全 文 ：Aug．2007
· 20·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第5卷第3期
2007年8月
复合脂肪酶催化生物柴油的初步研究
周 位，杨江科，黄 瑛，闫云君
(华中科技大学 生命科学与技术学院，武汉430074)
摘要：初步探讨了复合脂肪酶催化生物柴油的工艺。优化了复合酶配比条件和叔丁醇反应体系。在无溶剂体系
中，Novozym435分别与LipozymeTLIM和LipozymeRMIM均以70／30质量比混合时，甲酯得率分别达到94．52％和
96．25％，比Novozym435单独催化时的甲酯得率分别提高了9．52％和9．99％。在叔丁醇体系中，-3Novozym435与Li—
pozymeTLIM和LipozymeRMIM分别以60／40和80／20的质量比混合时，其甲酯得率分别为85．06％和81．5％，比No—
vozym435单独催化的效率分别提高了9．89％和7．48％。优化叔丁醇体系中复合酶催化条件后，甲酯得率达92％。
关键词：生物柴油；复合脂肪酶；协同效应；转酯反应
中图分类号：Q814．2，Q814．9文献标识码：A 文章编号：1672．3678(2007)03-0020-07
Studyonproductionofbiodieselwithcompoundlipases
ZHOUWei，YANGJiang—ke，HUANGYing，YANun-jun
(CoHegeofLifeScienceandTechnology，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430074，China)
Abstract：Thebiodieselproductionwithcomplexipaseswasinvestigated．Thecompl xipasewashigher
efficiencyofcatalysis。fortransesterificationthansinglelipasebasedoncomparison．Theratiooftwolipa—
sesofthecomplexwasoptimized，andthereactionconditionintert—butanolsystemwasoptimized，too．In
solvent—freesystem，whenNovozym435wasmixedwithLipozymeTLIMandLipozymeRMIMattheratio
of70／30，themethylesteryieldswerehi【gherthanthatofonlywithNovozym435by9． 2％and9．99％
respectively．Whileintert—butanolsystem，whenNovozym435wasmixedwithLipozymeTLIMandLi-
pozymeRMIMattheratioof60／40and80／20respectively，themethylesteryieldswerehigherthanthat
ofonlywithNovozym435by9．89％and7．48％respectively．Withtheoptimalreactionconditioninthe
tert—butanolsystem，themethylesteryieldreached92％．
Keywords：biodiesel；compoundlipases；sy ergisticeffect；transesterification
生物柴油具有可再生、环保等优点，被认为是
石化柴油的优良替代品u引。生物柴油主要是以动
植物油为原料，通过转酯反应而制备的长链脂肪酸
酯类物质。目前生物柴油的生产工艺主要有化学
法和生物酶法。化学法是当前的主流工艺，但存在
能耗高、工艺复杂、醇消耗量大、环境污染等缺
点p一。生物酶法制备生物柴油具有反应条件温和、
醇用量小、产物易分离、环保等优点，因而被认为是
取代化学法生产生物柴油的绿色工艺。但酶法生
产生物柴油的工艺也存在脂肪酶制备成本高、易失
活、转化效率不太高等缺点。利用叔丁醇等有机溶
剂体系进行转酯反应在一定程度上克服了酶易失
收稿日期：2007-01-05
基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2003AA214061)；湖北省科技攻关资助项目
作者简介：周位(1982一)，女，湖北仙桃人，硕士研究生，研究方向：生物能源。
联系人：闫云君，教授，博士生导师，E—mail：yanyunjun@tom．com
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· 22· 生物加工过程 第5卷第3期
AYS。实验结果表明1，2，3位的脂肪酶对1，3位脂
肪酶转酯反应中的酰基转移有促进作用。
2．2复合游离脂肪酶和单一游离脂肪酶催化大豆
油转酯化的比较
鉴于上述实验结果，我们进一步扩大了不同位置
特异性脂肪酶的组合筛选范围。将具有1，2，3位特
异性的AYS脂肪酶分别与其他4种1，3位特异性脂
肪酶混合反应，并进行了单独催化和混合催化转酯的
比较研究(表1)。考察反应体系为4．585g大豆油，
甲醇600IxL(醇油摩尔比为3：1，甲醇分3批加入，分
别为反应开始，反应12h和24h)，150mg游离酶
(150mg为单独催化时的酶量，混合催化时两种酶分
别75mg)，0．229g水，200r／rain，40℃反应72h。结
果如图1所示。从图1可见，每种脂肪酶酶混合催化
时均大于同等质量的酶单独催化的甲酯得率，当混合
的两种酶转酯能力相近时，该现象尤为明显，甲酯得
率提高了一倍多。由此可以确认复合酶在催化的过
程中产生了协同效应。
表1不同脂肪酶的位点特异性
Table1 Regionselectivityofvariouslipases
testedinthetransesterifieation
100
堡80
懈
、蹄60
旺40
20
O
§≯≯s梦§梦《梦
◇。
图2复合游离脂肪酶和单一游离脂肪酶
对甲酯得率的影响
Fig．2Conversionofthesoybeanoiltothecorresponding
fattyacidmethylesteratalysedbyvariou’ssingle
freelipasesandvariouscompoundfreelipases
2．3 PS和AYS混合催化生物柴油
为了考察复合脂肪酶提高甲酯得率的效果，选
用1，3位脂肪酶Ps和1，2，3位脂肪酶AYS进行转
酯反应，得出两种酶的最佳配比。反应体系为
4．585g大豆油，甲醇600txL(醇油摩尔比为3：1，甲
醇分三批加入，分别为反应开始，反应12h和
24h)，适量的复合酶，0．229g水，200r／min，40oC
反应72h。其中PS／AYS复合酶用量确定为：按Ps
酶和AYS酶各自的最佳酶用量乘以复合百分比而
定∽1。预实验得出AYS催化转酯的最佳酶量为
2％，PS为0．6％。不同复合质量比例的m(Ps)／m
(AYS)对转酯效果的影响见图3。由图3可见，在
PS／AYS为80／20时的甲酯得率最高，比Ps单独催
化的得率高出6．71％，表明复合酶对甲酯化有一定
的促进作用，效果不明显的原因可能是两种酶的转
酯能力差别太大，导致协同效果不易显现。
誉
＼
祷
熙
溢
旺
o，1004016050／506014070／3080／2090／10100／0
m(PS)／m(AYS)
图3 不同PS／AYS配比对甲酯得率的影响
Fig．3EffectoflipasePSandAYSwithdifferentatio
onthebiodieselproduction
2．4复合固定化脂肪酶在无溶剂体系中混合催化
合成生物柴油
尝试将目前常用于催化制备生物柴油的3种固
定化脂肪酶Novozym435，LipozymeTLIM与“．
pozymeRMIM(表2)进行混合催化转酯反应。No-
vozym435为l，2，3位的脂肪酶，LipozymeT IM和
LipozymeRMIM均为1，3位的脂肪酶。考察No-
vozym435分别与LipozymeTLIM和LipozymeRMIM
混合催化效果。酶的混合比例同试验2．3。反应体
系为4．585g大豆油，甲醇600ILL(醇油摩尔比为
3：1，甲醇分三批加入，分别为反应开始，反应12h
和24h)，适量的复合酶，200r／min，40℃反应72h。
3种酶的最适酶量见图4。Novozym435、Lipozyme
TLIM和LipozymeRMIM的最适酶量分别为5％、
囫捌叼艮且囡囫纠阴捌囡叼副且[h
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2007年8月 周位等：复合脂肪酶催化生物柴油的初步研究 ·23·
12％和14％(相对油的质量分数)。复合酶的转酯
效果见图5、6。
表2不同固定化脂肪酶的基本性质
Table2 Charactersofvariousimmobilizedlipase
testedinthetransesterification
100
80
零
、 60
褂
曲
嚣40
20
O 5 lO 15 20
w0Jn酶量1／％
图4无溶剂体系中固定化脂肪酶酶量对甲酯得率的影响
Fig．4Effectofimmobilizedlipasesonthebiodiesel
productioninsolvent—fleesystem
毋
、
船
啦
龌
旺
图5无溶剂体系中不同配比的Novozym435
与TLIM对甲酯得率的影响
Fig．5EffectofdifferentlipaseratioofNovozym435ttoTLIM
onbiodieselproductionins lvent—freesystem
零
、
槲
啦
酱
廿
m(Novozym435)／m(RMIM)
图6无溶剂体系中不同配比的Novozym435与
RMIM对甲酯得率的影响
Fig．6EffectofdifferentlipaseratioofNovozym435to
RMIMonlipaseproductioninsolvent—freesystem
结果表明在无溶剂体系中，复合固定化酶可以
明显的提高甲酯得率。在相同的工艺条件下，No—
vozym435分别与LipozymeTLIM和LipozymeRMIM
均以70／30比例混合时比Novozym435单独催化时
的转酯得率分别提高了9．52％和9．99％，甲酯得率
分别达到94．52％和96．25％，该结果高于国内外的
相关研究结果u¨12]。LipozymeTLIM和Lipozyme
RMIM分别与Novozym435按不同比例混合的时候，
甲酯得率的变化趋势均接近“M”形，原因可能是在
无溶剂体系中，整个体系不是均相体系，两种酶在
催化反应时有一个与底物相互接触并协调分配的
复杂的过程，导致不同比例的甲酯得率不是呈现单
纯的上升趋势。
2．5 复合固定化脂肪酶在叔丁醇体系中催化合成
生物柴油
无溶剂体系采用了3步甲醇加入工艺，反应时
间较长，为缩短反应时间，尝试采用有机溶剂体系
进行复合酶催化合成生物柴油新工艺。由于叔丁
醇既是一种相对亲水的溶剂(LogP=0．8)，又能很
好地溶解甲醇和副产物甘油，使反应体系呈均相体
系，故选择叔丁醇作为反应介质，最近国内外也有
一些关于采用叔丁醇作为反应介质制备生物柴油
的报道L4，13J。反应体系为4．585g大豆油，甲醇800
¨L(醇油摩尔比为4：1)，80％叔丁醇(相对于油的
质量分数)，适量的复合酶(酶的混合比例同试验
2．3)，200r／min，40℃反应24h。3种酶的最适酶
量如图7。Novozym435、LipozymeT IM和Lipozyme
RMIM的最适酶量分别为3％、6％和8％(相对油的
质量分数)。复合酶的转酯效果见图8、9。
结果表明，在叔丁醇体系中，在相同的工艺条
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90
86
冰
喜82
啦
普78
睁
74
70
隧 蘸
20 40 60 80 100
Ⅲ(叔丁醇添加量)／％
图10溶剂量对甲酯得率的影响
Fig．10Effectofsolvento biodieselproduction
92
88
冰
孬84
瞳
穑80
旺
76
72
311 411 5／1 6／1 711
m(醇)，m(油)
图11醇油比对甲酯得率的影响
Fig．11 EffectofmetllanoL／oilmolarratioon
biodieselproduction
92
90
零88
舞86
隹Ⅱ
旺
84
82
80
2．10 3．15 4．20 5．25
∞(复合酶)／％
图12复合酶酶质量分数对甲酯得率的影响
Fig．12Effectofcompoundlipasesconcentrationon
biodieselproduction
92
90
冰88
赫86
}豇
旺84
82
80
黍 黍
40 50
t，℃
图13温度对甲酯得率的影响
Fig．13Effectof emperatureonbiodieselproduction
100
80
零
喜 60
难
酱40
廿
20
0 5 10 15 20 25 30
反应时间／h
图14不同时间下的甲酯得率
Fig．14Transesterificationo soybeanoilcatalyzedby
compoundlipases
出较强的协同效应。在本试验中，在无溶剂体系
中，Novozym435分别与LipozymeTLIM和Lipozyme
RMIM以70／30质量比例混合时比Novozym435单
独催化时的甲酯得率分别提高了9．52％和9．99％，
甲酯得率达到94．52％和96．25％；在叔丁醇体系
中，Novozym435与LipozymeTLIM以60／40质量比
例混合时比Novozym435单独催化时的甲酯得率提
高9．89％，甲酯得率达到85．06％，Novozym435与
LipozymeRMIM以80／20比例混合时比Novozym435
单独催化时的甲酯得率提高7．48％，得率
为81．5％。
通过对叔丁醇体系中Novozym435与Lipozyme
TLIM复合酶催化条件进行优化表明：在溶剂添加量
为40％、醇油摩尔比4：1、复合酶添加量为No—
vozym4351．35％+LipozymeTLIM1．80％，温度为
40℃，摇床转速为200r／min，反应24h，甲酯得率
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· 26· 生物加工过程 笫5卷第3期
达到92％。露嚣Novozym435的市场价格是14500
形k，魁LipozymeTLIM市场价(850形kg)的17
倍，用Novozym435单独催他至少要添加3％的酶量
才麓达翻较高的得率，丽复合酶的催化工艺只需添
加1．35％的Novozym435和1．80％的Lipozyme
TLlM，在工业应用上能减少脂肪酶成本，复合酶催
亿生物紫油工艺具有更高的经济效益。
脂肪酶在催化反应的过程中除具有位置专一
性外，还具有脂肪酸专一性¨5|，即脂肪薅对不同碳
链长度和饱和度的脂肪酸表现出特殊反应性。油
脂的不同主要表现在其脂肪酸种类及含量的不同，
卣实验结果可以攘测剥鼹复合脂肪酶催化工艺，麓
有效地利用脂肪酶的脂肪酸专一性，达到高效催化
不同油脂的目的，从而极大地拓展油源的选择砥。
复合冀警肪酶催化广泛油舞旨生产生物柴油具有极好
的应用前景。
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