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Correlation of fermentation parameters in chloroperoxidase production

氯过氧化物酶发酵相关指标及其关联性分析



全 文 :第 12卷第 6期
2014年 11月
生  物  加  工  过  程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Vol􀆰 12 No􀆰 6
Nov􀆰 2014
doi:10􀆰 3969 / j􀆰 issn􀆰 1672-3678􀆰 2014􀆰 06􀆰 005
收稿日期:2013-11-15
基金项目:国家自然科学基金(50678102,50978164);上海师范大学科技基金(SK201228)
作者简介:李梅梅( 1990—),女,江苏盐城人,硕士研究生,研究方向:微生物分子生物学; 陈   军 (联系人),副教授,E⁃mail: cj7206@
shnu􀆰 edu􀆰 cn
氯过氧化物酶发酵相关指标及其关联性分析
李梅梅,戴佳伟,李新国,陈  军,吴霞琴
(上海师范大学 生命与环境科学学院,上海 200234)
摘  要:通过考察氯过氧化物酶(CPO)发酵相关参数的动力学特征,探究酶产量与参数之间的关联性。 结果表明:
CPO发酵过程中慢速 C源麦芽糖比葡萄糖更有利于调控 CPO的稳定合成,前者 CPO 最高比酶活(179􀆰 50 U / mL)
比后者(135 U / mL)高出 44􀆰 5 U / mL,而且产酶高峰期延迟 1~2 d;发酵过程 pH波动与 C源消耗速率密切相关,且
对 CPO合成具有明显的指标性作用。 通过生物量曲线及糖消耗曲线与产酶特征对比判断,菌株合成 CPO 为中期
合成类型。 副产物黑色素是菌体成熟时期的一种次生代谢物质,与酶的生物合成存在时间上的同步性。 控制 C源
基质和 pH对提高 CPO稳定化生产具有一定成效。
关键词:Leptoxyphium fumago;氯过氧化物酶;发酵;关联性分析
中图分类号:Q814􀆰 4        文献标志码:A        文章编号:1672-3678(2014)06-0023-04
Correlation of fermentation parameters in chloroperoxidase production
LI Meimei,DAI Jiawei,LI Xinguo,CHEN Jun,WU Xiaqin
(College of Life and Environment Science,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)
Abstract:We correlated fermentation parameters of chloroperoxidase (CPO) fermentation to study the
relationship between enzyme yield and the parameters􀆰 The experimental results show that maltose, a
slow carbon source,is more conducive to control CPO synthesis than glucose in the CPO fermentation
process. CPO concentrations reach 179􀆰 50 U / mL,when maltose is used,higher than that of glucose
(135 U / mL) . The fluctuation of pH is closely related to carbon consumption􀆰 Based on the pattern of
growth,glucose consumption and enzymatic production,CPO synthesis is parallel to growth􀆰 The black
pigment is a by⁃product in the secondary metabolism, indicating of the maturation period of the cell,and
it is parallel to enzyme synthesis􀆰 Carbon source matrix and pH in fermentation have effect on CPO
production􀆰
Keywords:Leptoxyphium fumago; chloroperoxidase;fermentation;connectional analytical
    氯过氧化物酶(chloroperoxidase,EC 1􀆰 11􀆰 1􀆰 10,
CPO)是一种十分有应用前景的 “手性生物催化
剂” [1-2]。 作为一种过氧化物酶,由于其辅基是高铁
(IX)原卟啉,因而使它不仅具备类似过氧化氢酶的
结合位点,而且有与细胞色素 P 450高度相似的光
谱学和化学性质,可以催化卤素离子、芳香族化合
物、脂肪族化合物和醇类化合物等多种物质进行过
氧化反应[3-5]。 目前,CPO 已经被广泛应用于多种
手性物质的合成生产,可减少反应过程中手性异构
体的损失,去除药物手性对映体的毒性,减轻废弃
物对环境的污染[6-7]。
CPO主要来源于微生物的发酵生产,海洋真菌
Caldariomyces fumago 是最早用于 CPO 发酵的菌
种[8-12]。 但是,CPO 发酵过程中酶产量波动幅度
大、浓度积累低(一般小于 100 mg / L)、酶活性稳定
性差、色素等副产物多,是造成 CPO 生产成本居高
不下的主要原因,严重限制了 CPO 的开发与使
用[13-15]。 影响 CPO 生产稳定的因素很多,其中主
要发酵参数之间的协同变化对产酶稳定性具有显
著的影响,而现有文献报道对 CPO发酵产量与参数
的相关性研究并不多见[16-17]。 笔者在孙凌燕[18]工
作的基础上通过实验考察 CPO 发酵相关指标变化
特征,分析其中的关联性,探讨 CPO 的稳定化生产
的条件。
1  材料与方法
1􀆰 1  菌种
Leptoxyphium fuming,购自英国CABI Europe UK。
1􀆰 2  培养基
斜面种子培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培
养基[19]。
发酵培养基:葡萄糖 20 g / L (或麦芽糖 20
g / L),(NH4) 2 SO4 1􀆰 5 g / L,NaNO3 2 g / L,酵母粉 7
g / L,马铃薯浸出液 150 mL / L,KCl 2􀆰 2 g / L,KH2PO4
1􀆰 0 g / L,MgSO4·7H2 O 0􀆰 1 g / L,FeSO4·7H2 O 0􀆰 2
g / L,pH 6􀆰 0。 0􀆰 1 MPa 灭菌 30 min。 装液量为 250
mL三角瓶中装液 50 mL。
马铃薯浸出液制备:去皮马铃薯 100 g,加水至
500 mL,煮沸 15 min,纱布过滤取清液。
1􀆰 3  主要试剂
MCD 磷酸钾缓冲溶液:1,1 二甲基 4 氯 3,
5 环己二酮 ( MCD) 0􀆰 1 mmol / L,溶于含有 20
mmol / L KCl的 0􀆰 1 mol / L的 K3PO4缓冲溶液中。
过氧化氢溶液:10 mmol / L,每周配制新鲜溶液
并在 4 ℃保存于棕色瓶中。
3,5 二硝基水杨酸(DNS)试剂:将 6􀆰 3 g DNS
和 262 mL 2 mol / L NaOH 溶液,加到 500 mL 含有
185 g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加 5 g 结晶酚和
5 g Na2SO3,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至 1 000
mL,贮于棕色瓶中备用。
1􀆰 4  主要设备
SHpH系列 6 通道补料摇床,上海国强生化工
程装备有限公司;UV6280 型扫描式紫外可见分光
光度计,北京普析通用设备有限公司;TGL 16G 型
高速冷冻离心机,上海安亭科学仪器有限公司;
PVDF型超滤膜过滤器,坎普尔设备有限公司。
1􀆰 5  实验方法
1􀆰 5􀆰 1  发酵基础条件
接种量为 2 cm2菌苔 /瓶,培养温度为 25 ℃,摇
瓶转速 240 r / min。
1􀆰 5􀆰 2  糖测定方法
葡萄糖和麦芽糖均用 DNS法[9]测定。
1􀆰 5􀆰 3  酸度测定
酸度测定采用中和滴定法[19]。
1􀆰 5􀆰 4  菌丝生物量测定
菌丝生物量测定采用干质量法[19]。
1􀆰 5􀆰 5  蛋白质浓度的测定
蛋白质浓度的测定采用考马斯亮蓝染色法[19]。
1􀆰 5􀆰 6  CPO的酶浓度测定
酶活力是以 MCD在被转化成 1,1 二甲基 4,
4 二氯 3,5 环己二酮时在 278 nm 处吸光度的减
少来确定的[8]。 酶活力单位定义:在特定实验条件
下,每分钟催化生成 1 μmol 1,1 二甲基 4,4 二
氯 3,5 环己二酮所需要的酶量为一个酶活力单位
(U)。
2  结果与讨论
2􀆰 1  糖消耗速率与 CPO产量的关联性
分别以麦芽糖和葡萄糖为 C 源,动态跟踪了 C
源在发酵过程中的变化与产酶特征关系,对比结果
如图 1所示。
图 1  麦芽糖和葡萄糖产酶特征曲线
Fig􀆰 1  Curves of enzyme production
in maltose and glucose
由图 1可见:菌体在高浓度 C源时期 CPO并不
合成,当 C源浓度下降到 10 mg / mL 以下时才开始
产酶;CPO 发酵过程中葡萄糖利用速率比麦芽糖
42 生  物  加  工  过  程    第 12卷 
快,但麦芽糖可以使酶浓度增加速度更快更稳定,
最高酶产量可到达 179􀆰 50 U / mL,比葡萄糖的高峰
值 135 U / mL 高出了 30%左右,而且产酶高峰期延
长 1~2 d。 虽然发酵后期酶浓度都呈下降趋势,但
麦芽糖的波动稍小些。 这可能是因为 2种糖在细胞
体内的产能反应速率不同,麦芽糖利用速率较慢,
更有利于调控 CPO 稳定合成。 虽然葡萄糖是 CPO
发酵普遍采用的 C 源,但高浓度葡萄糖易对菌体合
成 CPO 产生分解代谢阻遏效应,阻止酶的合成。
Axley等[20]认为葡萄糖会抑制 CPO 酶的 mRNA 的
产生和蛋白质的翻译,从而延缓 CPO 合成,而麦芽
糖的产能速率相对慢些,从而在一定程度上缓和了
这种阻遏作用。
2􀆰 2  发酵过程 pH变化对酶合成量的影响
pH变化是基质利用和菌体代谢共同作用的结
果。 以麦芽糖为 C 源考察发酵过程 pH 的变化与
CPO浓度的关系,结果如图 2所示。
图 2  pH与 CPO合成的关系
Fig􀆰 2  The relationship between pH and CPO synthesis
由图 2 可以发现:pH 在开始 4 d 内呈持续下
降趋势,从初始 pH 6 下降接近 3 后可以稳定 2 ~ 3
d,此后开始上升,与此同时,酶的快速合成现象开
始出现,直到 pH 再回升到 6 时,酶浓度开始出现
拐点,由上升到下降。 对照图 1 可以发现,pH 上
升期与 C 源消耗密切相关联,酶产量的下降与 C
源基质的耗尽以及酶活性的稳定有一定相关性。
这说明当糖充足时,酸性代谢物质积累使 pH 不断
下降,当糖消耗到不阻遏酶合成时,CPO 快速合
成,由于此阶段(第 6 天开始)发酵液中残糖量较
低,使得菌体开始利用前期积累的酸性代谢物质,
造成发酵液的 pH反弹,pH 上升到 6 时,残糖和酸
性代谢物质都被消耗完了,酶浓度上升趋缓,产酶
期接近结束,由于酶活性的不稳定,就造成了表观
酶浓度下降。
2􀆰 3  菌丝生物量合成与产酶的同步性分析
生物量能够反映出菌体细胞的生长和生理状
态,对判断产酶的特征具有一定的指示作用。 测试
发酵过程中菌丝生物量形成与产酶量的变化,结果
见图 3。
图 3  发酵过程中菌丝生物量与产酶量的变化
Fig􀆰 3  The changes of mycelia biomass and enzyme
production in fermentation
从图 3 可以明显发现,菌丝体质量增加与酶浓
度的变化是不完全同步的,菌丝体生长早于酶浓度
增长,发酵培养第 6 天时,生长速率出现拐点,速率
趋慢,而此时酶合成速率加快。 对照图 1,此时培养
基中残糖质量浓度只有 26􀆰 93 mg / mL,说明在维持
较低基质浓度水平下就能保持很好的 CPO 的合成
速率。 从发酵第 10 天开始,CPO 产量明显下降可
能是酶不合成和酶失活双重因素造成的。
综上说明,CPO 合成不仅在发酵早期受阻遏,
而且在后期受抑制,体现出较为典型的中期合成型
特征,这对如何提高菌株产酶提供了重要依据。
2􀆰 4  黑色素形成对 CPO合成的影响
在 CPO发酵过程中一般都会伴随着黑色素的
形成,黑色素的形成与产酶是否存在关联性,
Pickard等[13]研究了 10株产 CPO菌株,认为黑色素
的形成会影响 CPO 合成能力。 笔者试图验证这一
产酶的特征,结果如图 4所示。
由图 4可见:菌株在发酵培养基中生长第 3天后
会产生黑色素,色素产生的时间与菌体产酶几乎是同
时发生,这不仅可能会影响酶的合成产量,降低酶的
转化率,而且还会使酶的分离纯化变得复杂。 随着色
素不断增多,发酵液透光度不断下降,发酵液 pH 和
酶产量也开始快速增大,说明黑色素的形成与 CPO
合成存在伴生现象,但两者形成的速率并不一致。 可
以推测黑色素物质可能是菌体成熟时期的一种次生
代谢物质,与酶的生物合成只是时间上的同步。
52  第 6期 李梅梅等:氯过氧化物酶发酵相关指标及其关联性分析
图 4  黑色素的产生对酶产量的影响
Fig􀆰 4  Effects of melanin on enzyme production
2􀆰 5  补料发酵对 CPO生产稳定化的影响
上述实验确定了 Leptoxyphium fuming 菌株产
CPO是中间合成产酶类型,针对这种代谢调控类型
提出稳定 CPO发酵的措施,通过间隙补料麦芽糖,
流加稀 H3PO4调节 pH 恒定在 5􀆰 5 ~ 6􀆰 0,考察 CPO
的发酵状况,结果如图 5所示。
图 5  补料发酵状态下的产酶发酵
Fig􀆰 5  The curve of fermentation condition in
fed⁃batch fermentation
将图 5 与图 1 ~图 4 比较可以发现,补料发酵
可以增加发酵液中的菌体生物量,最高菌体浓度
可以达到 8􀆰 560 mg / mL,比非补料培养时的 7􀆰 517
mg / mL增加了约 20%;CPO 比酶活最高为 222􀆰 6
U / mL,比非补料培养时的 185􀆰 456 U / mL 也增加
了约 20%,而且在发酵后期,CPO 下降速度有明显
的减缓。 说明控制 C 源基质浓度和 pH 能提高菌
体生物量,增加 CPO 的合成能力,对 CPO 的活力
衰减速度有一定的缓和作用,但不能完全防止酶
活力损失。
3  结  论
探究了关联发酵状态的几组重要参数变化特
征,分析过程变化与发酵产酶的相关性,明确 CPO
发酵过程中慢速 C 源麦芽糖更有利于调控菌体的
CPO稳定合成。 过程 pH 波动与 C 源消耗密切相
关,对产酶期有明显的指示性作用。 将生物量及
耗糖曲线与产酶特征比较,认为该菌株产 CPO 为
中期合成类型。 同时,笔者认为黑色素物质的形
成可能是菌体合成的一种次生代谢物质,与酶的
生物合成只是时间上的同步。 基于几组参数对
CPO 合成特征的影响实验,改进了发酵 C 源基质
和 pH的调控方法,明显提高了 CPO 产量和稳定
化程度。 此论可以为氯过氧化物酶的高效率生产
提供参考。
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