全 文 :第 12卷第 6期
2014年 11月
生 物 加 工 过 程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Vol 12 No 6
Nov 2014
doi:10 3969 / j issn 1672-3678 2014 06 005
收稿日期:2013-11-15
基金项目:国家自然科学基金(50678102,50978164);上海师范大学科技基金(SK201228)
作者简介:李梅梅( 1990—),女,江苏盐城人,硕士研究生,研究方向:微生物分子生物学; 陈 军 (联系人),副教授,E⁃mail: cj7206@
shnu edu cn
氯过氧化物酶发酵相关指标及其关联性分析
李梅梅,戴佳伟,李新国,陈 军,吴霞琴
(上海师范大学 生命与环境科学学院,上海 200234)
摘 要:通过考察氯过氧化物酶(CPO)发酵相关参数的动力学特征,探究酶产量与参数之间的关联性。 结果表明:
CPO发酵过程中慢速 C源麦芽糖比葡萄糖更有利于调控 CPO的稳定合成,前者 CPO 最高比酶活(179 50 U / mL)
比后者(135 U / mL)高出 44 5 U / mL,而且产酶高峰期延迟 1~2 d;发酵过程 pH波动与 C源消耗速率密切相关,且
对 CPO合成具有明显的指标性作用。 通过生物量曲线及糖消耗曲线与产酶特征对比判断,菌株合成 CPO 为中期
合成类型。 副产物黑色素是菌体成熟时期的一种次生代谢物质,与酶的生物合成存在时间上的同步性。 控制 C源
基质和 pH对提高 CPO稳定化生产具有一定成效。
关键词:Leptoxyphium fumago;氯过氧化物酶;发酵;关联性分析
中图分类号:Q814 4 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2014)06-0023-04
Correlation of fermentation parameters in chloroperoxidase production
LI Meimei,DAI Jiawei,LI Xinguo,CHEN Jun,WU Xiaqin
(College of Life and Environment Science,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)
Abstract:We correlated fermentation parameters of chloroperoxidase (CPO) fermentation to study the
relationship between enzyme yield and the parameters The experimental results show that maltose, a
slow carbon source,is more conducive to control CPO synthesis than glucose in the CPO fermentation
process. CPO concentrations reach 179 50 U / mL,when maltose is used,higher than that of glucose
(135 U / mL) . The fluctuation of pH is closely related to carbon consumption Based on the pattern of
growth,glucose consumption and enzymatic production,CPO synthesis is parallel to growth The black
pigment is a by⁃product in the secondary metabolism, indicating of the maturation period of the cell,and
it is parallel to enzyme synthesis Carbon source matrix and pH in fermentation have effect on CPO
production
Keywords:Leptoxyphium fumago; chloroperoxidase;fermentation;connectional analytical
氯过氧化物酶(chloroperoxidase,EC 1 11 1 10,
CPO)是一种十分有应用前景的 “手性生物催化
剂” [1-2]。 作为一种过氧化物酶,由于其辅基是高铁
(IX)原卟啉,因而使它不仅具备类似过氧化氢酶的
结合位点,而且有与细胞色素 P 450高度相似的光
谱学和化学性质,可以催化卤素离子、芳香族化合
物、脂肪族化合物和醇类化合物等多种物质进行过
氧化反应[3-5]。 目前,CPO 已经被广泛应用于多种
手性物质的合成生产,可减少反应过程中手性异构
体的损失,去除药物手性对映体的毒性,减轻废弃
物对环境的污染[6-7]。
CPO主要来源于微生物的发酵生产,海洋真菌
Caldariomyces fumago 是最早用于 CPO 发酵的菌
种[8-12]。 但是,CPO 发酵过程中酶产量波动幅度
大、浓度积累低(一般小于 100 mg / L)、酶活性稳定
性差、色素等副产物多,是造成 CPO 生产成本居高
不下的主要原因,严重限制了 CPO 的开发与使
用[13-15]。 影响 CPO 生产稳定的因素很多,其中主
要发酵参数之间的协同变化对产酶稳定性具有显
著的影响,而现有文献报道对 CPO发酵产量与参数
的相关性研究并不多见[16-17]。 笔者在孙凌燕[18]工
作的基础上通过实验考察 CPO 发酵相关指标变化
特征,分析其中的关联性,探讨 CPO 的稳定化生产
的条件。
1 材料与方法
1 1 菌种
Leptoxyphium fuming,购自英国CABI Europe UK。
1 2 培养基
斜面种子培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培
养基[19]。
发酵培养基:葡萄糖 20 g / L (或麦芽糖 20
g / L),(NH4) 2 SO4 1 5 g / L,NaNO3 2 g / L,酵母粉 7
g / L,马铃薯浸出液 150 mL / L,KCl 2 2 g / L,KH2PO4
1 0 g / L,MgSO4·7H2 O 0 1 g / L,FeSO4·7H2 O 0 2
g / L,pH 6 0。 0 1 MPa 灭菌 30 min。 装液量为 250
mL三角瓶中装液 50 mL。
马铃薯浸出液制备:去皮马铃薯 100 g,加水至
500 mL,煮沸 15 min,纱布过滤取清液。
1 3 主要试剂
MCD 磷酸钾缓冲溶液:1,1 二甲基 4 氯 3,
5 环己二酮 ( MCD) 0 1 mmol / L,溶于含有 20
mmol / L KCl的 0 1 mol / L的 K3PO4缓冲溶液中。
过氧化氢溶液:10 mmol / L,每周配制新鲜溶液
并在 4 ℃保存于棕色瓶中。
3,5 二硝基水杨酸(DNS)试剂:将 6 3 g DNS
和 262 mL 2 mol / L NaOH 溶液,加到 500 mL 含有
185 g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加 5 g 结晶酚和
5 g Na2SO3,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至 1 000
mL,贮于棕色瓶中备用。
1 4 主要设备
SHpH系列 6 通道补料摇床,上海国强生化工
程装备有限公司;UV6280 型扫描式紫外可见分光
光度计,北京普析通用设备有限公司;TGL 16G 型
高速冷冻离心机,上海安亭科学仪器有限公司;
PVDF型超滤膜过滤器,坎普尔设备有限公司。
1 5 实验方法
1 5 1 发酵基础条件
接种量为 2 cm2菌苔 /瓶,培养温度为 25 ℃,摇
瓶转速 240 r / min。
1 5 2 糖测定方法
葡萄糖和麦芽糖均用 DNS法[9]测定。
1 5 3 酸度测定
酸度测定采用中和滴定法[19]。
1 5 4 菌丝生物量测定
菌丝生物量测定采用干质量法[19]。
1 5 5 蛋白质浓度的测定
蛋白质浓度的测定采用考马斯亮蓝染色法[19]。
1 5 6 CPO的酶浓度测定
酶活力是以 MCD在被转化成 1,1 二甲基 4,
4 二氯 3,5 环己二酮时在 278 nm 处吸光度的减
少来确定的[8]。 酶活力单位定义:在特定实验条件
下,每分钟催化生成 1 μmol 1,1 二甲基 4,4 二
氯 3,5 环己二酮所需要的酶量为一个酶活力单位
(U)。
2 结果与讨论
2 1 糖消耗速率与 CPO产量的关联性
分别以麦芽糖和葡萄糖为 C 源,动态跟踪了 C
源在发酵过程中的变化与产酶特征关系,对比结果
如图 1所示。
图 1 麦芽糖和葡萄糖产酶特征曲线
Fig 1 Curves of enzyme production
in maltose and glucose
由图 1可见:菌体在高浓度 C源时期 CPO并不
合成,当 C源浓度下降到 10 mg / mL 以下时才开始
产酶;CPO 发酵过程中葡萄糖利用速率比麦芽糖
42 生 物 加 工 过 程 第 12卷
快,但麦芽糖可以使酶浓度增加速度更快更稳定,
最高酶产量可到达 179 50 U / mL,比葡萄糖的高峰
值 135 U / mL 高出了 30%左右,而且产酶高峰期延
长 1~2 d。 虽然发酵后期酶浓度都呈下降趋势,但
麦芽糖的波动稍小些。 这可能是因为 2种糖在细胞
体内的产能反应速率不同,麦芽糖利用速率较慢,
更有利于调控 CPO 稳定合成。 虽然葡萄糖是 CPO
发酵普遍采用的 C 源,但高浓度葡萄糖易对菌体合
成 CPO 产生分解代谢阻遏效应,阻止酶的合成。
Axley等[20]认为葡萄糖会抑制 CPO 酶的 mRNA 的
产生和蛋白质的翻译,从而延缓 CPO 合成,而麦芽
糖的产能速率相对慢些,从而在一定程度上缓和了
这种阻遏作用。
2 2 发酵过程 pH变化对酶合成量的影响
pH变化是基质利用和菌体代谢共同作用的结
果。 以麦芽糖为 C 源考察发酵过程 pH 的变化与
CPO浓度的关系,结果如图 2所示。
图 2 pH与 CPO合成的关系
Fig 2 The relationship between pH and CPO synthesis
由图 2 可以发现:pH 在开始 4 d 内呈持续下
降趋势,从初始 pH 6 下降接近 3 后可以稳定 2 ~ 3
d,此后开始上升,与此同时,酶的快速合成现象开
始出现,直到 pH 再回升到 6 时,酶浓度开始出现
拐点,由上升到下降。 对照图 1 可以发现,pH 上
升期与 C 源消耗密切相关联,酶产量的下降与 C
源基质的耗尽以及酶活性的稳定有一定相关性。
这说明当糖充足时,酸性代谢物质积累使 pH 不断
下降,当糖消耗到不阻遏酶合成时,CPO 快速合
成,由于此阶段(第 6 天开始)发酵液中残糖量较
低,使得菌体开始利用前期积累的酸性代谢物质,
造成发酵液的 pH反弹,pH 上升到 6 时,残糖和酸
性代谢物质都被消耗完了,酶浓度上升趋缓,产酶
期接近结束,由于酶活性的不稳定,就造成了表观
酶浓度下降。
2 3 菌丝生物量合成与产酶的同步性分析
生物量能够反映出菌体细胞的生长和生理状
态,对判断产酶的特征具有一定的指示作用。 测试
发酵过程中菌丝生物量形成与产酶量的变化,结果
见图 3。
图 3 发酵过程中菌丝生物量与产酶量的变化
Fig 3 The changes of mycelia biomass and enzyme
production in fermentation
从图 3 可以明显发现,菌丝体质量增加与酶浓
度的变化是不完全同步的,菌丝体生长早于酶浓度
增长,发酵培养第 6 天时,生长速率出现拐点,速率
趋慢,而此时酶合成速率加快。 对照图 1,此时培养
基中残糖质量浓度只有 26 93 mg / mL,说明在维持
较低基质浓度水平下就能保持很好的 CPO 的合成
速率。 从发酵第 10 天开始,CPO 产量明显下降可
能是酶不合成和酶失活双重因素造成的。
综上说明,CPO 合成不仅在发酵早期受阻遏,
而且在后期受抑制,体现出较为典型的中期合成型
特征,这对如何提高菌株产酶提供了重要依据。
2 4 黑色素形成对 CPO合成的影响
在 CPO发酵过程中一般都会伴随着黑色素的
形成,黑色素的形成与产酶是否存在关联性,
Pickard等[13]研究了 10株产 CPO菌株,认为黑色素
的形成会影响 CPO 合成能力。 笔者试图验证这一
产酶的特征,结果如图 4所示。
由图 4可见:菌株在发酵培养基中生长第 3天后
会产生黑色素,色素产生的时间与菌体产酶几乎是同
时发生,这不仅可能会影响酶的合成产量,降低酶的
转化率,而且还会使酶的分离纯化变得复杂。 随着色
素不断增多,发酵液透光度不断下降,发酵液 pH 和
酶产量也开始快速增大,说明黑色素的形成与 CPO
合成存在伴生现象,但两者形成的速率并不一致。 可
以推测黑色素物质可能是菌体成熟时期的一种次生
代谢物质,与酶的生物合成只是时间上的同步。
52 第 6期 李梅梅等:氯过氧化物酶发酵相关指标及其关联性分析
图 4 黑色素的产生对酶产量的影响
Fig 4 Effects of melanin on enzyme production
2 5 补料发酵对 CPO生产稳定化的影响
上述实验确定了 Leptoxyphium fuming 菌株产
CPO是中间合成产酶类型,针对这种代谢调控类型
提出稳定 CPO发酵的措施,通过间隙补料麦芽糖,
流加稀 H3PO4调节 pH 恒定在 5 5 ~ 6 0,考察 CPO
的发酵状况,结果如图 5所示。
图 5 补料发酵状态下的产酶发酵
Fig 5 The curve of fermentation condition in
fed⁃batch fermentation
将图 5 与图 1 ~图 4 比较可以发现,补料发酵
可以增加发酵液中的菌体生物量,最高菌体浓度
可以达到 8 560 mg / mL,比非补料培养时的 7 517
mg / mL增加了约 20%;CPO 比酶活最高为 222 6
U / mL,比非补料培养时的 185 456 U / mL 也增加
了约 20%,而且在发酵后期,CPO 下降速度有明显
的减缓。 说明控制 C 源基质浓度和 pH 能提高菌
体生物量,增加 CPO 的合成能力,对 CPO 的活力
衰减速度有一定的缓和作用,但不能完全防止酶
活力损失。
3 结 论
探究了关联发酵状态的几组重要参数变化特
征,分析过程变化与发酵产酶的相关性,明确 CPO
发酵过程中慢速 C 源麦芽糖更有利于调控菌体的
CPO稳定合成。 过程 pH 波动与 C 源消耗密切相
关,对产酶期有明显的指示性作用。 将生物量及
耗糖曲线与产酶特征比较,认为该菌株产 CPO 为
中期合成类型。 同时,笔者认为黑色素物质的形
成可能是菌体合成的一种次生代谢物质,与酶的
生物合成只是时间上的同步。 基于几组参数对
CPO 合成特征的影响实验,改进了发酵 C 源基质
和 pH的调控方法,明显提高了 CPO 产量和稳定
化程度。 此论可以为氯过氧化物酶的高效率生产
提供参考。
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