全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
-:@CE0E]BHFC,.BDY@B1FBIE00TCJ@CEEF@CJ
bB.2! +B2#
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GB@"&%2(/*/6_2@00C2&*$ =(*!2$%&%2%#2%%)
收稿日期"$%%/ =%/ =$)
基金项目"上海市高校选拔优秀青年教师科研专项基金资助项目#0.J%!%(%$
作者简介"曹"慧#&/*&$女江苏盐城人博士讲师研究方向"功能性配料及添加剂TRA,@."I,B:H@,CcK,:BB2IBA2IC
$5,6盐析提取酶解液中
!
型胶原的工艺
曹"慧&许时婴$
#&2上海理工大学 医疗器械与食品学院上海 $%%%/(%$2江南大学 食品学院无锡 $&#%(*$
摘"要"采用响应面分析法对酶解液中
!
型胶原的盐析条件进行优化并通过 Q3QR;5OT电泳及圆二色谱对其纯度和
结构进行鉴定( 结果表明"酶解液中
!
型胶原的最佳盐析条件为+,-.浓度 (d) AB.6V)$$d( e)(&d%! :在此条件下
!
型胶原回收率为 /%d!!i%采用盐析法从酶解液中制备的
!
型胶原具有较高纯度并保持着完整的 (股螺旋结构(
关键词"
!
型胶原%盐析%酶解液
中图分类号"7)&$ ld*""""文献标志码"5""""文章编号"&*$ =(*!#$%&%$%# =%%$$ =%)
!56FV23F7240[F45:F./;FA90)):265;0/742G0/HAG0-AI426A15F0
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SWQ:@RK@CJ
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#&2` EG@I,.TXH@1AEC?,CG UBBG MC0?@?H?E Q:,CJ:,@WC@\EF0@?KBDQI@ECIE,CG fEI:CB.BJK Q:,CJ:,@$%%%/( -:@C,%
$2QI:BB.BDUBBG QI@ECIE,CG fEI:CB.BJK ]@,CJC,C WC@\EF0@?K [H @^$&#%(* -:@C,$
*J1F45:F"aE01BC0E0HFD,IEAE?:BGB.BJKZ,0H0EG ?BB1?@A@9E?EI:CB.BJKBD0,.?RBH?BD?K1EMIB.,JEC
DFBAEC9KA,?@I:KGFB.K0,?E2Q3QR;5OT,CG I@FIH.,FG@I:FB@0AZEFEH0EG ?BGE?EFA@CE?:E1HF@?K,CG ?:E
0?FHI?HFEBD?K1EMIB.,JEC2f:EFE0H.?00:BZEG ?:,??:EB1?@AHA1,F,AE?EF0DBF+,-.0,.?@CJBH?ZEFE,0
DB.BZ0"E^?F,I?@BC ?@AE(&d%! : +,-.IBCIEC?F,?@BC (d) AB.6V ?EA1EF,?HFE$$d( e ,CG ?:EFEIB\EFK
F,?@B/%d!!i2fK1EMIB.,JEC Z@?: 0,.?@CJRBH?AE?:BGB.BJK@0E00EC?@,.KDFEEDFBA IBC?,A@C,?@CJ
1FB?E@C0,CG hEE10I:,F,I?EF@0?@IBD?F@1.E:E.@I,.IBCDBFA,?@BC2
K0A L24I1"?K1EMIB.,JEC% 0,.?RBH?% EC9KA,?@I:KGFB.K0,?E
""胶原是具有独特结构的一类蛋白质它广泛存在
于动物组织中其中
!
型胶原主要由 (条相同的
"
&
#
!
$
链以 (股螺旋的结构方式构成软骨该结构具有维持
关节软骨形态结构和抵抗张力强度的功能*&+( 近年
来随着对
!
型胶原研究的不断深入它在医学领域)美
容业和食品工业中的应用也越来越广泛已被认为是
一种性能优异)开发价值很高的天然生物物质*$ =(+(
""目前依据提取介质的不同
!
型胶原的制备
方法可分为酸法)碱法)酶法)中性盐法以及热水抽
提法等*#+ ( 其中酶法因不会破坏胶原的结构)产物
的理化性质稳定)提取条件温和)所需设备简单以
及反应速率快等特点而被广泛应用( 但采用酶法
提取
!
型胶原时提取物中可能含有大量杂质给
!
型胶原的分离纯化带来困难而应用+,-.分别沉
淀胶原的提取方法是保持胶原不变性状态下制备
各类胶原的最有效的手段*)+ ( 软骨是肉制品加工
企业的下脚料含有丰富的
!
型胶原( 因此本实
验采用+,-.分别沉淀法从软骨酶解液中制备
!
型
胶原并以回收率为指标通过响应面分析确定最
佳的工艺条件( 这既保证了高附加值产品的提取
也减少了环境的污染对研究和开发
!
型胶原具有
重要的理论和实际意义(
D?材料与方法
D=D?材料与仪器
""鸡胸软骨内蒙古草原兴发集团%
!
型胶原标
准品Q@JA,公司%胃蛋白酶#T-(2#2$(2&$Q@JA,
公司%其余化学试剂#分析纯$国药集团化学试剂
有限公司(
""VO] &%% 型真空冷冻干燥机北京四环科学仪
器厂%-V$% Y型冷冻离心机上海安亭科学仪器厂%
] &)圆二色光谱仪#],0IB$日本分光株式会社(
D=B?实验方法
&2$2&"
!
型胶原酶解液的制备
""按照实验室前期的研究结果和文献**+的方法
制备
!
型胶原的胃蛋白酶酶解液(
&2$2$"
!
型胶原蛋白浓度的测定方法
""羟脯氨酸的测定"将试样置于水解管中加入
* AB.6V4-.真空封管&&% e水解 $# :蒸干4-.稀
释定容得水解液按文献*+的方法采用[BE00CEF
#
法测定水解液中羟脯氨酸质量分数计算公式#&$"
""I#胶原$ mI#羟脯氨酸$6&#d# j&%%i #&$
&2$2("最佳盐析条件的确定
""在酶解后的上清液中直接加入 +,-.固体进行
盐析研究+,-.浓度#&)$)()#)) AB.6V$)盐析温度
##)&%)$%)(% e$及处理时间#&$)$#)(*)#! :$对
!
型胶原回收率的影响( 采用 3E0@JCRT^1EF?软件的
方差分析和响应面分析法确定盐析的最适条件得
到公式#$$"
""回收率mI#盐析后
!
型胶原$6I#盐析前
!
型
胶原$ j&%%i #$$
&2$2#"
!
型胶原结构的鉴定
""Q3QR;5OT电泳"采用 fF@0RO.K不连续分离系
统( 分离胶原质量浓度为 !% J6V浓缩胶原质量浓
度为 )% J6V(
""圆二色谱分析"
!
型胶原试样质量浓度
$%
"
J6AV液池厚度 &AA扫描范围 &/% k$)% CA
扫描速度 &%% CA6A@C积聚 *响应度 %d) 0分辨率
%d$ CA狭缝宽度 &d% CA(
B?结果与讨论
B=D?盐析温度对
!
型胶原回收率的影响
""在
!
型胶原的酶解液中加入研磨后的 +,-.固
体颗粒终浓度为 ( AB.6V分别在 #)&%)$%)(% e下
盐析 $# :( 盐析后测定产物中
!
型胶原的含量计
算
!
型胶原的回收率( 结果如图 & 所示(
图 D?温度对
!
型胶原回收率的影响
N.;=D?#70:F127F0G9045F3402/40:2Z04A 45F.2 27
FA90)):265;0/1263F.2/
""从图 & 可以看出"盐析时
!
型胶原的回收率随
温度的升高而增大%但当温度升高到 $% e后
!
型
胶原的回收率呈下降的趋势( 这表明在较高的温
度下
!
型胶原发生了部分变性使回收率下降因
此选择最适盐析温度为 $% e(
B=B?盐析时间对
!
型胶原回收率的影响
""在
!
型胶原的酶解液中加入研磨后的 +,-.固
体颗粒终浓度为 ( AB.6V$% e下分别盐析 &$)$#)
(*)#! :( 盐析后测定产物中
!
型胶原的含量计算
!
型胶原的回收率结果见图 $(
图 B?盐析时间对
!
型胶原回收率的影响
N.;=B?#70:F127F.G02/40:2Z04A 45F.2 27
FA90)):265;0/1263F.2/
""由图 $ 可知"盐析时
!
型胶原的回收率随时间
的延长而增大( 在盐析时间较短时
!
型胶原的回
收率随盐析时间的延长而增大且增长的较快%盐
析时间超过 (* :后
!
型胶原的回收率增长变得缓
慢( 这可能是由于
!
型胶原的回收率增大到一定
值后溶液中
!
型胶原的浓度已经降低到一定程
度再增加盐析时间
!
型胶原的回收率也不会有
明显的增加( 因此选择盐析时间为 (* :(
($"第 # 期 曹"慧等"+,-.盐析提取酶解液中
!
型胶原的工艺
B=M?$5,6浓度对
!
型胶原回收率的影响
""在
!
型胶原的酶解液中加入研磨后的 +,-.固
体颗粒终浓度分别为 &)$)()#)) AB.6V$% e下盐
析 (* :( 盐析后测定产物中
!
型胶原的含量计算
!
型胶原的回收率结果见图 ((
图 M?$5,6浓度对
!
型胶原回收率的影响
N.;=M?#70:F127$5,6:2/:0/F45F.2/2/40:2Z04A
45F.2 27FA90)):265;0/1263F.2/
""由图 ( 可知"盐析时
!
型胶原的回收率随 +,-.
浓度的增大而增大( +,-.浓度较低时
!
型胶原回
收率随+,-.浓度的增大而增长较快+,-.浓度超
过 ( AB.6V后
!
型胶原的回收率增长缓慢( 这可
能是由于+,-.浓度较低时盐析速度随溶液中盐离
子浓度的增大而增大因此随着+,-.浓度的增加
!
型胶原的回收率也会增加%当溶液中盐离子浓度
增大到一定程度而接近于饱和状态后再增加 +,-.
浓度
!
型胶原的回收率也不会有明显的增加( 实
际上 +,-.按照 # AB.6V加入时已经达到饱和
) AB.6V盐析后沉淀中含有少量 +,-.颗粒因 +,-.
浓度过高可能会影响胶原蛋白的活性综合考虑
选择盐析浓度为 ( AB.6V(
B=@?
!
型胶原盐析工艺的响应面分析
""选定盐析温度#D
&
$)+,-.浓度#D
$
$及盐析时间
#D
(
$作为主要因素以
!
型胶原回收率#F$为响应指标
设计正交试验确定最佳盐析条件#表 &$结果见表 $(
表 D?盐析实验S]#M$ @因素水平
E5J60D?N5:F2415/I60Z04127156FV23F`124F-2;2/56
0[904.G0/F
水平
因素
盐析温度6
e
)#+,-.$6
#AB.!V
=&
$
盐析时间6
:
=& &% $ &$
"% $% ( $#
"& (% # (*
表 B?响应面分析设计及试验结果
E5J60B?W42;45G5/I0[904.G0/F5640136F127
40192/1013475:0G0F-2I262;A
序号 盐析温度6
e
)#+,-.$6
#AB.!V
=&
$
盐析时间6
:
FJK
& (% $ $# #&d##
$ (% # $# */d#(
( $% $ $# )&d!*
# $% # $# !%d#%
) &% $ &$ )!d**
* &% $ (* )%d*
&% # &$ (/d%)
! &% # (* /%d$!
/ (% ( &$ ()d/
&% $% ( &$ &d&)
&& (% ( (* *$d%/
&$ $% ( (* )d$!
&( &% ( $# !(d*&
&# &% ( $# !)d*
&) &% ( $# !!d#(
""表 ( 为响应面二次模型方差分析结果( 从表 (
中可以看出模型 B值为 /d!%表明该模型高度显
著#t%d%)表明总体上模型因素水平项显著( 由
统计学计算得出模型的确定系数值为 %d/#* (说
明方程的因变量与全体自变量间线性关系明显%模
型的变异系数值为 %d&$ !i说明模型的精密度
好( 综合以上各参数表明"该试验方法可靠各因
素水平区间设计合理因此可用该回归模型代替试
验真实点对试验结果进行分析( 回归模型各项的
方差分析#表 ($结果还表明"D
(
)D
&
)D
$
)D
(
$
)D
(
D
$
)
D
$
(
)D
&
$
)D
$
$项也均为显著项可判断出各具体试验
因子对响应值的影响呈非线性关系( 利用旋转试验
设计软件得到回归方程如下">m!)d/( l/d$$D
(
l
!d#D
&
l /d)*D
$
= )d))D
(
D
&
l &#d!D
(
D
$
l
%d&#D
&
D
$
=&$d/D
$
(
=&&d!!D
&
$
=&(dD
$
$
( 该方
程表达了盐析时
!
型胶原回收率与各因素之间的
变化规律(
#$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
表 M?响应面二次模型方差分析
E5J60M?*/56A1.127Z54.5/:072440192/1013475:0O35I45F.:G2I06
方差来源 平方和 自由度 方差 B值 概率# 显著性
模型 # !%)d!! / )((d// /d!% %d%&# &
!
时间#D
(
$
))d!( & ))d!( &(d!* %d%&/ %
!
温度#D
&
$
*&&d#) & *&&d#) &&d$$ %d%$( &
!
浓度#D
$
$
!%!d!$ & !%!d!$ &#d!# %d%&*
!
D
$
(
)#d#( & )#d#( &%d)# %d%$$ #
!
D
$
&
)*)d& & )*)d& &%d(! %d%(% *
!
D
$
$
*%$d(/ & *%$d(/ &&d%) %d%$% *
!
D
(
D
&
&$(d&% & &$(d&% $&& %d$%* )
D
(
D
$
!#d%/ & //*d() &#d/) %d%&& !
!
D
&
D
$
%d%* & %d%* %d%%& (! %d/&
残差 $$d)! ) )#d)$
总离差 *)(d%$ &#
""图 # 分别表示了+,-.浓度)盐析温度及盐析时
间对
!
型胶原回收率的影响( 利用 3E0@JCRT^1EF?
软件对响应面结果进行最优化分析确定+,-.的浓
度为 (d) AB.6V盐析时间 (&d%! :盐析温度
$$d( e时
!
型胶原的回收率为 /(d($i(
图 @?
!
型胶原盐析回收率的响应面分析
N.;=@?*/56A1.127FA90)):265;0/40:2Z04A 45F.2 JA 40192/1013475:0G0F-2I262;A
B=P?回归模型试验验证
""根据此优化组合进行试验得到
!
型胶原的实
际回收率为 /%d!!i实测值与预测值非常接近说
明应用该模型为盐析工艺提供指导是可行的(
B=Q?盐析后
!
型胶原纯度及结构的鉴定
$2*2&"Q3QR;5OT电泳
""采用了 Q3QR;5OT电泳鉴定
!
型胶原的纯度(
由图 ) 可知"
!
型胶原由 ( 条相同的
"
链构成因此
所有试样都出现了 $ 个条带为 & 条含量较高的
"
带和少量的
#
二聚体%经过盐析后的
!
型胶原与
Q@JA,公司标准
!
型胶原相比鸡胸软骨
!
型胶原
试样与 Q@JA,公司标准品的电泳谱带基本相同具
有很高的纯度( 因此可以文献*!+为标准确定所
制备的鸡胸软骨蛋白为
!
型胶原( 且图 ) 中无其他
杂带表明所提
!
型胶原纯度较高(
$2*2$"
!
型胶原的圆二色光谱
""由图 * 可知所有的胶原蛋白均在 $$&)&/! CA
处出现正吸收峰和负吸收峰为左旋聚脯氨酸
#;R
!
$构型肽链圆二色谱的典型特征*/+ 其二级结
构以
#
折叠和无规卷曲为主#表 #$(
)$"第 # 期 曹"慧等"+,-.盐析提取酶解液中
!
型胶原的工艺
&`标准蛋白%&&
!
型胶原标准品%
$&鸡胸软骨
!
型胶原
图 P?
!
型胶原电泳图谱
N.;=P?!\!VW*%#9427.6027FA90
!
:265;0/
图 Q?
!
型胶原的,\图谱
N.;=Q?,\190:F43G27FA90
!
:265;0/
表 @?
!
型胶原的二级结构组成
E5J60@?E-010:2/I54A 1F43:F34027FA90)):265;0/
试样
#
折叠率6i 无规卷曲率6i
!
型胶原 #*d) )(d)
M?结?论
""目前对
!
型胶原的提取方法仅适用于实验室
小样制备存在处理量小)过程复杂等问题而且没
有对提取过程中
!
型胶原 ( 股螺旋结构的保持进行
研究( 本文通过响应面分析确定酶解液中
!
型胶
原的最佳盐析条件在此条件下
!
型胶原回收率为
/%d!!i% 并采用 Q3QR;5OT及圆二色光谱对
!
型
胶原的结构进行测定结果表明"采用盐析法从酶
解液中制备的
!
型胶原具有较高的纯度且保持着
完整的 ( 股螺旋结构( 该方法的研究旨在开发一种
低成本)高产率)高纯度的
!
型胶原产品并为以鸡
胸软骨为原料进行工业化规模生产
!
型胶原提供
可靠数据(
参考文献"
*&+"陈静涛徐政顾其胜2胶原蛋白研发的最新进展*]+2上海生
物医学工程$%%#$)#$$")$R)*2
-:EC ]@CJ?,BSH P:ECJOH 7@0:ECJ2aE\@EZ0IB.,JEC 8@BA,?EF@R
,.00?,CG,FG ,11.@I,?@BC*]+2Q:,CJ:,@]BHFC,.BDY@BAEG@I,.TCJ@R
CEEF@CJ$%%#$)#$$" )$R)*2
*$+"彭燕豪叶春婷邹海燕等2猪软骨
!
型胶原的制备及理化性
能分析*]+2生物医学工程与临床$%%&)#($" &$)R&$2
;ECJL,C:,BLE-:HC?@CJPBH 4,@K,CE?,.2;FE1,F,?@BC ,CG ,R
C,.K0@0BD?K1EMIB.,JEC*]+2Y@BAEG@I,.TCJ@CEEF@CJ,CG -.@C@R
I,.` EG@I@CE$%%&)#($"&$)R&$2
*(+"YFHIhCEF;\,C GEFaE0?` 2Q?FHI?HFE,CG DHCI?@BC BDI,F?@.,JE
IB.,JEC0*]+2 @`IFB0IaE0fEI:&//#$!" (!R(!#2
*#+"YEIh NYFBG0hK]2QH1EFIB@.EG 1FB?E@C AB?@D0" ?:EIB.,JEC ?F@1.ER
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*)+"N:,C Q Y7@,C P]aKH YE?,.2M0B.,?@BC ,CG 8@BI:EA@I,.I:,F,I?EFR
@9,?@BC BDIB.,JEC0DFBA0E,ZEEG 1@1ED@0:L=&6&$4.+,,).*%6%*]+2
Y@B?EI:CB.BJK,CG Y@B1FBIE00TCJ@CEEF@CJ$%%/&#" #(*R##$2
**+"曹慧许时婴2鸡关节软骨
!
型胶原的制备*]+2食品科学
$%%$!##$" &#!R&)$2
-,B4H@SH Q:@K@CJ2;FE1,F,?@BC BD1HFE?K1EMIB.,JEC DFBA
I:@IhEC ,F?@IH.,FI,F?@.,JE*]+2UBBG QI@ECIE $%% $! # # $"
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*+"[BE00CEF]U2f:EGE?EFA@C,?@BC BD:KGFB^K1FB.@CE@C ?@00HE,CG
1FB?E@C 0,A1.E0IBC?,@C@CJ0A,.1FB1BF?@BC0BD?:@0@A@CB,I@G
*]+25FI: Y@BI:@A@I,Y@B1:K0&/*&/("##%R##2
*!+"a@JB-4,F?A,CC 3]Y,@F,?@52T.EI?FB1:BFE?@I,CG @AAHCBR
I:EA@I,.0?HGKBDIB.,JEC0DFBA0E1@,BD@I@C,.@0I,F?@.,JE*]+2
Y@BI:@AY@B1:K5I?,$%%$&)$#&$"R!#2
*/+"W0:,aa,A,0,A@f2f:EEDEI?BDHFE,,CG &R1FB1,CB.BC IB.,R
JEC GEC,?HF,?@BC" H0@CJ3Q-I@FH,FG@0IFB@0A,CG \@0IB0@?K*]+2
f:EFABI:@A@I,5I?,$%%##%/"$%&R$%*2
*$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"