全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 && 月
生"物"加"工"过"程
*cF/3! 8F3#
8FM3$%&% DFC"&%37#7 ,^3C11L3$ ?#6!3$%&%3%#3%%7 收稿日期"$%&% ?%0 ?&
基金项目"国家自然科学基金资助项目$$%76&&0%&上海师范大学科技基金资助项目$\)N6&0%&上海市大学生科研创新活动计划项目
$*P%&#%
作者简介"陈"军$&7##%#男#江苏淮安人#副教授#研究方向"微生物酶学及环境微生物学#Z-J@C/"A^6$%#e1海洋真菌 .,32,*$&8+1-)9(8,:&产氯过氧化物酶的 双水相提纯条件 陈"军#杜"宁#许甜甜#夏志华# 张书翠#朱旭国$上海师范大学"生命与环境科学学院# 上海 $%%$0%
摘"要"采用聚乙二醇$=ZV#%%%%在$8S
0
%
$]+ 0 高饱和度下沉淀夹带蛋白质富集氯过氧化物酶#再利用磷酸盐溶 液复溶解共沉淀物形成的双水相萃取体系高浓度回收酶蛋白#最后再经 ]H2<@DHbV &%% 柱层析纯化获得高纯度 酶试样( 结果显示" 氯过氧化物酶与=ZV共沉淀总活力回收率达 !(g(f#酶在优化的=ZV,磷酸盐双水相系统中 上下相分配系数K在 %g0& 以下#酶活力回收率达到 #7g&f#纯度提高了$&g(6 倍#柱层析可使酶纯度进一步提高
到 $0g67 倍#总回收率为 6g6(f( 关键词""#$%#&()*+,-./)#0(&氯过氧化物酶&双水相&萃取
中图分类号"597$%3#""""文献标志码".""""文章编号"$ ?#6!$$%&%%%# ?%%0# ?%#
S34.7.:5F.2/27:-62429042V.G510742I5 I54./073/;31
.,32,*$&8+1-)9(8,:& JK 5 3^0231FN2H9-5101K1F0I
*SZ8WGL#\T8CLX#PT5C@L-BC@L#PO.R$*F/HXHFINCIH@LD ZLMCEFLJHLB]ACHLAH#]<@LX<@C8FEJ@/TLCMHE1CBK#]<@LX<@C$%%$0#**J1F45:F"5BIFEJHD :@1HD FL B1@J2/HIEFJ]H2<@DHbV-&%% A_@1!(g(f :KAF-2EHAC2CB@BH_CB< =ZVCL B2<@1H1K1BHJ# *=+_@1DC11F/MHD CL BBCJ2EFMHD BF$0g67 BCJH1:KAF/GJL AM0K N24G1""#$%#&()*+,-./)#0(&A""海洋真菌"#$%#&()*+,-./)#0(是目前发酵生产
氯过氧化物酶$A的主要菌种#国外研究人员已经对其进行了$% 多年
的研究*& ?$+ ( 它的许多光谱学和化学性质都与细胞 色素= 0(% 高度相似* ?0+ ( 作为过氧化物酶#*=+ 又具有类似过氧化氢酶的结合位点#具有较为广泛 的底物适应性#可以催化卤素离子)芳香族化合物) 脂肪族化合物和醇类化合物等进行过氧化反应#因 此#被认为是一种十分有应用前景的手性生物催化 剂$A质量浓度积累很低$一般小于$%% JX,N%#酶活性稳
定性也较差#高纯度 *=+提纯过程中#酶的回收率
普遍低下#这是造成*=+生产成本居高不下的主要
原因#也严重限制了*=+的开发与使用*! ?7+ (
双水相萃取 $@dGHFG1B_F2<@1HHbBE@ABCFL# .5=Z%在生物活性物质)天然产物等的提取和纯化 中表现出分辨率高)产物回收率高)易放大等优 点*&% ?&&+ ( 在现有文献报道中#*=+的提纯都是采 用传统盐析加层析的操作方法*! ?7+ ( 本研究利用亲 水性聚乙二醇$=ZV#%%%%在高盐度溶液中沉淀夹带
海洋微生物 "#$%#&()*+,-./)#0(发酵液中的微量 酶蛋白#再在磷酸盐溶液复溶解过程中形成双水相 萃取体系#以回收高纯度*=+( D?材料与方法 D=D?实验材料 &3&3&"菌种 海洋真菌"#$%#&()*+,-./)#0(#英国 *.` OZG-
EF2H-T)(
&3&3$"培养基 =\.固体培养基$X,N%"马铃薯$去皮%$%%)葡
萄糖 $%#2S自然( 将马铃薯去皮#切成小块#加水 & %%% JN煮沸 %g( <#用双层纱布过滤#取其滤液加 糖#并加水补足& %%% JN( ""产酶发酵培养基$X,N%" 麦芽糖 0%)8@8+

$# )*/$#)S
$=+ 0$#QX]+
0
!6S
$+%g(#YH]+ 0 !6S$
+
%g%$#*@*/$
%g%7( 另加体积分数 $%f的马铃薯浸 出液( 初始 2S为 6g%( &3&3"主要试剂 聚乙二醇$=ZV#%%%%#上海福森化工有限公司&
]H2<@DHbV &%% 凝胶和 &#& 二甲基 0 氯 #(
环己二酮$Q*\%#]CXJ@公司( &3&30"主要仪器 ]S2S# 型 # 通道补料摇床#上海国强生化工程 装备有限公司& 5VN &#V型高速冷冻离心机#上海 安亭科学仪器有限公司&=c\Y型超滤膜过滤器#坎 普尔设备有限公司&高效液相层析系统#上海青浦 沪西仪器厂&6(&V\型紫外,可见分光光度计#上海 天普分析仪器有限公司&Y\ $.型真空冷冻干燥
机#北京博医康公司(
D=B?实验方法
&3$3&"*=+的发酵生产 将=\.平板上培养&% D的 "#$%#&()*+,-./)#<
0(菌苔按每$(% JN三角瓶接种$ AJ$菌苔的接种量 接入产酶发酵培养基#摇瓶装液量(% JN,$(% JN#
发酵温度$( j#摇床转速$%% E,JCL( 发酵# D后
*=+产量达到&!(g(0 T,JN(
&3$3$"发酵液脱色处理
发酵液在&% j下&% %%% E,JCL离心&% JCL#或
者采用真空抽滤去除菌丝以及其他悬浮固形物#收
集含黑色素的上清液或抽滤清液( 清液在0 j环境
下缓慢加入不同浓度的 =ZV#%%% 并不断搅拌混合
均匀#静置0 <#待 =ZV与黑色素絮凝稳定后#0 j)
&$%%% E,JCL离心&% JCL#收集浅黄绿色的脱色液待 提取( 脱色效果用可见光透光率判别( &3$3"*=+清液的超滤浓缩
由于发酵液中*=+所占比例一般很低$约 &g JX,JN%#因此#脱色液先用截留相对分子质量为 & p&% 0超滤膜过滤器在 &% j下超滤循环浓缩至原 先体积的 &,(( &3$30"=ZV与*=+的共沉淀
将浓缩后的脱色液在冰浴条件下缓慢加入固
体$8S 0 %$
]+
0
至不同的饱和度#分别低温静置 0 i
! <( 每段饱和液沉淀分别在0 j)&% %%% E,JCL离
心&% JCL#得=ZV与蛋白质的盐析复合沉淀物(
&3$3("双水相体系的建立 称量一定质量的复合沉淀物置于分液漏斗中#按 一定质量比加入 2S(g! 的%g& JF/,N磷酸盐缓冲液$=`]%溶解复合沉淀物#分别形成不同组成相的
=ZV,磷酸盐双水相体系( 双水相萃取稳定分层后分
离两相#分别测出上下相的体积和酶浓度#计算分配
系数=#确定最适萃取*=+的=ZV,磷酸盐双水相萃
取体系的组成( 分配系数=的计算公式为
""=n
上相总酶活力
下相总酶活力 $&% 下相酶的得率L下相按公式$$%计算( ""L下相 n 上相总酶活力 两相总酶活力p&%% n " : > : p&%% " @ > @ k" : > : n &%%$& k=3%
$$% 式中"" @ 为上相液酶比活力#T,JN&" : 为下相液酶比 活力#T,JN&> @ 为上相液体积#JN&> : 为下液体积# JN&3为上下相溶液体积的比值&=为分配系数( 60"第 # 期 陈"军等"海洋真菌"#$%#&()*+,-./)#0(产氯过氧化物酶的双水相提纯条件 &3$3#"凝胶过滤层析 称取 ]H2<@DHbV &%% 凝胶&% X#用蒸馏水浸泡 & <#除去含细微悬浮物的上层液体#后用%g& JF/,N 2S(g! 的 =` ] 平衡至 2S为 (g!#装柱( 上柱量不 超过柱床体积的 (f#用%g& JF/,N2S(g! 的 =` ] 洗脱#当深黄色色谱条带$上样液为淡黄色%移动至 接近柱底时开始收集流出液#每管收集$ JN#测定 *=+酶浓度和蛋白质浓度( &3$36"酶纯度验证 分别在$!% LJ和0% LJ波长下检测收集液的 吸光度#采用3 ; 值验证酶纯度$3 ; n@ 0% ,@ $!% %#其 中@ 0% 为血红素辅基在0% LJ处的吸光度#@ $!% 为蛋 白质在 $!% LJ处的吸光度( 3 ; 值高表示酶纯度也 高( 收集酶活与3 ; 值较高流出段的收集液合并#再 经真空冷冻干燥浓缩( &3$3!"酶活力的定义及测定 *=+的酶活力是以 &#& 二甲基 0 氯 #( 环己 二酮$Q*\%被转化成 &#& 二甲基 0#0 二氯 #( 环己二酮时的$6! LJ处吸光度的减少来确定的*+( 酶活力单位被定义为在标准条件$$ ( j#2S
$g6%下#每分钟催化转化& # JF/Q*\底物所需要 的酶量( 折算为每分钟& JJF/,N的 Q*\溶液在$6! LJ处吸光度改变 %g$0# 相当于一个酶活力单 位*0+ ( 反应体系包括$g7 JN的 Q*\ 磷酸钾缓冲
溶液##%
#
NS
$+$
和&%
#
N酶液#反应持续 i0 JCL#
记录吸光度的变化(
&3$37"蛋白含量测定方法 蛋白含量测定采用 E`@DIFED 法*&$+ #用考马斯亮
蓝V$(% 与酶液反应显色#为避免=ZV等的干扰#以 相同组分但不含蛋白的溶液为空白对照#在(7( LJ 下测定吸光度#以牛血清白蛋白为标准蛋白( B?结果与讨论 B=D?S#%@CCC 对,S+发酵液脱色效果的影响 ""虽然对发酵液中黑色素的成分及其化学性质 至今未能有更多的研究#但是黑色素能与大分子聚 合物的絮凝现象已经确定*!+ ( 实验考察 =ZV#%%% 的添加量对发酵液的脱色效果#结果如图 & 所示( ""从图 & 可见"从透光性上 =ZV#%%% 对黑色素的 去除性能有明显差异#随着=ZV#%%% 质量分数的升 高#脱色效果越明显#质量分数 #f以上的 =ZV#%%% 具有良好的絮凝黑色素效果( 而此时发酵液中的 的*=+活力保存率为 &%0g0f#酶活力保持性能超 图 D?S#%@CCC 质量分数对发酵液脱色的影响 Q.;=D?#70:F127G0:26245F.2/27704I0/F0GJ42F- ./G.7040/F:2/:0/F45F.2/127S#%@CCC 过原始发酵液( 酶活力升高可能与 =ZV#%%% 对酶 蛋白分子表面产生的大分子非共价修饰作用 有关*&&+ ( B=B?$$" P % B !+ P 饱和度对S#%共沉淀后,S+得 率的影响 ""质量分数为 #f的=ZV#%%% 脱色后的发酵液中 残留的=ZV在不同饱和度的$8S
0
%
$]+ 0 溶液中分 别沉淀#考察分段沉淀物中*=+的得率#结果如图$
所示(
图 B? $$" P % B !+ P 饱和度对S#%共沉淀,S+ 得率的影响 Q.;=B?#70:F127F-0K.06G27,S+./G.7040/F 5II2/.3I13675F015F345F.2/1 ""在盐析剂$8S 0 % $ ]+ 0 的作用下 =ZV共同沉淀 物对酶夹带析出的效果有明显差异( 结果显示"饱 和度 0%f的$8S 0 % $ ]+ 0 对 =ZV#%%% 沉淀后 *=+的 回收率只有 6g7f#而 #%f饱和度的$8S 0 % $ ]+ 0 对 =ZV#%%% 沉淀后*=+的回收率高达 !(g(f#具有良 好的共沉淀性能( B=O?双水相相系组成与,S+的分配系数 向共沉淀物中分段添加不同比例的 %g& JJF/,N 2S(g! =`]#使共沉淀物复溶解形成不同浓度的溶液 !0 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷" 体系#0 j静置0 <待体系分层形成稳定的双水相#测 定两相中的*=+分配系数( 结果如图 所示( 图 O?双水相组成对,S+分配系数及得率的影响 Q.;=O?#70:F127954F.F.2/:207.:.0/F5/GK.06G ./G.7040/F5 3^0231FN2H9-5101K1F0I1 ""由图 可见"随着 =` ] 添加比例的增加#共沉 淀物开始溶解并形成不同相系组成的 =ZV,磷酸盐 双水相体系#其中下相磷酸盐相为 *=+易分配相# 至共沉淀物中加入 (f=`] 时形成的 =ZV,磷酸盐 双水相的下相磷酸盐相中 *=+分配系数为 %g(0# 为最小值#此时上下相溶液所占体积比约为 &l(#下 相中*=+回收率达到 #7g&f#说明在 (f=`] 复 溶时的双水相体系最有利于*=+溶解释放#*=+在 下层磷酸盐水相中分配比例最高( B=P?$5,6对,S+在双水相中分配系数的影响 在 (f=`] 共沉淀物复溶解液中另外加入 8@*/#考察在此双水相体系中盐浓度对*=+的分配 率的影响#结果见图 0( 图 P?$5,6对,S+在双水相中分配系数及得率的影响 Q.;=P?#70:F127F-0954F.F.2/:207.:.0/F5/GK.06G 27,S+./5 3^0231FN2H9-5101K1F0I1 N.F-$5,6 ""由图 0 可知"添加 (f=`]形成的=ZV#%%%,磷 酸盐双水相系统中 8@*/浓度的变化 $ i&6 JJF/,N%对*=+的分配性能有轻微的影响#随着盐 度的增加分配系数 =会有所下降( 说明 *=+在较 高盐度下*=+在磷酸盐相中的分配率会有所提高# *=+回收率比原先的 #7g&f略有增加$#7g7f%( 一般认为外加中性盐会改变系统的相图和分配特 性*&% ?&&+ #此处8@*/浓度对*=+在两相中的分配系 数影响不大的原因可能是因为上下两相体积比差 异过大$(l&%#盐度变化对体积较小的磷酸盐影响 较小#而且 *=+在下相中分配的浓度已经达到较 高值( B=R?9"对,S+在双水相中分配系数的影响 调整复溶缓冲液 =` ]的 2S#在 2S0 i7 范围内 分别考察 =ZV 磷酸盐双水相系统中 *=+的分配 情况#结果如图 ( 所示( 图 R?9"对,S+在双水相中分配系数及酶 得率的影响 Q.;=R?#70:F127F-0954F.F.2/:207.:.0/F5/GK.06G 27,S+5FG.7040/F9"./5 3^0231 FN2H9-5101K1F0I1 ""由图 ( 可见"=ZV 磷酸盐双水相系统中 2S在 0 i#区间 *=+在分配系数 =波动明显#低于 (g( 时#随着 2S的降低#分配系数 =值缓步增加#而高 于 (g( 时 =值则急速上升#在 2S(g( 时 =最低 $%g(6%#*=+得率最高$66g!f%( 产生这种现象 可解释为系统 2S变化使酶所带的表面净电荷发生 了改变#*=+是酸性酶#等电点为 g$ i0g%*0+ #当系 统的 2S高于 (g( 时酶表面负电荷增加#分配在下 相磷酸盐溶液中的酶量减少( B=@?,S+的凝胶层析纯化 =ZV,磷酸盐双水相提取的 *=+再经过 ]H2<@- DHbV &%% 凝胶层析#纯化效果如图 # 和表 & 所示( ""图 # 显示的是 =ZV,磷酸盐双水相萃取液凝胶 层析洗脱液曲线( 由图 # 可见高组分蛋白质与高酶 活组分峰值明显#两峰的重叠性较好#( i7 管收集 液的3 ; 值为 &g%(#整个洗脱过程中杂蛋白峰很少# 70"第 # 期 陈"军等"海洋真菌"#$%#&()*+,-./)#0(产氯过氧化物酶的双水相提纯条件 说明上样组分中*=+蛋白质纯度较高#也证明了共 沉复溶双水相法提纯高纯度 *=+的高效性和可 行性( ""表 & 表明"共沉复溶 =ZV,磷酸盐双水相提纯 *=+可以获得 #7g&f酶活回收率#酶比活力达到 $ 76g#! T,JX#纯度比发酵液提高了 $&g(6 倍#而 经过 ]H2<@DHbV &%% 凝胶层析之后的*=+纯化指 标比活力为 0&6g(& T,JX#纯度虽然比共沉复溶 双水相萃取法提高 g$$ 倍#但 *=+总活力损失也
因此增加了 0g6f( 实验数据再次肯定了本方法
在提纯微量酶蛋白过程具有较好的应用效果(
图 @?,S+复溶提纯液层析洗脱曲线
Q.;=@?#63F./; :34A0127109-5G0V %HDCC
:-42I5F2;45I
表 D?共沉复溶法提纯,S+回收率和纯度
E5J60D?b.06G5/G934.FK 27,S+5FG.7040/F1F09127934.7.:5F.2/
步骤 总体积,
JN
"
$蛋白质%,$JX!JN
?&
%
)$蛋白质%, JX 酶浓度,$T!JN
?&
%
比活力,
$T!JX ?& % 总活力, T 产率, f 提纯 倍数 发酵液 & %%%g% &g0# & 0# &!(g(0 &6g!( &!( (0%g%% &%%g%% &g%% 发酵液脱色 7!(g% &g$60 & $(( &7#g# &(0g0 &7 #!%g(( &%0g7 &g&$
膜浓缩 &(%g% #g$!$ 70$7&g0 &0!g$6 &7 6&0g(% 6(g% &g%!
$8S 0 %$
]+
0
盐析
$g% #g6#%$&# (#(g06 ($6g00 &&0 %7(g%0 #&g07 g! 共沉复溶萃取 (g! 0g(6%$6 & (!7g6 76g#! 6! !$%g! 0$g0! $&g(6 ]H2<@DHb V &%% 凝胶层析 #g7$g76% $% &% &(%g%% 0&6g(& 6% %(g%% 6g6($0g67
""双水相萃取试样.和经 ]H2<@DHbV &%% 凝胶
层析之后试样`经垂直板聚丙烯酰胺电泳分离后#
电泳图谱如图 6 所示(
图 ]?,S+纯化试样的电泳图
Q.;=]?![!HS*%#5115K 27934.7.0G,S+
""由图 6 可见"试样.)`在电泳后均呈现单一条
带#且无明显拖尾现象#说明纯化的试样*=+具有较
高纯度( 试样条带介于 0( %%% i#$%%% 这$ 条条带
之间#分析试样相对分子质量大小应在 0# %%%左右(
O?结?论
利用亲水性聚合物 =ZV#%%% 在$8S 0 %$
]+
0
高
饱和度溶液中失水沉淀#夹带蛋白质特性#提取发
酵液中的酶蛋白#再用磷酸盐溶液溶解共沉淀物形
成双水相体系高分配率地释放 *=+#建立了一套微
量酶蛋白质的提纯新型方法( 利用 =ZV#%%% 共沉
淀回收*=+的总活力达到 !(f#双水相提取后活力
回收为 0$g0!f#纯化倍数为$&g(6 倍#再经柱层析
可使酶纯度进一步提高到 $0g67 倍#总回收率为
6g6(f( 比常规盐析 层析法提纯周期明显缩短#
成本消耗也较低廉#过程容易放大#纯化后的酶安
全性良好(
参考文献"
*&+"QFEC1\4#S@XHEN=3*%( 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
/FXCA@/**$+"S@XHEN=#QFEC1\4# E`F_L Y]#HB@/3*BCFL FI<@/FXHL @LCFL1*W+35&7###$0&$!%"&6#7-&6663
*+"S@XHEN=#N@aLHEYW# @`1@M@2@BEF2HEFbCD@1HA@B@/K1C1*W+3WQF/*@B@/ZL;KJH#&77!#&0 $(%" 7(-&%&3 *0+"N@4FB@SHEL@LDH;*Z#NGB;]#NCH1H.#HB@/3.ABCMCBK@LD 1B@- :C/CBKFI"#$%#&()*+,-./)#0(ADGABCMH@/aK/@BCFL#@JCD@BCFL @LD AEF11-/CLaCLX*W+3ZL;KJH@LD
QCAEF:C@/5HA*(+"张红霞#吴霞琴#后雯景3氯过氧化物酶修饰电极对一氯二甲
酮的催化氯化 *W+3高等学校化学学报# $%%!#$7 $ 7 %"
&!#-&!#(3
R<@LXSFLXbC@#[G PC@dCL#SFG [HL C^LX3*@B@/KBCAAQ*\G1CLXABG:H1IC/J1FL V*H/HABEFDH1*W+3*$7%"&!#-&!#(3 *#+"智丽飞#蒋育澄#胡满成#等3氯过氧化物酶在手性有机合成中 的应用*W+3化学进展#$%%##&!$7%"&&(%-&&(#3
RAC1BEK#$%%##&!$7%"&&(%-&&(#3
*6+"卢桂宁#陈晓鹏#陶雪琴#等3有机磷农药氯过氧化物酶反应活性
的定量构效研究*W+3农业环境科学学报#$%%##$($0%"776-&%%%3
NG VGCLCLX#*AWFGEL@/FI.XEF-ZLMCEFLJHLB]ACHLAH#$%%##$($0%"776-&%%%3
*!+"*F/FLL@]#V@XXHEF8#*@1H/@N#HB@/3*DEFXHL 2HEFbCDH"@L HICACHLB1K1BHJIFEHL;KJ@BCAHL@LBCF1H/HABCMH
1G/IFbCD@BCFL1*W+35HBE@*7+"c@CDK@`)#]GB<@ES)#)@1BGEH]#HB@/3=GECICA@BCFL FI2FB@BF
2F/K21K1BHJ*W+3 C`FA*&%+ 朱建星#王红艳#张万忠#等3应用响应面法优化.]&37! 中性
蛋白酶的双水相萃取条件*W+3沈阳化工学院学报#$%%6#$&
$0%"$($-$(#3
RBCFL FIB2<@1H1K1BHJ1:KEH12FL1H1GEI@AHJHBOL1BCB**&&+ U@;:Ca c#.L1FEXH-]AFIA$%&%#0($&%"$67-$!3
*&$+ 孙凌燕3氯过氧化物酶的发酵条件优化*\+3上海"上海师范 大学# ##############################################$%%73
国外动态
日本开发超级乳化工艺#使生物柴油生产成本降低 $(f 日本神奈川大学的)@;GF5@^CJ@研究团队开发出新的超级乳化工艺用于生物柴油生产#无需净化过程# 可降低成本$(f#也可减少 (f的*+
$排放( 新的工艺涉及形成三相乳化液#无需添加常规乳化时所需要的表面活性剂( 将柴油和麻疯树油与纳米 尺寸$% i(% LJ%的蓖麻油微滴相混合制取乳化的生物柴油#该乳化柴油具有良好的燃烧性质#可减少
*+
$)氮氧化物和颗粒物质排放( 通过麻疯树油的反酯化处理#这种生物柴油的生产不会产生副产物甘油( 该燃料已在$ B商业化柴油汽车上进行过试用#满罐油一次可行驶 &$% aJ($文伟河%
&("第 # 期 陈"军等"海洋真菌"#$%#&()*+,-./)#0(产氯过氧化物酶的双水相提纯条件