全 文 :第7卷第1期
2009年1月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.7No.1
Jan.2009
收稿日期:20080707
基金项目:教育部新世纪优秀人才基金资助项目
作者简介:江 波(1985—),男,河北邢台人,硕士研究生,研究方向:生物化工;修志龙(联系人),教授,博士生导师,Email:zhlxiu@dlet.edu.cn
2,3-丁二醇的发酵及盐析分离工艺
江 波,张江红,李志刚,戴建英,修志龙
(大连理工大学 环境与生命学院 生物科学与工程系,大连 116024)
摘 要:采用克雷伯氏菌(KlebsielapneumoniaeCICC10011)发酵生产2,3-丁二醇,并对2,3-丁二醇的盐析分离
工艺进行了考察。通过实验确定了以葡萄糖为底物微氧批式流加发酵的条件,发酵液中2,3-丁二醇和3-羟基
丁酮的质量浓度分别为9098g/L和1240g/L,2,3-丁二醇的摩尔转化率为827%,生产强度达到21g/(L·h)。
对发酵液中2,3-丁二醇的盐析分离研究表明,K2HPO4和K3PO4对2,3-丁二醇的盐析效果优于K2CO3。当发酵液
浓缩70%后,加入质量分数为45%的K2HPO4,2,3-丁二醇的分配系数达到910,回收率为7937%;上相中2,3-
丁二醇的质量浓度达到420g/L;此时3-羟基丁酮的分配系数和回收率分别为119和8348%。
关键词:2,3-丁二醇;发酵;克雷伯氏菌;盐析
中图分类号:Q815 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2009)01-0044-05
FermentationandsaltingoutSeparationof2,3butanediol
JIANGBo,ZHANGJianghong,LIZhigang,DAIJianying,XIUZhilong
(DepartmentofBioscienceandBiotechnology,SchoolofEnvironmentalandBiologicalScience
andTechnology,DalianUniversityofTechnology,Dalian116024,China)
Abstract:Thebioconversionof2,3butanediolbyKlebsielapneumoniaeCICC10011wasstudiedwitha
mediumbasedonglucoseinfedbatchfermentations,andthesaltingoutseparationwasexplored.Thefinal
concentrationof2,3butanediolandacetoininthefermentationbrothreached9098g/Land1240g/L,
respectively.Themolaryieldofbutanediolwas827%andtheproductivitywas21g/(L·h).Theefects
ofconcentrationcyclesandsaltconcentrationsontheextractionof2,3butanediolinflocculatedbrothwere
alsostudied.Whenthefermentationbrothwasconcentratedto70%,45% K2HPO4wasadded,theparti
tioncoeficientsandtherecoveryrateof2,3butanediolandacetoinreached910,and7937%,respec
tively.Theconcentrationof2,3butanediolintopphasereached420g/L,thepartitioncoeficientandthe
recoveryratereached119and8348%.Resultsindicatethattheprocesshasadvantagesofsimple,ener
gysaving,andgoodpotentialforapplication.
Keywords:2,3butanediol;fermentation;Klebsielapneumoniae;saltingout
2,3-丁二醇(2,3butanediol,2,3BD)是一种
无色、无嗅的液体,具有吸湿性;沸点为 178~
182℃,与水混溶,溶于乙醇、乙醚。2,3-丁二醇是
一种重要的化工原料,可用来制备聚合物、香水、增
湿剂、软化剂、增塑剂以及药物的手性载体等[1-3]。
2,3BD还很容易脱水产生甲乙酮,甲乙酮可进一步
脱水形成1,3-丁二烯。
2,3BD的生产方法有化学合成法和生物发酵
法两种。化学合成成本较高,大部分以各种糖类物
质为底物,经微生物发酵而得[4]。在20世纪,它的
发酵生产技术取得了很大进步[57],但由于其沸点
高,亲水性强,发酵液成分复杂,因而使得 2,3BD
的提取工艺变得相当复杂[2,8]。
2,3BD的主要分离方法有:逆流气提法[9]、有机
溶剂萃取法[10]、反相渗透法和全蒸发技术[11]。
本文利用 Klebsielapneumoniae菌,对 2,3BD
的发酵工艺进行优化;同时考察无机盐对有机物的
盐析效应,减少2,3BD在水中的溶解度使其形成
有机物富集相,从而达到将2,3BD从发酵液中进
行分离的目的。
1 材料与方法
11 实验材料
1.1.1 发酵实验材料
菌种:克雷伯氏菌 KlebsielapneumoniaeCGMCC
1206,本课题组在中国普通微生物菌种保藏管理中心
(CGMCC)保藏的菌种;KpneumoniaeCICC10011,购
自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。
培养基组成:培养基一参照文献[12];培养基
二参照文献[5]。
1.1.2 盐析分离实验材料
发酵液经本实验室壳聚糖絮凝处理,去除其中
的菌体和可溶性蛋白。实验过程中使用的其他化
学试剂均为分析纯以上级别。
12 实验方法
121 发酵实验
1)摇瓶发酵 在250mL的三角瓶中进行,装
液量100mL,恒温振荡培养箱转速150r/min,温度
为37℃,培养时间10~12h。
2)间歇发酵实验 在5L发酵罐中进行,接种
量为体积分数10%,发酵罐初始装液量2L,搅拌转
速为300r/min,发酵温度为 37℃,用 5mol/L的
NaOH溶液调节发酵液 pH,同时控制不同的通气
量。通气量的定义如下:
每分钟内单位体积(1L)发酵液通入单位体积
(1L)的空气量为1vvm。
3)批式流加发酵实验 在5L发酵罐中进行,发
酵罐初始装液量2L,搅拌转速为300r/min,发酵温
度为37℃,用5mol/L的NaOH溶液调节pH。第一
批实验为KpneumoniaeCGMCC1206在培养基一条
件下培养;第二批实验为 KpneumoniaeCICC10011
在培养基二条件下培养;第三批实验为K.pneumoni
aeCICC10011在培养基一条件下培养。
122 盐析分离实验
于蒸馏瓶中加入200mL絮凝后上清液,旋转蒸
发仪上70℃进行减压蒸馏获得浓缩液。本实验采
用的浓缩倍数分别为 20%、30%、40%、50%、60%
和70%。称取8g浓缩后的发酵液于10mL具塞比
色管中,加入一定质量的无机盐,振荡至盐溶解后,
静置8h,待溶液完全分相,读取上下相体积,分别取
样分析两相中目标产物的量,计算分配系数(K,上、
下相目标产物质量浓度之比)和回收率(Y)。实验
采用的无机盐分别为(NH4)2SO4、K3PO4、K2SO4、
KH2PO4、(NH4)2HPO4、KHCO3、K2CO3。其中浓缩
倍数(N)的定义为:
N=(1-V终/V始)×100%;
式中:V终为发酵絮凝液浓缩后体积;V始为发酵絮凝
液初体积。
13 分析方法
发酵产物采用气相色谱法测定(玻璃管填充
柱,色谱柱2m×Ф5mm,填料为 Chromsorb101,检
测器为FID,柱温190℃,汽化室与检测器的温度均
为200℃,载气为N2,流速50mL/min,进样量1μL,
外标法定量);以蒸馏水为空白测定发酵液在 650
nm下的吸光度(OD650),用其表征生物量。
2 结果与讨论
图1 20g/L的不同底物对摇瓶发酵的影响
Fig.1 Theconcentrationsofdiferentproductsand
opticaldensity(OD)ofshakingflask
fermentationwithdiferentsubstrates
21 底物对发酵的影响
初始底物分别选用葡萄糖、果糖和麦芽糖,初
始底物质量浓度为20g/L,采用摇瓶发酵的方法,考
察不同底物对发酵结果的影响。实验结果见图1。
以KpneumoniaeCGMCC1206为发酵菌株,它对不
54 第1期 江 波等:2,3-丁二醇的发酵及盐析分离工艺
同底物的利用情况不同。当以葡萄糖为底物时,菌
体生长旺盛,2,3BD终质量浓度较高。由于葡萄糖
比较廉价,来源广泛,而且可以通过秸秆等纤维素
资源水解得到,本实验室预选择葡萄糖为底物,对
2,3BD发酵工艺进行研究。
22 通气条件对发酵的影响
分别考察厌氧环境和微氧环境对发酵结果的影
响,微氧发酵时通气量分别为004vvm和008vvm,
间歇发酵,实验结果见图2。
图2 不同通气条件对发酵结果的影响
Fig.2 Theconcentrationof2,3butanediolandoptical
density(OD)ofshakingflaskfermentation
underdiferentaerationconditions
由图2可知,微氧条件有利于菌体的生长和目标
产物2,3BD的积累。O2的存在与否可以导致不同
代谢途径的产生[4]。在厌氧条件下,2,3BD途径和
乙醇途径同时进行,代谢会产生等摩尔的乙醇和2,3
BD。要想进一步提高目标产物的纯度,就必须尽量
减少乙醇的产生,即通过通入适量O2来抑制乙醇途
径。此外,O2不仅能有效抑制乙醇的产生,还有利于
生物量的形成,而克雷伯氏菌是生长偶联型的,因而
也有利于产物2,3BD的生成。但如果通气量过大,
底物大部分转化成生物量,则不利于目标产物的生
成。一旦O2的供应量超过了微生物代谢的需氧量,
糖代谢的唯一产物变为生物量和 CO2。通过间歇发
酵,确定最佳通气量为004vvm。
23 培养基与发酵方式对发酵的影响
通过不同的培养基和菌种的批式发酵实验,考
察其对发酵结果的影响(图3)。
1#—KpneumoniaeCGMCC1206+培养基一;
2#—KpneumoniaeCICC10011+培养基二;
3#—KpneumoniaeCICC10011+培养基一
图3 不同菌种和培养基组成对发酵结果的影响
Fig.3 Efectsofdiferentbacteriaanddiferent
mediaonfermentation
共进行3批次实验。第1批实验,发酵时间为
56h,在10h,OD最高为1968;在30h时,2,3BD最
高质量浓度为4773g/L,2,3BD与3羟基丁酮(乙偶
姻)质量浓度和最高为5556g/L,摩尔转化率686%;
第2批实验,发酵时间为59h,在32h时,OD最高为
1733;在55h时,2,3BD最高质量浓度为8477g/L,
2,3BD与乙偶姻质量浓度和最高为9395g/L,摩尔转
化率810%;第3批实验,发酵时间为49h,在14h时,
OD最高为1968;在49h时,2,3BD最高质量浓度为
9098g/L,2,3BD与乙偶姻质量浓度和最高为10338
g/L,摩尔转化率为827%。在发酵前期,2株菌合成产
物能力相似,在发酵中后期,菌株KpneumoniaeCICC
10011的合成能力要远高于 KpneumoniaeCGMCC
1206,而发酵培养基组成对产物浓度影响较小。同时,
实验结果表明,在发酵末期,还有少量葡萄糖剩余,这
可能是发酵液中的N源或者其他营养成分的不足造成
的,但这同时也说明,发酵过程还有一定的潜力,通过
优化应当可以继续提高产物的质量浓度。
64 生 物 加 工 过 程 第7卷
24 2,3-丁二醇的盐析分离
盐析分离常用于丁醇、异丙醇、丙酮等有机物的分
离[13-14],本实验考察多种无机盐对发酵液中2,3BD
醇的分离效果。通过实验发现,只有K2CO3、K2HPO4和
K3PO4能起到盐析作用,后2种盐对2,3BD及前体乙
偶姻的分配影响见图4、图5。当发酵液浓缩70%后,
加入45%的K2HPO4,2,3BD的分配系数最高,为910,
回收率较高,为7937%,上相中产物质量浓度最高可
达420g/L。2,3BD前体3-羟基丁酮(乙偶姻)也有
相似的分配规律,在此条件下其分配系数和回收率分
别可达1190和8348%。
图4 盐浓度和浓缩倍数对2,3BD分配系数
和回收率的影响
Fig.4 Efectsofsaltconcentrationsandconcentration
multiplesonKandYof2,3BD
由图4、图5可以看出,在同一浓缩倍数下,目标
产物的分配系数和回收率都随盐质量浓度的升高而
升高;对于20%浓缩倍数的发酵液,只有当盐的质量
浓度达到45%时才能分相;随着浓缩倍数的增大,即
使较低质量浓度的盐也能成相。浓缩倍数的影响与
发酵液中2,3BD的质量浓度密切相关,当2,3BD质
量浓度较高时,浓缩倍数较低也能达到盐析的效果。
同时,盐的类型和质量浓度对2,3BD的盐析也有重
要影响,K2HPO4的盐析作用明显好于K3PO4的盐析作
用。在同一盐浓度下,目标产物的分配系数和回收率
随着浓缩倍数的增加而升高。
取发酵液(2,3BD6523g/L)浓缩70%后,分
别加K2HPO4、K2CO3至饱和;K2CO3盐析分析效果较
差,2,3BD分配系数和回收率仅为 749和
图5 盐浓度和浓缩倍数对乙偶姻分配系数
和回收率的影响
Fig.5 Efectsofsaltconcentrationsandconcentration
multiplesonKandYofAcetoin
7959%。K2HPO4盐析分离效果较好,2,3BD分配
系数达4203,回收率可达 9512%。K2HPO4更适
合于2,3BD的盐析分离。
3 结 论
通过菌株 KpneumoniaeCICC10011以葡萄糖
为底物在微氧条件下进行批式流加发酵,在49h的
发酵周期里,由250g/L葡萄糖得到2,3BD和3-
羟基丁酮的质量浓度分别为9098g/L和1240g/
L。2,3BD的摩尔转化率达到827%,转化速率达
到21g/(L·h);在后续的盐析分离操作过程中,
K2HPO4和K3PO4对2,3BD发酵液的盐析作用比较
明显。当发酵液浓缩70%后,加入质量分数为45%
的K2HPO4,2,3BD的分配系数最高,为910;回收
率较高,为7937%;上相中产物质量浓度最高可达
420g/L。本实验对2,3BD的工业化生产具有很强
的的参考价值。
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国外动态
英国通过法案承诺2050年减排80%
英国驻上海总领事馆发布了英国通过《气候变化法案》的消息。该法案承诺,英国将在2050年将温室
气体排放量在1990年基础上减少80%,并确定了今后5年的“碳预算”。这是全球第一个确定温室气体减
排目标的法案。根据英国气候变化委员会的估算,达成这一目标需要消耗英国GDP的1%到2%。
在这一法律约束下,英国政府必须定期向议会汇报如何达成这一目标,采取行动的领域将包括所有的
工业设施和来往英国的所有国际航空和航运交通。这一法律也赋予了英国政府实行排放交易、推广生物燃
料、减少建筑能耗、甚至强制零售业减少塑料袋使用的权力。
在中英两国签署的《中英两国政府关于气候变化的联合声明》中,双方约定在开展适应气候变化和研究
气候友好技术转让机制以及促进低碳技术开发、清洁能源和提高能效方面的合作。同时,双方将推动有关
规划类清洁发展机制的研究并继续在近零排放煤电项目上取得进展。英方还承诺从“环境改造基金”中至
少拿出5000万英镑,以优惠贷款和可能的赠款方式支持中国应对气候变化活动。
利用线粒体制造爆炸物探测器
密苏里州(Missouri)的研究人员借助活体细胞用以生产能量的细胞器———线粒体来开发一种自供电的
微型传感器。该传感器只有一张邮票的大小,能快速探测隐藏的爆炸物。此次研究开发的传感器建立在一
种特殊的生物燃料电池基础之上,该燃料电池的特别之处在于其是由线粒体夹在碳基电极和透气性电极之
间制成的。研究人员以硝基苯化合物作为试验对象,发现该传感器在有硝基苯化合物存在时,电流显著增
大,表明该传感器具有开发成探测TNT和类似爆炸物的前景。
(文伟河)
84 生 物 加 工 过 程 第7卷