全 文 ：第 ! 卷第 # 期
#$%% 年 & 月
生"物"加"工"过"程
9=QCJ(JTDIOCBEDN\QD)ODHJ((@CMQCJJOQCM
2DE*! -D*#
B`O*#$%%
KDQ"%$*&!7!:e*Q((C*%78# 6&783*#$%%*$#*$%%
收稿日期"#$%$ 6$8 6$%
作者简介"周"雪#%!37%$&女&河北唐山人&硕士研究生&研究方向"酶工程(朱启忠#联系人$&教授&@FPBQE"=<白腐真菌漆酶的纯化及性质
周"雪&朱启忠
#山东大学威海分校 海洋学院&威海 #70#$!$
摘"要"液体发酵培养白腐真菌[!&粗酶液经盐析)透析浓缩)葡聚糖W %$$ 柱层析) @^Y@ 纤维素离子交换层析
四步分离纯化&得电泳纯漆酶 经 4 4^F>YW@法测定酶的相对分子质量约为 7 p%$0&酶活回收率达 07j08g&纯度
提高了 %3j37 倍 [! 漆酶最适反应温度为0$ k&最适反应 ).为 0j3&在& k以下)).0j3 hj0 的范围内稳定性
较强 其催化愈创木酚的B
+
为0j7% PPDE:U&1
P
为 7j#8 PPDE:#U$PQC$ _/对其有激活作用&而[J#/)[J&/对其有
明显抑制作用
关键词"漆酶(纯化(白腐真菌
中图分类号"+!0""""文献标志码"Y""""文章编号"%78# 6&783##$%%$$# 6$$& 6$
X34.7.:5E.2/5/H:-545:E04[.5E2/2765::510742JI-.E0F42E73/;.
V.5S1IJ&V.S+Q<=DCM
# B`OQCJ9DEJMJDN4=BCMKDCMSCQZJO(QAXBARJQ=BQ&RJQ=BQ#70#$!&9=QCB$
*K1E45:E"d=JEBHHB(JDNL=QAJFODANICMQ[! LB()IOQNQJK A=ODIM= (BEAQCMDIA&KQBEX(QCM&4J)=BKJGWF%$$ HDEIPC H=ODPBADMOB)=XBCK @^Y@FHJEIED(JQDCFJGH=BCMJH=ODPBADMOB)=X
LQA= BNQCBE)IOQNQHBAQDC DN%3j37FNDEK BCK BC DZJOBEXQJEK DN07j08g*d=J)IOQNQJK JCQKJCAQNQJK LQA= BPDEJHIEBOPB((DN7 p%$
0
;X4 4^F>YW@PJA=DK*d=JD)AQPIP).BCK A=JAJPF
)JOBAIOJLJOJ0j3 BCK 0$ k OJ()JHAQZJEX*R=JC A=JAJP)JOBAIOJLB(;JEDL& k BCK A=J).LB(
0j3Fj0& A=JEBHHB(JJG=Q;QAJK PBGQPBE(AB;QEQAX*B
P
BCK 1
P
NDODGQKQ0j7% PPDE:UBCK 7j#8 PPDE:#U!PQC$ &OJ()JHAQZJEX*d=JEBHHB(JLB(BHAQZBAJK ;X_
/
BCK QCF
=Q;QAJK ;X[J
# /
&[J
& /
*
L0M I24H1"EBHHB(J()IOQNQHBAQDC( L=QAJFODANICMQ
""漆酶#EBHHB(J&@9%*%$*&*#$ 即多酚氧化酶&是
一种蓝色多铜氧化酶家族的糖蛋白氧化酶&它利用
分子氧作为氧化剂&氧化木质素中酚型单元成为酚
氧游离基&同时还原分子氧生成水 在 #&#/ 连氮
基 双 #& 乙基苯并二氢噻唑啉 7 磺酸$#Y\d4$
存在时&能氧化木质素中的非酚型单元&并且其催
化过程不需要.
#
5
#
参与&因此它在催化木质素降解
时有一定的优越性*%+ 漆酶按来源可分为漆树漆
酶)真菌漆酶和细菌漆酶&其中以真菌漆酶为主
在产漆酶的真菌中最重要的是担子菌中的白腐菌
#L=QAJFODANICMQ$ 白腐真菌漆酶通常以多重基因编
码的同工酶形式出现&具有来源广泛)单电子氧化
还原电位高)可以催化降解多环芳烃类物质等
特点*#+
国内对白腐真菌漆酶的研究工作很多&但是纯
化的效果并不理想&笔者对自行分离筛选出的白腐
真菌新种 [! 漆酶进行分离纯化&并对其酶学性质
作初步探究&以期为后续研究奠定理论基础
C?材料与方法
C=C?菌株
白腐真菌[!&由山东大学微生物菌库提供
C=@?培养基
固体培养基">^Y培养基
产酶培养基 #M:U$"马铃薯 #$$&葡萄糖 #$&
_.
#
>5
0
&& M`45
0
%j&维生素%
$j$%&酵母膏
CNO?材料
愈创木酚)标准蛋白&上海实验试剂有限公司(
葡聚糖 W %$$&上海锐聪科技发展有限公司(
@^Y@ 纤维素&北京瑞达恒辉科技发展有限公司(
其他试剂为分析纯
CNP?仪器
8# 型紫外可见分光光度计&上海光谱仪器有
限公司( ]^] %# 型电泳仪) ]^9V #8%& 型电泳
槽&北京市六一仪器厂(.T2& 数显恒温磁力搅拌器&
金坛宏凯仪器厂
CNQ?方法
%j*%"菌株培养
将[! 在固体培养基上&$ k培养%$ K&用直径
为3 PP的打孔器打孔&按每%$$ PU培养液 0 孔菌丝
定量接种 在&# k)%#$ O:PQC恒温振荡培养&收集
第 %$ 天的粗酶液&在0 k) $$$ O:PQC的条件下离
心#$ PQC&收集上清液&0 k保存备用
%j*#"纯化
""%$#-.
0
$
#
45
0
分级沉淀"向$$ PU粗酶液中缓
慢加入#-.
0
$
#
45
0
粉末&搅拌至完全溶解&每隔 g为
一个#-.
0
$
#
45
0
饱和样点&确定沉淀所用最佳饱和浓
度 粗酶液中加入#-.
0
$
#
45
0
至 !$g饱和度&充分混
合后0 k静置过夜& $$$ O:PQC离心#$ PQC&收集沉淀
溶于$ PU乙酸钠缓冲液#%$ PPDE:U&).j$$中&
0 k保存备用
""#$透析浓缩"取 PU酶液装入%$ HP长的透
析袋中&于 ).7j$ 的磷酸缓冲液中透析03 =&每
%# =更换一次缓冲液 透析后在透析袋外面涂布
聚乙二醇粉末&待粉末完全湿透后更换干燥的聚
乙二醇粉末&重复直至酶试样浓缩到原体积
的 0$g
""&$葡聚糖W %$$ 凝胶层析"向预装好的层析
柱#%j HPp0$ HP$内加入% PU的浓缩酶液#蛋白
质量约&j% PM$&用 ).7*$ 的磷酸缓冲液洗脱&洗脱
速率% PU:PQC&每管# PU&对收集液同时进行可溶
性蛋白浓度和漆酶活力测定&收集有酶活部分
""0$ @^Y@ 纤维素离子交换层析"向预装好的
层析柱#$j! HPp#$ HP$内加经葡聚糖凝胶层析后
的酶液% PU#蛋白质量约$j8 PM$&用磷酸缓冲液
#).7j$$洗脱&流速$j PU:PQC&每管# PU&对收集
液同时进行可溶性蛋白浓度和漆酶活力测定&收集
有酶活部分
%j*&"相对分子质量测定
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 # 4 4^F>YW@$法*&+
测定
%j*0"酶活测定
参照文献 *0 6+ 进行酶活测定 取 # PU)
#$ PPDE:U乙酸钠缓冲溶液#含$j3 PM:U愈创木酚$
和$j PU酶液&混合均匀后于#$ k反应#$ PQC&在
07 CP处测定吸光度 每分钟吸光值改变量的
% $$$倍定义为一个酶活单位#S$
%j*"蛋白含量测定
利用考马斯亮蓝法测定蛋白含量*7+
CNR?漆酶性质测定
%j7*%"漆酶最适 ).及 ).稳定性
向% PU酶液中分别加 ).&j7 hj3 的$j# PDE:U
醋酸缓冲液&室温下以愈创木酚为底物测酶活&酶活
最高时的 ).为最适 ). 相同底物与缓冲液条件
下#$ k保温 0 = 后&测残余酶活力&以原酶活力为
%$$g&比较 ).稳定性
%j7*#"漆酶的最适温度及热稳定性
在最适 ).条件下&分别于不同温度反应 PQC&
记录吸光度改变量&酶活最高时的温度为最适温
度 将酶液于不同温度下保温&$ PQC&迅速冷却&在
最适 ).和室温下检测活力&比较热稳定性
%j7*&"金属离子对漆酶酶活力的影响
向纯化后的酶液中加入$j M:U的金属离子&测
定漆酶活力&以原酶活力为对照&计算相对活力
%j7*0"漆酶动力学B
P
的测定
以不同浓度的愈创木酚为底物&室温)).j$
条件下反应后测酶活&用UQCJLJBOF\IOc作图求B
P

@?结果与讨论
@NC?U> 产酶曲线
[! 从液体摇瓶培养第 8 天起产酶量迅速提高&
第 %$ 天达到产酶高峰&第 ! 天到第 %% 天酶活维持
0 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
在较高水平#图 %$
图 C?U> 菌株产酶曲线
U.;=C?S5::510942H3:E.2/:34W027U>
@N@?葡聚糖% CBB 凝胶色谱
分子筛凝胶层析的洗脱曲线如图 # 所示
图 @?U> 漆酶的葡聚糖% CBB 洗脱曲线
U.;=@?#63E.2/:34W012765::5102/5 %FCBB :263J/
""由图 # 可知"活性漆酶集中于 8 h%% 管中&蛋白
则主要分布在 3 h%& 管中&说明在浓缩的酶液中含
有半数左右的杂质蛋白&并且大多数杂质蛋白的相
对分子质量大于活性漆酶的相对分子质量
@NO?a#*# 纤维素凝胶色谱
""离子交换层析的洗脱曲线如图 & 所示
图 O?U> 漆酶的a#*#F纤维素洗脱曲线
U.;=O?#63E.2/:34W012765::5102/5 a#*#F,0636210
""由图 & 可知"几乎全部的活性漆酶都出现在第
h3 管&蛋白含量在第 7 管处出现最大峰值&在第
%# 管处出现一个较小的峰值&说明葡聚糖 W %$$
层析过后的酶液有 # 种主要的蛋白成分存在&而且
大部分为活性漆酶
@NP?纯化效果
经过 0 步纯化&粗酶提纯了 %3j37 倍&比活力为
0#!j$8&总酶活回收率 07j08g#表 %$
表 C?酶纯化效果
D5K60C?X34.7.:5E.2/070:E12765::510
纯化步骤 总体积:PU 总活力:S +#总蛋白$:PM 回收率:g 比活力:#S!PM6%$ 纯化倍数
粗酶 $$ %7 $#3j#! 8$0j0 %$$ ##j8 %
#-.
0
$
#
45
0
沉淀
$ %& &&8j!3 #78j8% 3&j%# 0!j3# #j%!
透析浓缩 #$ %# %7j&$ 7#j8! 8j30 %!&j7$ 3j%
葡聚糖W %$$ 0$ ! %!7j$! #!j3% 8j&8 &$3j0! %&*7
@^Y@ 纤维素 3$ 8 003j8 %8j&7 07j08 0#!j$8 %3j37
@NQ?相对分子质量的测定
纯化后的酶液&通过 4 4^F>YW@分析#图 0$&得
单一清晰条带&说明分离效果良好&漆酶已达到电
泳纯度&用EDMO
P
C
N
图计算得其相对分子质量约为
7 p%$
0
与康从宝等*8 63+ 报道的白腐菌 R %
#7j#0 p%$
0
$)L*+#)#"()*4+$%#7*# p%$
0
$ 相近
图 0 中&% 为葡聚糖W %$$ 凝胶层析之后的漆酶电
泳条带&其中一条与纯化的漆酶条带位置相近&说
明葡聚糖W %$$ 分离后主要有 # 种蛋白存在&一种
为目标漆酶&另一种为相对分子质量较大的杂质蛋
白&这与 @^Y@ 纤维素离子交换柱层析的洗脱曲线
相符合
@NR?漆酶最适9"及9"稳定性
在不同 ).条件下测定漆酶的酶活&结果见图
由图 可知"漆酶最适 ).为 0j3&在 ).0j# h
j# 的范围内&酶活保持较高水平#!$g以上$().
稳定性曲线显示漆酶在最适 ).下的稳定性不是最
高的 其 ).稳定范围是 0j3 hj0&在此范围内酶
"第 # 期 周"雪等"白腐真菌漆酶的纯化及性质
%%葡聚糖W %$$ 层析后的漆酶( #%纯化的漆酶( &%标准蛋白
图 P?漆酶!a!FX*%#电泳图谱
U.;=P?!a!FX*%#27934.7.0H65::510
活保持在最适酶活的 !$g以上 .BC 等*! 6%$+均报
道过类似的最适 ).不在稳定范围内的情况&说明
在储存和应用时应该注意
图 Q?9"对漆酶的影响
U.;=Q?#70:E1279"2/65::5105:E.W.EM
""康从宝等*8+的研究结果表明白腐真菌R % 最
适 ).为 0j&).稳定区间 &j hj&与本实验有所
差异&苏东海等*0+对白腐真菌 d>#% 的研究结果#最
适 ).j$&).稳定区间 0j$ h7j$$与本实验也有所
不同&说明不同来源的漆酶虽然能作用于同一底
物&但因酶的组成)结构和使用缓冲液的不同&性质
会有所差异
@NY?漆酶的最适温度及热稳定性
不同温度下测[! 漆酶酶活&结果见图 7 由图
7 可知"[! 漆酶最适温度范围较窄&0$ k时表现出
最大酶活&在最适温度两侧&随温度变化&酶活迅速
下降&& h0 k内酶活保持在 8$g以上 保温
&$ PQC后的热稳定性曲线表明低于& k时漆酶稳
定性很高&高于& k后活力迅速下降&在7$ k下保
温&$ PQC后酶活保留低于 &$g 实验结果提示在漆
酶的储存运输过程中要注意控制温度&以保证酶活
图 R?温度对漆酶的影响
U.;=R?#70:E127E0J9045E3402/65::510
@N]?金属离子对漆酶活力的影响
在低浓度金属离子作用下&除 _/以外的其他
金属离子均对漆酶有不同程度的抑制作用 #图
8$ 其中以 [J#/)[J&/的抑制作用最强&而 9I# /
对 [! 漆酶的酶活有轻微的抑制作用 实验结果
与林卫军等*%%+报道#$j% PE:U9I# /对灵芝漆酶有
#8g的抑制率$相符合&而与苏东海等*0&8+的报道
#$j$ PDE:U9I
# /对漆酶活力并无太大影响$有些
差异 这可能与使用的 9I# /浓度或漆酶来源
有关
图 Y?金属离子对酶活的影响
U.;=Y?#70:E127J0E56.2/12/65::5105:E.W.EM
@N>?动力学>
J
的测定
经实验测定&在底物浓度超过#j$ PPDE:U时&
增加底物浓度反应速率不再变化&说明底物浓度
#j$ PPDE:U时达到酶催化的最大反应速率&所以取
愈创木酚浓度在 $j# h#j$ PPDE:U的数据&结果见
图 3
"" 由图 3 可知"漆酶对愈创木酚的 B
P
为
0j7% PPDE:U&1
P
为7j#8 PPDE:#U!PQC$ 该结果与康
从宝等*8+对白腐真菌R6% 的研究结果#B
P
o&j30 p
%$
6
PDE:U$有显著差异&而与苏东海等*0+对白腐真菌
d>#%的研究结果#B
P
o#j## p%$
6
PPDE:U&1
P
o0* p
7 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
图 ]?漆酶动力学>
J
值
U.;=]?S./0I054F834b962E12765::510
%$
6&
PPDE:#U!PQC$$差异更大 由文献*%#+知&不同
来源的漆酶其动力学特征各异&甚至不同菌种也有差
异 另外&实验条件以及反应底物等的不同也会造成
B
+
的差异
O?结论
""白腐真菌 [! 漆酶经纯化后可去除全部杂质&
得电泳纯漆酶&相对分子质量约为 7 p%$0&酶活收
率达 07j08g&比酶活提高 %3j37 倍 原因可能是
经过透析脱盐和葡聚糖 W %$$ 凝胶色谱之后&纯
化去除了抑制物%%%尤其是金属离子的抑制作用&
比酶活大幅提高
""[!漆酶最适 ).0j3&最佳稳定 ).0j3 hj0&稳
定性区间为 0j# hj# 最适酶反应温度为0$ k&低
于& k时比较稳定&高于7$ k时酶活急速降低 在
质量浓度为$j M:U的金属离子存在时&仅_/对酶活
力有激活作用&其他对酶活均有不同程度的抑制作
用&虽然漆酶中含有9I#/&但实验中发现9I#/对酶活
"""
有一定程度的抑制&表明外加 9I#/并不能提高酶活
漆酶的B
P
为0j7% PPD:U&1
P
为7j#8 PPDE:#U!PQC$
参考文献"
* % +"王红*论白腐真菌产木质素降解酶在环境治理中的应用*T+*
现代商务工业&#$$!#8$ "#!8F#!3*
* # +"\DEBMT` &EJDCDLQHMBEEBHHB(J(*T+*Y))E@CZQODC Q`HOD;QDE&%!30&03#0$"30!F30*
* & +"陈钧辉&陶力&李俊*生物化学实验* +`*& 版*北京"科学出版
社&#$$&*
* 0 +"苏东海&苏东民&杨国伟&等*白腐菌d>#% 漆酶分离纯化及其
部分酶学特性的研究*T+*河南工业大学学报"自然科学版&
#$$3&#!#$"0F8*
* +"邵强&姚朝阳&郭伟云&等*云芝漆酶理化性质及动力学研究
*T+*河南师范大学学报"自然科学版&#$$&&&#&$"%$!F%%#*
* 7 +">BAOBPJAJ(ZJO(QHDEDOBCK B))EQHBAQDC ADKJCQPLB(=QCM*T+*>ODHJ((
\QDH=JPQ(AOX&#$$&0$" %78&F%783*
* 8 +"康从宝&刘巧&李清心&等*白腐菌产漆酶的纯化及酶学性质*T+*
中国生物化学与分子生物学学报&#$$#&%3#$"7&3F70#*
* 3 +"杨秀清*一种 ).稳定的黄色漆酶的快速纯化和性质特征
*T+*微生物学通报&#$$!&&7##$"#!!F&$3*
* ! +".BC `T&9=DQ.d&4DCM.W*>IOQNQHBAQDC BCK H=BOBHAJOQEBHHB(JNODPA=JL=QAJODANICMI(L*+#)#"1#*"24&(&**T+*` QHOD;QF
DEDMX&#$$&0$" F7$*
*%$+".JEBV &`dB=BO *`UBHHB(J)IOQNQHBAQDC BCK H=BOBHFAJOQNODPL*+#)#")*&;22"&()#% QC dICQ(QB" KJHDEDOQKXJ(;XA=J)IOQNQJK JCMX&#$$7&&!"%0%F%03*
*%%+"林卫军&周玉恒&经艳&等*灵芝漆酶的分离纯化及其部分酶
学性质研究*T+*广西科学&#$$!&%7#%$"3#F37*
*%#+"王镜岩&朱圣庾&徐长法&等*生物化学* +`*& 版*北京"高等
教育出版社&#$$*
8"第 # 期 周"雪等"白腐真菌漆酶的纯化及性质