全 文 ：! 第 " 卷第 # 期
# $$% 年 % 月 生 物 加 工 过 程 &’()*+* ,-./)01 -2 3(-4/-5*++ 6)7()**/()7 809 #$$ %
· :! ·
碱性纤维素酶及其应用的研究进展
刘! 刚，余少文，孔! 舒，邢! 苗!
（深圳大学生命科学学院! 深圳市微生物基因工程重点实验室，深圳 %;<$=$）
摘! 要：碱性纤维素酶在碱性条件下具有内切 ">;，? 葡萄糖苷酶活力，在加酶洗涤剂等行业具有重要的应用价值。
目前已发现由芽孢杆菌和链霉菌产生的多种碱性纤维素酶，其中大部分的基因已被克隆、测序和表达，其催化反应
特性、反应机理和应用也得到了较深入的研究。从碱性纤维素酶的产生菌、酶反应特性和反应机理、碱性纤维素酶
的基因克隆和表达，以及碱性纤维素酶的应用等几个方面，介绍了有关碱性纤维素酶的最新研究进展。
关键词：碱性纤维素酶；芽孢杆菌；链霉菌；加酶洗涤剂
中图分类号：@<;! ! ! ! 文献标识码：A! ! ! ! 文章编号：;=B# C "=B<（# $$%）$# C$$ $: C$=
!"#"$% &’(&$#") *+ &,-&,.$" #",,/,&)" &$’ .%) &00,.#&%.*$DEF G0)7，HF I’0->J*)，KLMG I’.，NEMG 8(0- （&-11*7* -2 D(2* I5(*)5*+，I’*)O’*) F)(P*/+(Q9，I’*)O’*) K*9 D0R-/0Q-/9 -2 8(5/-R(01 G*)*Q(5 6)7()**/()7，I’*)O’*) %;<$=$，&’()0） 12)%3&#%：A1S01()* 5*11.10+* *T’(R(Q+ 05Q(P(Q9 -2 ">;，? *)U-7195-+(U0+* () Q’* 01S01()* *)P(/-)V*)Q，0)U 0/* *TQ*)+(P*19 .+*U 0+ 0UU(Q(P* () Q’* U*Q*/7*)Q 4/-U.5Q(-)W M-J P0/(-.+ 01S01()* 5*11.10+*+ 0/* 4/-U.5*U R9 +Q/0()+ -2 !"#$%%$0)U &’()*’+,-#)& ，-2 J’(5’ V-+Q 7*)*+ ’0P* R**) 51-)*U，+*X.*)5*U 0)U *T4/*++*U， 0)U Q’* 50Q019Q(5 5’0/05Q*/(+Q(5+ 0)U V*5’0)(+V+ ’0P* R**) J*11 +Q.U(*UW Y’* /*5*)Q 0UP0)5*+ () 01S01()* 5*11.10+* /*+*0/5’ () Q’* 0+4*5Q+ -2 +-./5* +Q/0()+，50Q019Q(5 5’0/05Q*/+ 0)U V*5’0)(+V，0)U 01S01()* 5*11.> 10+* 7*)* 51-)()7 0)U *T4/*++(-) 0/* /*P(*J*U () Q’* 4/*+*)Q 404*/W E) 0UU(Q(-)，Q’* 0441(50Q(-) 0)U Q’* 2.)5Q(-) -2 01S01()* 5*11.10+* () U*Q*/7*)Q J*/* *P01.0Q*UW 4"5 6*3’)：01S01()* 5*11.10+*；."#$%%/&；0’()*’+,-#)&；*)O9V* *)’0)5*U U*Q*/7*)Q+
! ! 碱性纤维素酶于 #$世纪 B$ 年代被发现，主要
由在碱性环境中生长的芽孢杆菌和链霉菌产生。其
最适 4Z值处于碱性范围，而且具有水解细小织物
纤维的能力，因此可以作为洗涤用酶。碱性纤维素
酶加入到洗涤剂中不仅可以增强洗涤效果，而且对
衣物还具有柔软、增艳的作用，其发现和应用被称为
洗涤剂工业的一次技术革命。本文将从碱性纤维素
酶的产生菌、酶催化反应特性和反应机理、碱性纤维
素酶基因及其表达、碱性纤维素酶的应用等几个方
面介绍近年来国内外碱性纤维素酶的研究进展。
78 产生菌及分离方法
;[ ;! 碱性纤维素酶的产生菌
碱性纤维素酶最早在 #$世纪 B$ 年代由日本学
者 Z-/(S-+’( 等从两株嗜碱性的芽孢杆菌（."#$%%/& +4[ M>? 和 ."#$%%/& +4[ ;;":）的培养物中发现［; \ "］。
此后，国内外学者又陆续分离到数十株产生碱性纤
! 收稿日期：# $$%>$">"$ 基金项目：深圳市科技计划项目（#$$ #;=）
作者简介：刘! 刚（;:=:>），男，湖北京山人，博士，副教授，研究方向：基因工程，酶工程等。
联系人：邢! 苗，Y*1：<=>B%%>#=%"?:BB；]0T：<=>B%%>#=%"==#:；6>V0(1：O^.1(.7_ +O.W *U.W 5)万方数据
! · "#! · 生物加工过程 第 $卷第 % 期 维素酶的芽孢杆菌，如 &’()*$+ 菌株、&’()", 菌
株、&’()*- 菌株、&’()+%# 菌株、&’()’%$. 菌株、 /$0)% 菌株、1"*0)" 菌株、23-$菌株、34*0 菌株、 ’53)" 菌 株、1*)%. 菌 株、3’3)0"# 菌 株、 !6 "#$%&’()*" 7’" 等［- 8 ".］。除了芽孢杆菌以外，链霉
菌属的一些种也可以合成碱性纤维素酶，如 9:;
’<=>;?@;等从盐湖的土壤中分离到的嗜碱性链霉菌
+,’&#,-./)&" AB6 ""CD0［"0］、E:A>=9: 分离得到的嗜碱
性链霉菌 +,’&#,-./)&" AB6 &’(),［"#］、E:FGH@ 也分离
的 +,’&#,-./)&" AB6 ’$*)%［",］等。 "6 %! 碱性纤维素酶产生菌的分离方法 分离碱性纤维素酶产生菌的传统方法为羧甲基 纤维素（2(2）平板筛选法。从碱性土壤中分离到 大量嗜碱性微生物后，用含 2(2 的平板进行筛选， 并用刚果红对平板进行染色，能在 2(2平板上产生 透明圈的菌落即为纤维素酶的产生菌。最近出现了 一种直接从环境中分离碱性纤维素酶基因的方法。 从碱性环境中取土样，并对所取的样品进行富集培 养，然后从富集培养的样品中分离 E1C 并建立 E1C文库。将所建立的文库在大肠杆菌中进行表 达，并在含 2(2 的平板上进行筛选，能够形成透明 圈的菌落即含有碱性纤维素酶的基因。DI:;J 等采 用这一方法直接从非洲的一些盐湖中分离到了两个 碱性纤维素酶的基因［%#］。 !" 碱性纤维素酶的性质和催化反应机理 %6 "! 碱性纤维素酶的性质 不同来源的碱性纤维素酶在诸多方面有差异， 如分子量、蛋白质结构、催化反应特性、热稳定性等。 按照其分子量的大小，芽孢杆菌属产生的碱性纤维 素酶可以分为两类。一类为低分子量的碱性纤维素 酶，其相对分子质量在 %- ### 至 -# ### 之间，如 1) - 菌株所产生的 K@=C和 K@=/、1"0*)" 菌株所产生的 K@=/"、23-$ 和 34*0 菌株产生的碱性纤维素酶
等［,，"$，%"］；另一类为高分子量的碱性纤维素酶，其相 对分子质量在 0# ### 至 "$# ### 之间，如 &’()*$+ 菌株产生的 L)M和 L)3、&’()’%$. 菌株产生的 L?=)
%$.、""$, 菌株产生的碱性纤维素酶等［%，+，.］。虽然
同为碱性纤维素酶，不同来源的酶对较高 B3 值的
耐受性有较大差异。有些碱性纤维素酶的最适 B3
值为 .，但在 B30 8 , 的条件下仍具有较高的活性，
如来源于菌株 1"0*)" 的 K@=/"［0］；有的最适 B3 值
可以达到 ,6 + 左右，如来源于菌株 &’()*$+ 的 L)M 和 L)3［+］；而有的则具有较宽广的最适 B3 值，如来 源于菌株 1)- 的碱性纤维素酶在 B3+ 8 "# 的活性 不发生显著变化，来源于菌株 23-$ 和 34*0 的碱
性纤维素酶在 B3* 8 "# 的范围内无显著的差
异［,，%"］。一般而言，由芽孢杆菌所产生的纤维素酶
具有较高的热稳定性，在 +# N处理 $# F>; 仍可以 保持 0#O以上的活性。23 -$ 菌株和 34 *0 菌株
是从津巴布韦的温泉中分离的芽孢杆菌，来源于这
两个菌株的碱性纤维素具有相当高的热稳定性，在
+#N处理 "P后仍可以保持 "##O的活性［,］。
5F:JAG 等［+］采用两步柱层析对 &’()*$+ 菌株的培养物进行分离纯化得到了碱性纤维素酶的 两个组分 L)3 和 L)M。L)3 的相对分子质量为 "$# ###，其比活力为 $- Q R F? 蛋白，在培养液中其 活性占总活性的 .#O；L)M 的相对分子质量为 "#$ ###，其比活力为 +, Q R F? 蛋白，其活性占培养
液总活性的 $#O。尽管相对分子质量和比活力有 差别，这两种酶的催化性能非常相似。其最适 B3 都为 ,6 +，在 B3* 8 "" 的范围内，其活性可以长期稳 定，但一旦超出这个范围，酶迅速失活。L)3和 L)M 对不同底物的水解效率以及受表面活性剂和金属离 子的影响列于表 " 和表 %。这两种酶均对表面活性 剂具有较高的耐受性，而且其催化活性也不受螯合 剂的抑制，能适应洗涤用酶的要求。 (:S:HT:等［,］对来源于两株耐高温嗜碱性芽孢 杆菌（菌株 23-$ 和 34*0，分离自津巴布韦的温泉
中）的纤维素酶进行了分离纯化并研究了其催化特
性。为叙述方便起见，本文将 23-$菌株所产的碱 性纤维素酶称为 L23-$，将 34*0 菌株所产的碱性
纤维素酶称为 L34*0。L23-$和 L34*0 的相对分 子质量都为 -# ###，属于芽孢杆菌所产的低分子量 纤维素酶。L23-$ 和 L34*0 对不同底物的水解效
率以及受金属离子和表面活性剂的影响列于表 " 和
表 %。这两种酶的活性不受螯合剂 LEUC 的影响，
但完全被表面活性剂如 ’E’ 和 US@@;0# 抑制，因此
不适合作为洗涤用酶。
来源于菌株 1"0*)" 的碱性纤维素酶 K@=/" 和
来源于菌株 1)- 的碱性纤维素酶类似，相对分子质
量为 -# ###［0］。其活性受 2<% V和 (;% V的激活，略
受 2G% V和 3?% V的抑制，几乎不受表面活性剂的抑
制，是一种有潜力的洗涤用酶，其部分性质列于表
%。
大多数碱性纤维素酶对结晶纤维素如微晶纤维
素、滤纸等都不具有有效的水解能力（见表 "），表明万方数据
! "##$年$ 月 刘! 刚等：碱性纤维素酶及其应用的研究进展 · %%! ·
多数碱性纤维素酶只具有内切葡萄糖苷酶的活性，
而不具有外切葡萄糖苷酶的活性，因为后者可以水
解结晶纤维素［""］。
表 %! 不同来源的碱性纤维素酶对底物的要求
&’()* %! &+* ,-(,./’.* ,0*123212.2*, 43 5233*/*6. 7265, 43 ’)7’)26*
1*))-)’,*,
底物
相对酶活力 8 9
:;< :;= :>>D> %## %## B"E B F?E B
地衣纤维素 C@E C GFE # HI HI
!;葡聚糖 HI HI %## %##
微晶纤维素 J ?E F J "E $%#E % "GE B 滤纸 J ?E F J "E$ $E % @?E F 磷酸膨化纤维素 J ?E F J "E$ HI HI
注：HI为文献中未测定的指标。:;< 和 :;= 的数据来源于
文献［$］；:>活力是以每一种酶催化最适底物的酶活性为 %##9进行计
算的。
表 "! 金属离子或表面活性剂对碱性纤维素催化活性的影响
&’()* "! &+* *33*1. 43 K*.’) 246, 4/ ,-/3’1.’6., 46 ’1.2L2.2*, 43
’)7’)26* 1*))-)’,*,
金属离子或
表面活性剂
对酶活性的影响
:;= :;< :>*)M%
>4" N O O O O O
D6" N H H P P O
>’" N H H H H H
RQ N HI HI P O HI
OIO H H P P HI
:I&R H H HI HI H
&S**6C# HI HI P P HI
注：O表示激活作用，P 表示抑制作用，H 表示无影响，HI 为
文献中未测定的指标。:;<和 :;= 的数据来源于文献［$］； :>?@ 和 :<ABC 的数据来源于文献［G］；1*)M% 的数据来源<br于文献［C］。 "E "! 酶催化反应机理 研究酶催化反应机理的主要途径是首先找出酶 活性中心的氨基酸残基（包括接触残基和辅助残 基），然后通过合适的物理、化学方法确定酶活性中 心各基团与底物之间的相互作用，以此为依据推断 酶活性中心各种氨基酸残基在底物转化中的作用以 及底物转化的分子机理。对纤维素酶以及碱性纤维 素酶催化反应机理的研究也是如此。";脱氧;";氟代 糖苷是一种活泼的纤维素类似物，可以和酶分子活 性中心解离的羧基形成稳定的复合物。将这种化合 物与来源于芽孢杆菌 !E "#$"%&’() 的纤维素酶
（M>T）混合后，用胰蛋白酶进行水解，对水解产物
进行液质联用质谱分析，可以确定 ";脱氧;";氟代糖
苷与 M>T 上 U)-FC 结合［"@］。另外，用中性的氨基
酸如 R)’ 代替 U)- 后，酶的催化活性几乎完全丧
失［"?］。上述研究表明 U)-FC 参与了酶催化反应。
VW’72等采用定点突变技术对来源于菌株 !’"#&&%)
,0E XOD;@@# 的纤维素酶进行氨基酸置换的研究，发
现一个 U)-、三个 R,0和两个 &/0残基对酶催化反应
不可缺少［"$］。 综合上述研究结果，再结合对纤维素酶晶体结 构的分析，可以推断纤维素酶对糖苷键的水解主要 通过酶活性中心的天门冬氨酸或谷氨酸上的羧基完 成。酶活性中的两个羧基以不同的解离状态存在， 一个为解离的、带负电荷的羧基，另一个为非解离 的、不带电荷的羧基。首先由带负电荷的羧基对 !; %，? 糖苷键上的一号碳原子进行亲核攻击，形成碳 氧离子的过渡态，另一个非解离状态的羧基同时对 !;%，? 糖苷键上的氧原子进行亲电攻击，并形成氢 键，使 !;%，? 糖苷键上的 >;V 单键不稳定而断裂。 糖苷键断裂而得到的其中一个葡萄糖残基和酶活性 中心的非解离态的羧基以氢键相连，很容易从酶分 子上脱离，得到自由的葡萄糖残基和酶活性中心的 羧基。另一个葡萄糖残基以共价键和酶活性中心的 羧基相连，这种连接在另一个自由羧基的亲核攻击 下断裂，酶分子还原，并产生两个短的纤维素分子， 酶水解完成，如图 % 所示［"B］。 !" 碱性纤维素酶的基因及其表达 @E %! 碱性纤维素酶的基因 现代基因克隆技术已发展得非常成熟，大部分 碱性纤维素酶的基因已被分离、克隆和测序。至 "##@ 年 ? 月，在 U*6*(’67 上发布的碱性纤维素酶 的基因序列为 %B 个，在 IIMY上发布的碱性纤维素 酶的基因序列为 %$ 个，在 :DMA 上发布的碱性纤
维素酶的基因序列为 "# 个。扣除重叠的部分，总共
有 "?个碱性纤维素酶的基因被克隆和测序，其中大
部分来源于芽孢杆菌，少数来源于链霉菌。Z-7-K4/2
等［"%，"F，"C］在 "# 世纪 C# 年代对芽孢杆菌 !’"#&&%)
,0E %%@G和 !’"#&&%) ,0E H;?的碱性纤维素酶基因进行
了克隆和测序。在 H;? 菌株中分离到 @ 个碱性纤维
素酶基因 1*)R、1*)M和 1*)>，并按照其开放式阅读框
（VZA）的核苷酸序列推断出其所编码的纤维素酶万方数据
! · "#! · 生物加工过程 第 $卷第 # 期 图 "! 碱性纤维素酶对 !%"，& 糖苷键的水解机理 ’()* "! +,- .-/,01(2. 34 )56/32(7- ,8793582(2 :8 05;05(1- /-556502- 的氨基酸序列，分别含 &<<，&=> 和 >== 个氨基酸残 基。从 " "$> 菌株中分离出 /-5’ 的基因，编码约
<== 个氨基酸的碱性纤维素酶。上述 & 种基因分别
在大肠杆菌表达体系中得到了表达，表达产物具有
碱性纤维素酶活性，而且分子量与菌株 ?%& 和 " "$>
所产的碱性纤维素酶相当。碱性纤维素酶 /-5’ 与
/-5@的同源性较高，但与 /-5A 和 /-5B 同源性较低。
C01/,-D%+399-2等［<］采用表达型 E?A 文库对菌株
?"得到具有碱性纤维素酶的阳性克隆。随后他们根据
碱性纤维素酶的保守序列设计简并的 G@H引物，成
功克隆了一段 # I== :J 的序列，其中含有一个
K’H，编码相对分子质量为 $> === 的蛋白。将该 K’H 的编码序列用含大肠杆菌细胞外膜蛋白 （K.J+）信号肽的表达载体进行表达，得到具有碱 性纤维素酶活性的蛋白 /-5B"，其相对分子质量为$> ===，与菌株 ?"菌株 LCM%F$I 的一个碱性纤维素酶基因的编码区 域有 # <#$ 个碱基，编码含 >&" 个氨基酸的蛋白，除
去一段 #> 个氨基酸的信号肽，成熟蛋白的相对分子
质量为"=" &==，与该菌株所产的碱性纤维素酶 N%O
相当［"P］。Q01 C35(1)-1 等［"<］对链霉菌 !"#$%"&’()$*
2J* CR90(1 ""AS< 的碱性纤维素酶基因（ /-5"#A）进
行了克隆和测序。该基因全长 " ""$:J，编码$P"
个氨基酸的碱性纤维素酶，在枯草杆菌中的表达产
物具有碱性纤维素酶的活力，与菌株 ""AS< 所产的
酶具有相同的特性。和芽孢杆菌所产的纤维素酶不
同的是，/-5"#A与来源于真菌的纤维素酶具有较高
的同源性，而且和真菌纤维素酶类似，/-5"#A 的序
列中也含有一个 "=P 个氨基酸组成的 @BE，一个由
##" 个氨基酸组成的催化域（/0R058R(/ 73.0(1）和一
个由 "# 个氨基酸组成的连接序列（ 5(1;-9 J-JR(7-）。
$* #! 碱性纤维素酶基因的表达 多数研究者在完成碱性纤维素酶基因的克隆和 测序后，也进行了碱性纤维素酶基因的表达。 C01/,-D%+399-2等［<］将碱性纤维素酶基因 /-5B" 克隆 到质粒 JN+""7 中，并在大肠杆菌中进行了表达，发 现表达产物以无活性的包涵体积累在大肠杆菌细胞万方数据 ! "##$ 年 $月 刘! 刚等：碱性纤维素酶及其应用的研究进展 · %&! · 内。由此可见，’()*% 本身的信号肽并不能成功地使 重组大肠杆菌表达的产物分泌到胞外。当采用大肠 杆菌外膜蛋白的信号肽时，可以实现 ’()*% 在大肠 杆菌的细胞周质中的表达，表达产物具有碱性纤维 素酶活性。+,- ./)0-1(- 等［%2］分别用大肠杆菌表达 系统和枯草杆菌表达系统对链霉菌的 ’()%"3 基因 进行了表达，发现重组大肠杆菌的表达量极微，而在 枯草杆菌中得到了可观的表达。.4506/5/ 等［"7］从 工业化生产的角度进行了碱性纤维素酶基因在大肠 杆菌和枯草杆菌中的表达，将菌株 8.9:;< 中碱性 纤维素酶的基因克隆到大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的 穿梭载体 =>? &## =@8 中，利用碱性纤维素酶本身 的启动子和核糖体结合位点实现了重组纤维素酶的 高效表达，在枯草芽孢杆菌中重组碱性纤维素酶的 表达量可达 &# 1 A @的水平。 !" 碱性纤维素酶的应用 碱性纤维素酶工业应用价值主要在于增强洗涤 剂的使用效果。研究表明，用含有碱性纤维素酶的 洗涤剂洗涤衣物时，碱性纤维素酶与衣物纤维的相 互作用可以加快尘土等污迹从衣物上洗下来。衣物 经过穿戴:洗涤过程后，部分污迹被衣物上的细小纤 维包裹而形成复杂的复合物而难以被普通的洗涤剂 洗脱下来。因此衣物经过反复的穿戴:洗涤过程后 难以避免出现陈旧感，其表面性质如手感等也会因 污迹的积累而发生变化。在洗涤剂中加入碱性纤维 素酶可以将衣物表面的一些细小的纤维降解，并使 附着在衣物上的一些顽固性污迹被洗脱下来，从而 可以避免衣物经反复穿戴:洗涤后出现陈旧感。另 一方面，由于碱性纤维素酶一般不具有外切葡萄糖 苷酶活性，不能作用于结晶纤维素，因此即使经过反 复洗涤，棉麻织物的强度和表观聚合度均不会发生 显著的改变［&#］。 碱性纤维素酶必须具有下列特性才能作为洗涤 用酶：%）在碱性条件下具有较高的活性，酶催化反 应的最适 BC值最好大于 7D #；! "）可以耐受洗涤剂 中的表面活性剂如 .E.、FEG3 等；! &）热稳定性 好，至少能在$# H保温 &# 50- 后活性不发生显著
的变化，因为固体洗涤剂在成型过程中须经过较高
温度的处理。在迄今发现的碱性纤维素酶中已有数
种可以满足这些条件，如 I6/等由芽孢杆菌 8.9:;&$
制备的碱性纤维素酶制剂、.>0J,6, 等从芽孢杆菌
8.9:;< 中分离的碱性纤维素酶制剂等。在保障碱
性纤维素酶具有较高催化活性的前提下，提高其热
稳定性可以减少在洗涤剂加工、储存、运输过程中酶
活性的损失。很多学者在这一方面进行了出色的工
作，如 9,K,LM,等［7］从温泉中筛选耐热的碱性纤维
素酶，NM,K,等［&%］从蛋白质工程的途径提高碱性纤
维素酶的热稳定性等。随着对碱性纤维素酶分离、
筛选工作的深入，以及新技术的应用，人类必将可以
找到性能更为优良的碱性纤维素酶。
#" 结" 论
碱性纤维素酶主要由芽孢杆菌和链霉菌产生，
在碱性条件下具有内切 !:%，< 糖苷酶的活性。迄今
已发现 "# 余种碱性纤维素酶，其中大部分的结构、
性质已得到了较深入的认识，其基因也已得到了克
隆、测序和表达。不同菌株产生的碱性纤维素酶在
分子大小、结构、催化反应特性等方面既有共性又具
有各自的特点。碱性纤维素酶的催化反应机理已被
初步阐明，主要通过酶活性中心的两个羧基分别对
纤维素分子内 !:%，< 糖苷键进行亲核攻击和亲电攻
击而使之水解。有些碱性纤维素酶因具有耐热性和
对表面活性剂不敏感而被用作洗涤用酶，含碱性纤
维素酶的洗涤剂具有很高的去污效果，并具有柔软
和增艳的作用。应用基因工程技术生产碱性纤维素
酶是提其高产量的捷径，一般而言，用革兰氏阳性的
枯草芽孢杆菌表达系统进行重组碱性纤维素酶的表
达要优于革兰氏阴性的大肠杆菌表达系统，但为了
适应工业应用的需求，表达水平仍有待于提高。
参考文献：
［%］! 徐 卿，高红亮，黄! 静，等O洗涤剂用碱性纤维素酶的研究进
展［P］O微生物学通报，"##"，"7：7#:7［"］! Q4J45/R0 Q，84L/ G，C/R0J/S>0O =4R0T0’,60/- ,-L BR/B(R60(S /T ,
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