰基化合物的不对称还原是生产手性药物中间体的
重要方法。生物法催化羰基化合物的不对称还原反
应具有高度的化学、区域和立体选择性,其催化剂主
要包括酶、微生物、植物细胞等,这一反应在手性药物
制备中得到了广泛应用,是生物催化与生物合成领域
最活跃的研究方向之一[3]。随着现代生物工程的迅
速发展,利用基因工程技术构建高效的重组基因工程
菌,可以克服完整细胞催化还原羰基化合物时存在产
率和立体选择性低,或用纯酶催化还原时辅酶再生困
难等缺陷。
1 生物催化还原羰基化合物的反应原
理及优缺点
11 生物催化还原羰基化合物的反应原理
生物催化羰基化合物的不对称还原主要是在
醇脱氢酶和其他氧化还原酶作用下进行的。微生
物产生的能够还原羰基化合物的酶主要属于醛酮
还原酶系[4-5],醛酮还原酶系中的大部分酶都可以
代谢大量底物。
反应由还原型辅酶 NAD(P)H提供氢,在氧化
还原酶的作用下从 re或 si面进攻羰基生成相应的
单一对映体,同时辅酶被转化成氧化型 NAD(P)+。
反应机理如图1所示,E1和E2酶从si面进攻而E3
和E4酶从re面进攻,理论上可以得到4种立体结
构[6]。为了使反应一直进行下去,需要不断地补充
还原型辅酶NAD(P)H或利用辅酶再生系统来补充
还原型辅酶 NAD(P)H。常见的例子有:假单胞菌
和乳酸杆菌醇脱氢酶属于酶E1,白地霉甘油脱氢酶
和毛霉菌二羟基丙酮还原酶属于酶E2,而酵母和马
肝醇脱氢酶属于酶E3。
(S:小基团,L:大基团)
图1 生物还原羰基的模型图
Fig.1 Stereochemistryofbioreductionof
carbonylsubstrate
12 生物催化还原羰基化合物的优缺点
生物催化与化学催化方法相比具有的优势:酶
对底物严格的专一性识别使其具有很高的立体、区
域和化学选择性;生物催化效率高,反应条件温和;
某些酶或微生物来源方便、价格低廉;酶或微生物
使用后在环境中容易降解,不污染环境。
生物催化羰基的不对称还原通常使用全细胞
和纯酶催化2种形式,这两种催化形式都存在不足
之处。使用全细胞催化时,细胞内可能有多种酶能
催化底物使其生成不同类型或不同对映异构体的
产物,降低反应的收率或立体选择性。全细胞反应
体系通常是在成分复杂的培养液中进行,为了保持细
胞的活性,底物浓度一般比较低,这使得产物的分离
变得烦琐。本课题组曾筛选了对苯乙酮酸具有高转
化率和立体选择性的酵母菌株FD11b,在30L生物反
应器中催化还原反应49h,实现底物转化率达
995%,产物R 扁桃酸浓度可达125mmol/L,对映体
过量(e.e.)值为973%[7-8]。虽然这是目前生物法合
成单构型R()扁桃酸的较高水平,但工业放大仍
然需要进一步提高酵母菌株的转化活性和对底物、产
物的耐受性。
使用纯化酶催化时,需要对酶进行分离纯化和
考虑酶在非生理环境中催化时变性和失活的问题,
同时氧化还原酶催化羰基的还原,需要添加还原型
辅酶NAD(P)H提供电子,这些辅酶价格昂贵且再
生困难。辅酶再生的方法主要包括:酶催化再生、
电催化再生和光化学再生。虽然现在认为再生辅
酶NADH最好的办法是利用甲酸脱氢酶(FDH)催
化甲酸氧化为 CO2使其再生
[9],但还有许多实际问
题需要解决,而且催化这类反应的许多酶只能由
NAD(P)H作辅酶,对于该辅酶的胞外再生还没有
较好的方法。生物催化法应用于实际生产中也存
在一些很复杂的问题,如工程放大困难、生物细胞
培养需要空间较大、生产的时空收率较低、有些反
应的稳定性较差等。
2 用于生物催化还原的重组基因工程菌
利用重组DNA技术可构建只表达单一目的酶
基因或共表达2个目标酶基因的新型生物还原体
系,用此体系催化还原羰基化合物,可克服上述存
在缺点。Rodriguez等[10]将面包酵母内的 2种酶
Gcy1和Gre3的基因导入大肠杆菌中构建基因工程
菌,以此基因工程菌还原4种 β 酮酯产生 S 羟酯
的光学纯度(e.e.值)≥90%;还原4种α位有取代基
的β酮酯转化为 Syn (2R,3S)型醇的光学纯度
(e.e.值)≥98%。构建重组细胞生物还原体系的基
本要素包括:1)羰基还原酶及其基因;2)辅酶再生
酶及其基因;3)共表达2种酶基因的宿主细胞。大
肠杆菌中无内源羰基还原酶,可将大肠杆菌作为宿
主细胞。典型的还原体系是将羰基还原酶基因和
葡萄糖脱氢酶基因导入大肠杆菌后,共表达催化羰
基化合物不对称还原反应(图2)。构建共表达重组
基因工程菌有2种不同的表达系统:一是将不同目
标基因在同一质粒中串联(tandemsystem);二是将
不同目的基因分别构建不同的质粒,然后导入同一
2 生 物 加 工 过 程 第7卷
大肠杆菌表达(twoplasmidsystem)。如 Ema等[11]
将来自面包酵母的羰基还原酶(SCR)和葡萄糖脱氢
酶(GDH)共构建2种不同的表达体系,SCR在后者
的体系中比前者催化还原羰基化合物更有效。
图2 SCR和GDH在大肠杆菌内
共表达还原生产手性醇体系
Fig.2 Bioreductionsystemfortheproductionofchiral
alcoholsbyanE.colitransformantcoexpress
ingSCRandGDHgenes
近年来,生物技术的新方法又为进一步拓展生
物催化方法在手性合成中的应用提供了手段。其
中最突出的是建立在 PCR、重组 DNA、高通量筛选
等技术基础上的定向进化方法(directedevolu
tion)[12]。运用定点突变、易错 PCR、DNA重排
(DNAshufling)等技术从单一或少量母体基因出
发,构筑多样性的基因库,再用高通量筛选方法筛
选出所需基因。短短几年,定向进化方法已取得了
很大进展,筛选出很多与母体性能迥异的新酶,有
的适合于在极端环境中反应[13],有的底物适应性发
生改变[14],有的甚至改变了反应类型[15]。
基因重组菌株的构建也可以与基因突变技术
结合使用。Makino等[16]将苯乙醛还原酶(PAR)菌
株进行诱导突变,筛选出优良菌株,然后将不同优
势的突变菌株基因组合在同一质粒中,再将其导入
大肠杆菌中表达,得到的重组PAR细胞可适应高浓
度底物体系的反应,催化效率更高。
3 重组基因工程菌在不对称还原羰基
化合物中的应用
根据底物类型不同,其还原反应所遵循的规律
不同,所得到的产物构型也不同。下面按反应的类
型分别进行介绍。
31 简单酮的还原
酶和微生物细胞能催化简单酮中羰基的不对
称还原。在催化脂肪酮和芳香酮的羰基不对称还
原反应时通常遵循 Prelog规则,生成相应的具有较
高对映体过量值的S醇。
311 还原脂肪酮
这类反应最先使用面包酵母催化,通常得到的
是具有较高对映体过量值的(S)构型的醇。多数
长链脂肪酮不能被其催化还原,只有长链甲基酮才
能被还原,且反应的难易程度和光学选择性与羰基
连接的基团有关[17]。这类反应使用面包酵母催化
已较为成熟,利用重组菌催化的研究较少。
312 还原芳香酮
Wang等[18]最先从 Corynebacteriumsp.ST 10
得到苯乙醛还原酶(PAR)完整的 DNA和蛋白质序
列,克隆PAR基因并导入E.coli中表达催化还原苯
乙醛。重组的 PAR细胞酶活是 Corynebacterium细
胞的10倍。Weckbecker等[19]将吡啶核苷酸转氢酶
(PNT)、醇脱氢酶(ADH)和FDH基因在E.coli中共
表达,并用完整细胞催化苯乙酮合成(R)苯乙醇,
反应12h底物转化率为 660%,反应体系中利用
PNT与FDH耦联进行辅酶再生循环。
许娜等[20-21]以近平滑假丝酵母基因组为模板,
利用PCR技术得到目的基因rcr,将该基因与表达载
体pET21c连接后构建重组质粒pETRCR,并转化入
EcoliBL21(DE3)中进行表达。重组大肠杆菌具有
(R)专一性羰基还原酶活性,可催化不对称还原2
羟基苯乙酮合成(R)苯基乙二醇,产物光学纯度
(e.e.)为955%,产率为926%。Itoh等[22]将苯乙醛
还原酶(PAR)基因导入大肠杆菌进行表达,重组PAR
细胞催化几种芳香酮的结果见表1。
32 还原含卤素的羰基化合物
含有卤素的手性醇因含有较活泼的卤素官能团,
是药物合成的重要手性砌块,通过生物催化合成这类
手性物质的研究一直比较活跃。利用重组菌株不对
称还原含卤素的羰基化合物研究最多的是还原4 氯
乙酰乙酸乙酯(COBE)合成 4 氯 3羟基丁酸酯
(CHBE)。CHBE是一种重要的有机中间体,其手性
单一对映异构体(R)和(S) CHBE均是重要的手性
砌块。(R) CHBE可用于合成L 肉碱[23]和()大
内酰亚胺[24],(S) CHBE则是选择性合成Slagenins
B和 C[25]以及他汀类药物———羟甲基戊二酰 CoA
(HMG CoA)还原酶抑制剂[26]的关键手性中间体。
对于对映体(R) CHBE,Kataoka等[27-28]将重组
E.coliJM109细胞用于催化COBE的不对称还原,反
3 第3期 肖美添等:重组基因工程菌在不对称还原羰基化合物中的应用
应过程中定时添加适量的辅酶NADP、GDH和葡萄糖
以及流加底物。结果在水/乙酸正丁酯两相体系中,
有机相产物质量浓度积累可以达到255g/L,产物的
光学纯度为910% e.e.,转化率为911%。NADP对
产物(R) CHBE的转换数为5130mol/mol。他们还
将SCR和GDH在大肠杆菌中共表达,催化还原得到
产物的摩尔转化率和光学纯度分别为 941%和
917%,NADP对产物的转换数为13500mol/mol[29]。
Yamamoto等[30]利用异丙醇作辅助底物,将表达醇脱
氢酶(Candidaparasilosis)的大肠杆菌重组细胞催化
合成(R) CHBE,底物转化率为952%,产物光学纯
度大于990%。
表1 重组PAR细胞催化还原几种芳香酮
Table1 Reductionofaromaticketonesbyrecombinant
PARcels
底物 相对 活性/% 产物 e.e./% 构型
100 96 R
546 >99 S
258 >99 R
744 >99 S
70 >99 S
对于另一个对映体(S) CHBE,Yasohara
等[31-32]分别构建表达单一酶基因和共表达 SCR与
GDH的重组细胞,结果显示在水相体系中产物(S)
CHBE质量浓度积累可达208g/L,在水/有机溶剂两
相体系中,产物在有机相中的质量浓度达到了
430g/L,所得产物的光学纯度均为100%,NADP对
产物(S) CHBE的转换数为216000mol/mol。显
然,共表达的基因工程菌的还原能力和反应效率得到
了显著提高。Yamamoto等[33]用共表达SCR和GDH
的大肠杆菌作为催化剂,立体选择性还原COBE得到
产物e.e.值为998%的产物。此外,值得关注的是,将
共表达了FDH和二元醇脱氢酶(PfODH)基因的大肠
杆菌细胞作为生物催化剂,用于催化COBE的不对称
还原[34]。反应体系中转化率和e.e.值分别为985%
和990%。以甲酸为氢供体的优点是甲酸脱氢后的
产物为CO2,对催化剂无毒害和抑制作用,而且很容
易从反应体系中除去,可以确保脱氢反应为不可逆反
应,从而使辅酶顺利完成再生循环(图3)。国内敬科
举等[35]从赭色掷孢酵母(Sporobolomycessalmonicolor
ZJU0105)中克隆出NADPH依赖型醛基还原酶基因,
构建了重组大肠杆菌E.coliBL21,用于催化COBE的
不对称合成(R) CHBE,但必须外加辅酶及辅酶再生
系统。而利用基因工程菌催化合成另一对映体(S)
CHBE的研究在国内尚未报道。
Itoh等[22]将PAR基因导入大肠杆菌表达还原
含溴的羰基化合物得到(R)醇,e.e.值 >984%(图
4a)。Ema等[11]用重组SCR和 GDH的大肠杆菌细
胞还原酮得到了含氟(S)醇转化率和e.e.值分别为
660%和>990% (图4b)。
33 还原含氮的酮
Itoh等[22]利用基因工程菌对含氮杂环酮进行
了还原。从 Corynebacterium菌株 ST10得到 PAR,
PAR基因在大肠杆菌中表达还原NBoc3pyrolidi
none得到相应的(S)醇,此反应转化率 >860%
(51g/L),e.e.值>990%,反应如图5所示。
图3 共表达PfODH和FDH的大肠杆菌催化COBE的不对称还原
Fig.3 AsymmetricreductionofCOBEbyrecombinantE.colicoexpressingPfODHandFDH
4 生 物 加 工 过 程 第7卷
图4 含Br和F羰基化合物的还原
Fig.4 ReductionofBrorFcarbonylcompounds
Ema等[11]用重组 SCR和 GDH的大肠杆菌细
胞还原酮得到(S)醇(图6(a))的产率和e.e.值分别
为520%和 >990%。Itoh等[22]将苯乙醛还原酶
(PAR)基因导入大肠杆菌进行表达还原酮得到
(S)醇(图6(b))的e.e.值>990%。
图5 重组细胞还原NBoc3pyrrolidinone
Fig.5 ReductionofNBoc3pyrrolidinonebyrecombinantE.coli
图6 含N羰基化合物的还原
Fig.6 ReductionofNcarbonylcompounds
图7 β 酮酯的不对称还原
Fig.7 Asymmetricreductionofβketoester
34 还原含硫的羰基化合物
重组菌可催化含有硫醚、砜、亚砜等酮类化合
物的不对称还原反应,得到具有手性中心的醇。这
些含硫官能团很容易通过化学方法进行改造,在构
造手性大分子中非常有用,因而含这类官能团的手
性化合物受到广泛关注。Wada等[36]克隆并表达菌
株Exiguobacteriumsp.F42的还原酶基因,还原eth
yl3oxo3(2thienyl)propanoate(KEES)得到ethyl
(S)3hydroxy3(2thienyl)propanoate(S HE
ES),S HEES是合成盐酸度洛西汀(S duloxe
tine)的重要中间体。
35 β 酮酯的还原
重组细胞能催化大多数β酮酯的羰基还原反应,
生成R 或S型的羟基酯,光学纯度的高低很大程度
上取决于底物上连接酯和羰基的基团,生成的产物是
合成手性内酰胺类抗生素和昆虫信息素的重要前体,
因而这类反应是当前研究比较活跃的领域[37]。在催
化还原α 烷基取代β酮酯时可以获得2个手性中心
的化合物,这类反应可以获得比较高的非对映体选择
性,同时对映体的光学纯度也比较高。
Rodriguez等[38-39]用重组基因的方法对一些
β酮酯的还原做了深入研究,还原过程如图 7所
5 第3期 肖美添等:重组基因工程菌在不对称还原羰基化合物中的应用
示,得到对映体和非对映体e.e.值和 d.e.值分别
>980%和 >980%,说明利用基因重组技术可有
效改善细胞的催化能力。
36 二酮的还原
环状二酮能被重组菌不对称还原,如图 8所
示[40],其产物具有2个手性中心,1个来自羰基的
不对称还原,另1个来自前手性四面体碳中心。非
对映异构体的手性与对映异构体的选择主要由 R
基团和环的大小决定,由于空间位阻的原因,2个羰
基中只有1个能被还原。这类产物是合成天然产物
的重要手性单元。与环状二酮不同的是直链二酮
中的2个羰基均能被酵母不对称催化还原,直链二
酮先被还原为羟基酮(图9)[11-22],若延长反应时间
或改变反应条件能生成相应的二醇。
图8 环状二酮的不对称还原
Fig.8 Asymmetricreductionofcyclicdiketones
图9 直链二酮的不对称还原
Fig.9 Asymmetricreductionofstraightdiketones
4 展 望
从上述可以看出构建重组菌株催化不对称还
原具有独特的长处,重组菌株催化前手性羰基化合
物的不对称还原是很有前景的发展方向,但还有许
多问题需要进一步研究。利用构建基因工程菌来
提高许多重要反应的时空转化率、底物和产物的耐
受性,以便实现从实验室走向产业化。这包括:生
物催化羰基化合物不对称还原的作用机理需进一
步研究,以便指导新型生物催化剂的构建;利用基
因工程菌与传统的添加抑制剂、预处理等方法结合
在一起,将更有利于反应过程立体选择性的控制;
加快和深入这类反应的工艺和工程问题的研究,使
更多的反应能应用于工业生产。目前在国内利用
基因重组技术改善对羰基化合物不对称还原的研
究还很少,所以必须加快发展,为手性药物和手性
药物中间体以及其他手性精细化学品的研发提供
重要的技术资料。
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国外动态
一见钟情可能存在并且由基因决定
美国康奈尔大学研究人员在《遗传学》上发表论文,报导他们利用果蝇研究得出的结论:一见钟情可能
真实存在并且由基因决定。这一结论可能同样适用于包括人类在内的哺乳动物。
研究人员用一组雌性果蝇分别与一组同种类雄性果蝇和一组不同种类雄性果蝇交配。结果发现:当雌
性果蝇与不同种类雄性果蝇交配时,它们似乎可以识别,后者与同类雄性果蝇相比,在基因上与它们更加契
合。原因可能是雌性果蝇与不同种类雄性果蝇交配产生的后代更不易因近亲繁殖出现基因缺陷,产卵数量
更多,成活率更高。
这项研究表明,雌性果蝇在一定程度上与雄性果蝇见第一面时,就能确定对方是否为“好伴侣”。如果
答案为“是”,雌性果蝇随后会发生生理反应,以提高繁殖成功率。
研究发起人之一安德鲁·克拉克说:“你可以称这种现象为‘一见钟情’,这样描述更准确,因为我们眼下
尚不清楚是哪方面特征让雌性果蝇作出判断。”他解释说,这可能是视觉、嗅觉、听觉或其他感觉。
研究人员说,研究结果可能同样适用于包括人类在内的哺乳动物。女性有可能分辨出哪些男性与她在
基因上更适合,从而身体作出反应,提高繁殖成功率。但由于果蝇与人类繁殖方式差别较大,尚无法直接把
实验结论应用于人类。
未来化工增长有赖“白色”生物技术
全球领先的咨询公司麦凯锡(McKinsey&Co)日前发布预测报告,报告显示:工业生物技术,即“白色”
生物技术衍生产品的加快发展,将使其到2012年占全球化学工业总销售额的9%,而石油化工基产品的创
新和增长将减退。
麦凯锡公司指出,“白色”生物技术大量应用于商业化规模生产将使其营业收入快速增长,2007年为
1000亿欧元(占化学工业总营业收入的6%),预计到2012年将达到1530亿欧元。
(朱宏阳)
8 生 物 加 工 过 程 第7卷