全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
高碱性纤维素酶产生菌的筛选及鉴定
吴琼1 苑琳1, 2 路福平 2 申明华 1 刘纯燕 1 白宇辰 3
( 1内蒙古大学生命科学学院,呼和浩特 010021; 2天津科技大学生物工程学院工业
微生物重点实验室,天津 300222; 3北京理工大学理学院,北京 100081)
摘 要: 从化纤厂土样中分离得到菌株 AC4, 碱性纤维素酶活力达 0602 IU /mL。通过分析菌株形态学特性、培养特
征及 16S rDNA序列,确定该菌株为短小芽孢杆菌。对该菌所产碱性纤维素酶的酶学性质进行测定, 确定其最适作用 pH为
9 5, 最适作用温度为 50 。
关键词: 碱性纤维素酶 筛选 16S rDNA 系统发育树 短小芽孢杆菌
Screening and Identification of an Alkaline Cellulaseproducing Strain
W uQ iong
1
Yuan L in
1, 2
Lu Fuping
2
ShenM inghua
1
L iu Chunyan
1
BaiYuchen
3
(
1
College of L ife Science, InnerM ongolia University, H uhhot 010021; 2K ey Laboratory of IndustrialM icrobiology,
College of B iotechnology, T ianjin University of Science and T echnology, T ianjin 300222;
3
Schoo l of Science,
B eijing Institude of T echnology, Beijing 100081)
Abstrac:t A stra in produc ing a lkaline ce llulase was iso lated from the so il co llected from chem ica l fiber factory. The a lka line ce l
lu lase activ ity reach 0 602 IU /mL. Based on its m orpho log ic and cultural character istics and the sequence o f 16S rDNA, the stra in w as
determ ined as Bacillus pum ilus. The optim um reaction pH o f the alka line ce llu lase is 9 5, and the optimum reaction temperature
is 50 .
Key words: A lka line ce llu lase Sc reening 16S rDNA Phy logenetic tree Bacillus pum ilus
收稿日期: 20100412
基金项目:国家基础科学人才培养基金项目 ( J0730648)
作者简介:吴琼,女,本科,研究方向:发酵工程; Ema i:l mm gdxw uqiong@ 126. com
通讯作者:苑琳,女,讲师,博士研究生,研究方向:发酵工程; Em ai:l yuan0079@ 163. com
碱性纤维素酶是纤维素全酶的一个组分 ! ! ! 羧
甲基纤维素酶,属于葡聚糖内切酶,它不含有纤维素
酶全酶的其它两个组分: 葡聚糖外切酶和 葡萄糖
苷酶。碱性纤维素酶对天然纤维素的作用过程中不
能发生酶组分间的协同效应,它主要对棉纤维中占
10%左右的非结晶区的纤维素分子起作用, 对结晶
区纤维素水解活力很低, 所以并不会明显降低棉纤
维的牢固度 [ 1, 2]。碱性纤维素酶的这一特性使其在
洗涤剂、纺织、废水处理和制浆造纸工业等行业中有
更好的应用效果 [ 3]。碱性纤维素酶主要由碱性环
境中生长的芽孢杆菌和链霉菌产生 [ 4] , 近年我国也
有学者筛选获得了产碱性纤维素酶的革兰氏阴性
菌 [ 5]。因芽孢杆菌属菌株具有抗逆性强、繁殖快
等优点, 目前研究最多的仍为芽孢杆菌属。从采
自化纤厂的富含纤维素的土样中筛选获得一株
产生碱性纤维素酶的菌株, 拟对该菌株进行鉴
定, 并对其合成的酶的性质进行测定, 意在为得
到优良的工业洗涤用纤维素酶产生菌奠定基础。
1材料与方法
11 材料
111 试验材料 试验用土样取自呼和浩特化
纤厂。
112 培养基 ( 1) Schaeffer生孢子培养基: A液:
酵母抽提物 012 g, 蛋白胨 020 g, 氯化钾 040 g,
七水合硫酸镁 0048 g, 氢氧化钠 0008 g, 蒸馏水
300 mL, pH调至 95; B液: 硝酸钙 0095 g,四水合
氯化镁 01 mg,硫酸亚铁 015 mg, 蒸馏水 100 mL,
pH 调至 95; 121 灭菌 20m in,用前将 300mL A液
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
与 100 mL B液混合。 ( 2)初筛培养基: 羧甲基纤维
素钠 100 g,七水合硫酸镁 03 g, 磷酸二氢钾 20
g,硫酸铵 14 g,氯化钙 03 g,七水合硫酸亚铁 50
mg,硫酸锰 16 mg,氯化锌 17 mg,氯化钴 20mg,
琼脂 180 g,蒸馏水 1 000mL, pH调至 95, 121 灭
菌 20m in,分装 (每皿 40 mL)。 ( 3)种子培养基:蛋
白胨 100 g,酵母粉 50 g,葡萄糖 100 g,磷酸二氢
钾 10 g, 无水碳酸钠 100 g, 蒸馏水 1 000 mL, pH
值调至 95, 121 灭菌 20m in。 ( 4)发酵培养基:羧
甲基纤维素钠 200 g,酵母膏 200 g,氯化钠 50 g,
七水合硫酸镁 10 g, 磷酸二氢钾 10 g, 蒸馏水
1 000 mL, pH调至 95, 121 灭菌 20m in。
113 试剂 Taq酶、dNTP、MgC l2溶液及 PCR反
应缓冲液均购自上海生工生物工程有限公司, 蛋
白酶 K、琼脂糖胶回收试剂盒、溶菌酶均购自大
连宝生物有限公司; 其它试剂均为市售分析纯及
生化试剂。
114 仪器 电热恒温培养箱 (上海一恒科技有
限公司 ) ,显微镜 (尼康 50i) ,恒温摇床 (上海欣蕊自
动化设备有限公司 ), 723可见分光光度计 (上海光
谱仪器有限公司 ) , Delta320pH计 (梅特勒–托利多
仪器有限公司 ), PCR仪 (美国 AB I公司 )。
12 材料
121 平板初筛 采用刚果红染色法 [ 6]对土样中
的菌株进行初筛。称取土样 5 g于 50 mL生孢子培
养基中, 37 , 150 r/m in振荡培养 48 h, 取培养液
01mL涂布于初筛培养基平板, 37 培养 2 - 4 d。
将长出的单菌落用牙签分别点接于 2个新的初筛平
板, 37 恒温培养 2- 4 d。待平板上长出菌落后,取
其中 1个平板,加入适量 1 mg /mL的刚果红溶液,
染色 1 h; 弃去染液, 加入适量 1 mo l/L的 N aC l溶
液,洗涤 1 h。若细菌能合成纤维素酶, 则其菌落周
围会出现清晰的水解圈, 用游标卡尺测定各菌株水
解圈直径和菌落直径, 将二者比值较大的菌株进行
保藏, 以备复筛。
122 摇瓶复筛 取一环斜面保藏菌种接于 30
mL种子培养基中, 37 , 150 r/m in振荡培养 24 h,
即得种子液。取 1 5 mL种子液接种于 30 mL新
鲜发酵培养基中, 37 , 150 r /m in振荡培养 48
h。将发酵液 5 000 r /m in离心 30 m in, 取上清 ,
即为粗酶液。
123 酶活测定方法 参照 QB25832003[ 7]附录
B所述方法测定, 缓冲液选用甘氨酸NaOH缓冲液
( 005 mo l/L, pH95)。酶活单位定义: 在 ( 50 ∀
01) 、pH 95条件下, 1 m in水解纤维素底物, 产
生出相当于 1 mo l葡萄糖的还原糖量,为 1个酶活
力单位,以 IU /mL表示。
124 16S rDNA序列的测定、分析及系统发育树
的构建 细菌基因组 DNA的提取参照文献 [ 8]进
行。以基因组 DNA为模板,扩增菌株 AC4的 16S
rDNA序列。引物: 27F: 5#AGAGTTTGATCCTGGCT
CAG3#; 1492R: 5#TACGGTTACCTTGACGACTT3#。
反应体系:总体积 50 L, 其中基因组 DNA 6 L, 引
物各 1 L, dNTP 4 L, M g2+ 4 L, 10 ∃ buffer 5 L,
Taq DNA聚合酶 1 L, ddH 2O 28 L。 PCR反应程
序: 94 5m in; 94 1m in, 55 1m in, 72 15m in,
30个循环; 72 5m in。PCR扩增产物使用 T aK aRa
琼脂糖胶回收试剂盒进行纯化, 交由上海生工生物
工程有限公司完成测序。将菌株 AC4的 16S rD
NA序列输入 GenBank中进行序列比对,将该菌株
序列与比对结果中同源性高的序列一起输入
C lustal x183进行全序列比对。利用软件 MEGA
31分析该序列碱基组成, 并以 K imura2参数计
算遗传距离,采用 N j邻接法构建系统发育树, 在分
支上标记 1 000次重复获得的自展检验 Bootstrap
值。
2 结果与分析
21 菌株的分离筛选
通过对样品中微生物进行分离和初筛,筛选共
得到 9株产生水解圈的菌株, 水解圈如图 1所示。
对这 9株菌株产碱性纤维素酶活力进行摇瓶发酵测
定, 结果见表 1。由表 1可以看出, 菌株 AC4产酶
活力最高,进行进一步的研究。
206
2010年第 9期 吴琼等 :高碱性纤维素酶产生菌的筛选及鉴定
由表 1数据绘制酶活力与水解圈直径及菌圈比
的相关性曲线 (图 2)。由图 2可见, 菌圈比与酶活
力的相关性更为明显, 因为水解圈的大小不仅取决
于酶活力的大小,在一定程度上还与菌落的直径大
小有关。例如 AC8, 虽然水解圈直径最大,但酶活
力却不是最大。因此利用刚果红染色法进行初筛
时,选择菌圈比较大的菌株比水解圈较大的菌株更
为可靠。
图 1 初筛平板上形成的水解圈
表 1 分离菌株菌落直径、水解圈直径及酶活力
编号 菌落直径 ( cm )
水解圈
直径 ( cm )
水解圈直径 /
菌落直径
酶活力
( IU /mL)
AC1 0644 1760 273 0349
AC2 0580 1374 237 0352
AC3 0662 1786 270 0541
AC4 0600 1772 295 0602
AC5 0642 1584 247 0426
AC6 0706 1486 210 0298
AC7 0594 1478 249 0308
AC8 0962 2374 247 0336
AC9 0528 1162 220 0276
图 2 酶活力与水解圈直径和菌圈比的关系
22 分离菌株的鉴定
221 菌株形态及培养特征 菌体呈短杆状,很少
成链,大小约为 06 m ∃ 20 m,具内生芽孢,革兰
氏染色呈阳性,如图 3所示。在普通琼脂培养基中
培养,菌落较小,呈乳白色,菌落表面光滑,有光泽。
图 3 菌株 AC4革兰氏染色结果
222 16S rDNA序列分析及系统发育树的构建 菌
株 AC4的 16S rDNA序列全长 1 547 bp。将该序列
输入 NCB I, 以 B last进行序列同源性比对, 结果显示
菌株 AC4与短小芽孢杆菌 ( Bacillus pum ilus )具有
较高同源性 ( % 99% )。以菌株 AC4的 16S rDNA
序列为基础构建系统发育树 (图 4), 菌株 AC4与
短小芽孢杆菌处于同一分支,结合其生物学特性,可
以确定菌株 AC4为短小芽孢杆菌。
207
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
图 4 基于菌株 AC4 16S rDNA的系统发育树
23 酶学性质的初步测定
231 酶的最适作用 pH 分别采用柠檬酸 柠檬
酸钠 ( pH40 - 60)、NaH2 PO4 N a2HPO4 ( pH70 -
80)、甘氨酸NaOH ( pH90 - 100)组成的缓冲体
系,配制不同 pH值的缓冲液。以不同 pH值的缓冲
液稀释酶液,并以相应 pH值的缓冲液配制的 CMC
N a溶液作为底物, 50 反应 30 m in后,测定酶在一
系列不同 pH值下的活力, 结果见图 5。由图 5可
见, 该酶的最适作用 pH为 95。
232 酶的最适作用温度 用 pH 95的甘氨酸
NaOH缓冲液稀释酶液并配制 pH95的 CMCN a溶
液, 在不同温度下分别反应 30m in,测定酶在各温度
下的酶活力,结果见图 6。由图 6可见, 该酶的最适
作用温度为 50 。
图 5 酶的最适作用 pH
图 6 酶的最适作用温度
3 讨论
目前碱性纤维素酶的酶活测定方法众多, 特别
是 DNS的配制方法差别较大, 采用不同的方法测定
所得结果也不相同, 加之酶活单位的定义也不尽相
同,因此,很难对已报道的菌株进行比较。为了方便
比较与研究, 本试验选用国家轻工业部颁标准 QB
25832003所述方法对碱性纤维素酶活力进行测
定,并以国际单位表示。
碱性纤维素酶应用广泛,但我国暂时还没有优
良的生产菌株,仍需进一步研究。罗巅辉 [ 9]筛选得
到一株嗜碱性菌株 XW12,所产碱性纤维素酶在 pH
80、50 下酶活达 4554 IU /mL。李忠玲等 [ 10]筛选
得到的一株兼性厌氧菌株 LZ5,碱性纤维素酶活力
达 58 IU /mL, 该酶最适作用温度为 40 ,最适作用
pH值为 90。徐庆强等 [ 11]筛选得到海洋细菌 QM11,
碱性纤维素酶活力可达 138 15 IU /mL, 其最适作
用温度为 40 , 最适作用 pH 为 90。本试验筛
选得到一株短小芽孢杆菌 AC 4, 碱性纤维素酶
活力为 0 602 IU /mL, 其最适作用温度为 50 ,
最适作用 pH高达 9 5。与已报道的生产菌株相
比, 菌株 AC 4所产碱性纤维素酶耐碱性更强, 有
望在洗涤剂、造纸业等方面发挥更大作用, 因此 ,
菌株 AC 4及其所产碱性纤维素酶具有进一步研
究的意义。
208
2010年第 9期 吴琼等 :高碱性纤维素酶产生菌的筛选及鉴定
参 考 文 献
[ 1 ] Ram os LP, Nah zadM, Sadd ler JN. E ffect of en zymat ic hydrolys is on
the m orpho logy and fine stru cture of pretreated cellusolic residues.
E nzym eM icrob Techno,l 1993, 15: 821831.
[ 2] B othw ellM, Daughh ete S, Chau a G, et a1. B ind ing capacilities for
Th erm onmonspora fu sca E3, and E4. Th e E3 b ind ing dom ain and
T richod erma reesei CBH I on avicel and b acteria lm icrocrysta llie cel
lu lase. B iores Techno,l 1997, 60 ( 2) : 169178.
[ 3] 徐韡卿,高红亮,黄静,等.洗涤剂用碱性纤维素酶的研究进展.
微生物学通报, 2002, 29( 6 ) : 9094.
[ 4] 刘刚,余少文,孔舒,等.碱性纤维素酶及其应用的研究进展.生
物加工过程, 2005, 3( 2) : 914.
[ 5] 刘森林,邢苗,刘刚,等.碱性纤维素酶革兰氏阴性菌株筛选及酶
学性质研究.微生物学通报, 2005, 32( 4 ): 9194.
[ 6] C antw ell BA, M cC onnell DJ. M olecu lar clon ing and exp ress ion of a
B acillus su btilis glucanase gene in E scherich ia col i. Gen e, 1983,
23( 2) : 211219.
[ 7] 全国食品工业标委会工业发酵分委会. QB 25832003,纤维素酶
制剂 [ S] .北京:中国标准出版社, 2003.
[ 8] 张洪勋, 郝春博, 白志辉, 等. 一种湿法冶金中嗜酸菌基因组
DNA的提取方法:中国, CN 1990864A[ P] . 2007.
[ 9] 罗巅辉.产碱性纤维素酶菌株的筛选、发酵条件优化与性质研
究.辽宁师范大学学报:自然科学版, 2008, 31( 3) : 353356.
[ 10] 李忠玲,王卫卫,任平,等.产碱性纤维素酶兼性厌氧菌株的筛
选和酶学性质的初步研究.微生物学通报, 2008, 35 ( 6 ) : 851
854.
[ 11] 徐庆强,张志明,王延明,等.产碱性纤维素酶海洋细菌的筛选、
鉴定及酶学性质研究.试验与技术, 2009, 33( 7) : 15.
(上接第 204页 )
[ 20 ] 谷文彬,冯丽杰.致犊牛腹泻产肠毒素大肠杆菌及其检测.畜牧
兽医科技信息, 2006, 10: 48.
[ 21 ] 杨少华,柴同杰.利用多重 PCR检测免肠致病性大肠杆菌和魏
氏梭菌的毒力基因.中国预防兽医学报, 2006, 28 ( 2) : 228230.
[ 22 ] 陈祥,高松,王雷,张小荣,刘秀梵.多重 PCR检测猪源大肠杆菌
毒素基因.扬州大学学报, 2003, 24 ( 3) : 1214.
[ 23 ] 闻晓波,崔玉东,朱战波, 朴范泽. 牛产肠毒素大肠杆菌毒力因
子多重 PCR检测方法的建立. 中国兽医学报, 2007, 27 ( 3 ):
322324.
[ 24 ] B oerlin P, Reb eccah T, Gyles CL, et a.l Ant im icrob ial res is tan ce and
viru len ce gen es of E scherich ia coli isolates from sw ine in On tario.
App lied and env ironm en tal m icrob iology, 2005, 71 ( 11 ):
67536761.
[ 25 ] Ben jel loun TZ, S anainet iPJ, Parsot C. SepA, the m ajor extracellu lar
protein ofSh ige lla f lexn eri: autonomous secret ion and involvem en t in
t issue invas ion. Mo lecularM icrob iology, 1995, 17( 1) : 123135.
[ 26 ] Naru iK, Noguch iN, W akasugiK, SasatsuM. C lon ing and ch aracter
ization of a novel ch rom osom al d rug efflux gen e in S taphylococcus
aureu s. B iol Pharm B ul,l 2002, 25( 12) : 15331536.
209