全 文 ：微生物学通报 DEC 20, 2009, 36(12): 1807~1811
Microbiology © 2009 by Institute of Microbiology, CAS
tongbao@im.ac.cn


* 通讯作者：Tel: 86-25-83172082; : yuanlhong@163.com
收稿日期：2009-05-31; 接受日期：2009-08-17
研究报告
利用麻风树油驯化筛选高活性脂肪
酶产生菌及其催化酯化反应
袁丽红* 黄 晶 陆玉婷 周海霞
(南京工业大学生物与制药工程学院 江苏 南京 210009)


摘 要: 以 1 株分解麻风树油的脂肪酶产生菌 Pseudomonas sp. LP-1 为出发菌株, 通过麻疯树油定
向驯化筛选获得 1 株酶活较高且产酶稳定的菌株 P. sp. X-2-45, 其水解酶活为 29.79 U/mL, 比原始
菌株提高了 288%。对 P. sp. X-2-45 生长与产酶特征、对植物油脂水解能力及在有机相中催化脂肪
酸和有机醇间的酯化反应研究发现, 该菌株生长速率和产酶速率明显加快, 培养 30 h 时生物量和
酶活达到最大, 稳定期延长, 培养过程中脂肪酶在培养基中的稳定性提高。以麻疯树油诱导合成
的 P. sp. X-2-45 脂肪酶对麻疯树油的水解能力比原始菌株提高了 378%, 说明采用麻风树油定向驯
化可提高脂肪酶对相应底物的水解能力。X-2-45 脂肪酶可以催化月桂酸与正丁醇、正辛醇、月桂
醇和丙三醇之间, 棕榈酸、硬脂酸与甲醇、正辛醇、月桂醇和丙三醇之间, 油酸与甲醇、正丁醇、
正辛醇、月桂醇和丙三醇之间发生酯化反应。
关键词: Pseudomonas sp., 脂肪酶, 驯化, 麻风树油, 酯化反应
Breeding of High Lipolytical Bacteria by Acclimation
to Jatropha Oil and Resultant Strain-catalyzed
Esterification Reaction
YUAN Li-Hong* HUANG Jing LU Yu-Ting ZHOU Hai-Xia
(College of Life Science and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing, Jiangsu 210009, China)
Abstract: A strain, Pseudomonas sp. X-2-45, with high and stable lipolytical activity was screened by con-
tinuously subculturing a lipase-producing bacterium P. sp. LP-1 in culture medium containing Jatropha oil
as a sole carbon source. Its hydrolytic activity was 29.79 U/mL, which was increased by 288% as compared
to that of parent strain. Furthermore, the growth and lipase synthesis of X-2-45, its catalytic ability to hydro-
lyze vegetable oils, as well as ester synthesis between fatty acids and organic alcohols were studied. Results
showed that rates of bacterial growth and lipase synthesis were significantly raised. Bacterial biomass and
lipase activity reached the highest level after 30 h of incubation. Moreover, growth stationary period was
prolonged and lipase produced exhibited good stability in culture media during incubation period. Hydro-
lytic activity of P. sp. X-2-45 lipase toward Jatropha oil was increased by 378% as compared to parent strain,
suggesting that acclimation to Jatropha oil was an effective approach for improving substrate selectivity of
DOI:10.13344/j.microbiol.china.2009.12.001
1808 微生物学通报 2009, Vol.36, No.12

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lipase. Finally, results of ester synthesis catalyzed by P. sp. X-2-45 lipase indicated that this lipase could
catalyze esterification reactions between lauric acid and n-butanol, n-octanol, 1-dodecanol or glycerol,
palmitic acid or stearic acid and methanol, n-octanol, 1-dodecanol or glycerol, oleic acid and methanol,
n-butanol, n-octanol, 1-dodecanol or glycerol.
Keywords: Pseudomonas. sp., Lipase, Acclimation, Jatropha oil, Esterification
脂肪酶(Lipase, EC3.1.1.3)是一类在油 /脂－水
界面将油脂水解成甘油和脂肪酸的酯键水解酶, 普
遍存在于微生物和动植物体内。随着对微生物脂肪
酶的研究, 已发现了多种具有不同酶学性质、底物
特异性和催化特性的微生物脂肪酶, 它们在水解、
酯化、转酯及手性化合物合成等反应中表现出广阔
的应用前景[1,2]。
近年来随着石化资源的枯竭, 能源危机愈演愈
烈 , 生物柴油作为可再生的绿色能源受到广泛关
注。脂肪酶作为一种良好的酯交换反应生物催化剂
用于生物柴油生产, 具有反应条件温和、提取简单、
醇用量少、甘油易回收、无污染物排放和能耗低等
优点, 显示出良好的应用前景[3]。目前生产生物柴油
的原料多为大豆油、菜籽油和废弃食用油等, 所用
的 脂 肪 酶 主 要 来 自 假 丝 酵 母 (Candida) 、 根 霉
(Rhizopus)、毛霉(Mucor)和青霉(Penicillium)等微生
物。不同来源脂肪酶其催化特异性和活性不同。再
有, 在生物柴油生产过程中脂肪酶对有机溶剂的耐
受性和稳定性较差[4]。在我国西部退耕还林工程中
大面积种植的麻风树油料作物也是生产生物柴油的
主要原料, 但以麻风树油为原料制备生物柴油的脂
肪酶尚少见报道。我们在先前研究中从以粉碎的麻
风树种子处理半年的土壤中分离出一株分解麻风树
油的脂肪酶产生菌 Pseudomonas sp. LP-1[5]。本研究
在上述工作基础上以麻疯树油作为选择因子对该菌
株进行定向驯化, 以期得到分解麻风树油能力更强
的脂肪酶产生菌, 同时对其底物水解特性和催化酯
化反应进行研究, 为今后以麻风树油为原料酶法生
产生物柴油奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株: P. sp. LP-1 分离自已粉碎的麻风树种子
处理半年的土壤中。
1.1.2 培养基: 驯化培养基(g/L): (NH4)2SO4 3.0、酵
母膏 5.0、MgCl2 10.0、麻疯树油 20~40, pH 6.5; 平
板初筛培养基(g/L): 蛋白胨 5.0、牛肉膏 3.0、琼脂
15.0、麻风树油 20, pH 7.2; 种子培养基(g/L): 牛肉
膏 0.4、蛋白胨 1.0、NaCl 5.0、MgSO4·7H2O 0.5、橄
榄油或麻疯树油 20, 自然 pH; 初筛、复筛和发酵培
养基(g/L): 橄榄油或麻风树油 20、(NH4)2SO4 5.0、
酵母膏 5.0、MgCl2 5.0, pH 6.5。
1.2 实验方法
1.2.1 P. sp. LP-1 定向驯化筛选: 将 P. sp. LP-1 接
种到驯化培养基中, 30°C、180 r/min 培养 3 d~5 d 转
接一次, 驯化 270 d 后于营养琼脂培养基上涂布分
离, 待长出单菌落后随机挑取 1000 株点种于初筛平
板上, 30°C 培养, 观察菌落周围出现水解圈的时间
及大小, 选择水解圈大的 300 株菌继续点种于初筛
平板上, 与第 1 次平板初筛结果对比选择水解圈大
的 100 株菌进行摇管初筛, 最后挑选 30 株进入复筛,
复筛时每个菌株重复 3 次。培养条件为接种量 10%,
35°C 振荡培养 36 h, 转速 180 r/min。
1.2.2 产酶稳定性实验: 复筛得到的菌株在营养琼
脂斜面上连续转接 16 次(每 24 h 转接 1 次), 每转接
4 次接种于发酵培养基中培养 36 h 测定酶活, 考察
其产酶的稳定性, 连续测 4 次。
1.2.3 菌株对植物油脂水解能力比较: 发酵培养基
中分别以橄榄油和麻疯树油作为碳源, 培养 36 h。
选择橄榄油、麻疯树油、大豆油等植物油脂为底物,
采用醋酸铜比色法测定脂肪酶水解活性。以橄榄油
诱导产生的脂肪酶对橄榄油的水解活性为 100%。
1.2.4 驯化菌产生脂肪酶的酯化反应 : 参 照
Georgina 方法[6]。10 mL 正己烷中加入待反应的有机
醇和有机酸(均为 0.05 mol/L), 2 mL 培养 36 h 菌液,
40°C 下反应 48 h。用 TLC 法检测酯化反应产物。
硅胶 G 薄层色谱板, 展开剂为石油醚:乙醚:冰乙酸
(70:30:1), 碘蒸气显色。
1.2.5 脂肪酶水解活性测定-醋酸铜比色法: 发酵
液于 4°C、8000 r/min 离心 15 min, 上清液即为脂肪
酶酶液。3 mL 0.05 mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.0)与 1 mL
橄榄油混合均匀预热 5 min, 加 1 mL 酶液, 于 35°C、
袁丽红等: 利用麻风树油驯化筛选高活性脂肪酶产生菌及其催化酯化反应 1809

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200 r/min 水浴摇床中反应 10 min 后立即加入 8 mL
苯萃取, 静置分层后取上层有机相 4 mL, 加 1 mL
4%醋酸铜显色剂(4 g 醋酸铜溶于 100 mL 蒸馏水中,
用吡啶调 pH 6.1), 充分混合, 静置, 取上层测 OD710,
以灭活酶液为参照。酶活单位定义为上述条件下每
分钟催化底物水解产生 1 µmol 脂肪酸为 1 个酶活单
位(U)。以油酸为脂肪酸检测的标准品。
2 结果与讨论
2.1 P. sp. LP-1 定向驯化
表 1 为 P. sp. LP-1 经过麻风树油定向驯化 270 d
后筛选获得的 6 株脂肪酶活性显著提高的菌株, 其
中 X-2-45 酶活为 29.79 U/mL, 比原始菌株 LP-1 提
高了 288%。进一步考察 X-2-45 菌产酶稳定性(表 2),
结果发现经过连续 16 次转接其酶活稳定在 30 U/mL
左右, 未见明显波动, 说明经麻风树油定向驯化筛
选获得的菌株具有良好的遗传稳定性。

表 1 菌株驯化筛选结果
Table 1 Lipase activities of resultant strains
菌株
Strains
LP-1 X-2-144 X-2-45 X-1-46 X-3-281 X-3-98 X-2-101
酶活
(U/mL)
Lipase
activity
(U/mL)
7.68 20.52 29.79 14.38 18.67 16.71 18.89

表 2 X-2-45 产酶稳定性
Table 2 Lipase production stability of X-2-45
传代次数
Passages
4 8 12 16 Average
酶活(U/mL)
Lipase activity
(U/mL)
30.19 28.63 29.83 32.16 30.20

2.2 驯化菌 P. sp. X-2-45 生长及产酶特征
比较了驯化菌 P. sp. X-2-45 和原始菌 P. sp.
LP-1 生长及产酶特征, 结果(图 1)发现 X-2-45 生长
速度显著提高, 培养约 30 h 时生物量基本达到最大,
稳定期较原始菌明显延长。同样, 其产酶速率也显
著提高, 产酶高峰提前, 培养 30 h 时脂肪酶活性达
到最大, 并且在培养 30 h~48 h 内酶活未见明显下
降。而原始菌培养 36 h 酶活达到最大, 随后酶活迅
速下降, 这一结果说明通过采用麻疯树油定向驯化
策略不仅提高了驯化菌脂肪酶活性, 而且也提高了
脂肪酶在发酵培养基中的稳定性, 这可能是由于麻
疯树油的定向驯化也同时降低了驯化菌合成蛋白酶
能力的缘故, 从而使得驯化菌合成的脂肪酶未被或
很少被蛋白酶立即降解。实验中我们也比较了驯化
菌 X-2-45 和原始菌 LP-1 在发酵过程中蛋白酶活性
差异, 发现驯化菌蛋白酶活性显著低于原始菌蛋白
酶活性(数据未显示)。
2.3 驯化菌 P. sp. X-2-45 脂肪酶对植物油脂底物
的水解能力
以橄榄油或麻疯树油为唯一碳源培养驯化菌和
原始菌, 培养 36 h 测定合成的脂肪酶对橄榄油、麻
风树油、大豆油、菜籽油、向日葵油和黄连木油等
6 种植物油脂的水解能力, 结果见图 2。
从图 2 可以看出 , 以橄榄油为碳源时驯化菌
X-2-45 合成的脂肪酶对橄榄油等 6 种植物油脂水解
能力不同, 其中对橄榄油、麻风树油和大豆油的水
解能力显著提高, 与驯化前相比分别提高了 278%、
198%和 57%, 而对菜籽油、向日葵油和黄连木油的
水解能力未见明显提高; 以麻风树油为发酵培养基
碳源时, X-2-45 脂肪酶对植物油脂水解能力除葵花


图 1 P. sp. X-2-45 和 P. sp. PL-1 生长和产酶特征
Fig. 1 Time courses of the growth and lipase production of P. sp. X-2-45 and P. sp. PL-1
1810 微生物学通报 2009, Vol.36, No.12

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图 2 X-2-45 和 PL-1 脂肪酶对不同植物油脂水解能力
Fig. 2 Hydrolytic activities of P. sp. X-2-45 lipase and P. sp. PL-1 lipase toward different vegetable oils
注: a: 橄榄油为产酶碳源; b: 麻风树油为产酶碳源; 1: 橄榄油; 2: 麻风树油; 3: 菜籽油; 4: 黄连木油; 5: 大豆油; 6: 向日葵油.
Note: a: Olive oil as carbon source; b: Jatropha oil as carbon source; 1: Olive oil; 2: Jatropha oil; 3: Rapeseed oil; 4: Pistacia oil; 5: Soybean
oil; 6: Sunflower oil.

籽油外均有明显提高, 其中对麻疯树油的水解能力
最强, 比驯化前提高了 378%, 其次为橄榄油和大豆
油, 再次为菜籽油和黄连木油。对比 2 种碳源诱导
产生的脂肪酶, 发现驯化前的原始菌株无论以橄榄
油为碳源, 还是以麻风树油为碳源合成的脂肪酶的
最佳水解底物并不是麻风树油, 麻风树油也不是诱
导产酶的最佳碳源, 而驯化后的菌株以麻风树油为
碳源时产生的脂肪酶对麻风树油的水解能力最强 ,
相对水解能力达 403%, 比对橄榄油的水解能力提
高了 189%, 这一结果一方面说明了采用麻风树油
定向驯化可提高其脂肪酶对相应底物的水解能力 ,
另一方面也说明麻风树油已成为驯化菌产酶的最佳
碳源。另外, 橄榄油和麻风树油诱导产生的脂肪酶
对不同植物油脂水解能力的差异也说明本研究所用
的菌株由不同诱导物诱导合成的脂肪酶具有不同性
质, 它们可能为同工酶。Helmy 等[7]报道培养基的营
养 物 质 影 响 合 成 的 脂 肪 酶 性 质 。 Lanset 等 [8] 和
Stránský[9]等也报道培养基组成影响所产生的脂肪
酶的类型, 脂肪酶对不同底物水解能力差异与合成
的脂肪酶同工酶类型有关。
2.4 驯化菌 P. sp. X-2-45 脂肪酶催化酯化反应
驯化菌 X-2-45 脂肪酶催化月桂酸、棕榈酸、硬
脂酸、油酸等脂肪酸与甲醇、正丁醇、正辛醇、月
桂醇、丙三醇等有机醇之间酯化反应结果见表 3。
从表 3 可以看出, 除了月桂酸与甲醇、硬脂酸和棕
榈酸与正丁醇之间较难发生酯化反应外, 月桂酸与
正丁醇、正辛醇、月桂醇和丙三醇之间, 棕榈酸和
硬脂酸与甲醇、正辛醇、月桂醇和丙三醇之间, 油
酸与甲醇、正丁醇、正辛醇、月桂醇和丙三醇之间
均可在 X-2-45 脂肪酶催化下发生酯化反应。图 3 为
油酸与月桂醇酯化反应产物 TLC 检测结果, 若在
254 nm 下观察, 月桂醇呈现出微弱的荧光班点。反
应产物样比底物样多出一个斑点, 初步判断产物中
有油酸月桂醇酯的生成。
3 结论
以麻风树油为选择因子对一株分解麻风树油的
脂肪酶产生菌进行连续驯化, 经过 270 d 驯化培养
分离筛选出 1 株脂肪酶活性显著提高的菌株 X-2-45,
其水解活性比原始菌株提高了 288%。经过连续 16
次转接酶活稳定在 30 U/mL 左右, 具有较好的遗传
稳定性。对 X-2-45 生长及产酶特征研究发现其生长
和产酶速率显著提高, 培养 30 h 时菌体生物量和酶
活达到最大, 稳定期明显延长, 培养过程中脂肪酶

表 3 X-2-45 脂肪酶催化的酯化反应
Table 3 Ester synthesis catalyzed by X-2-45 lipase
甲醇
Methanol
正丁醇
n-butanol
正辛醇
n-octanol
月桂醇
1-dodecanol
丙三醇
Glycerol
月桂酸
Lauric
acid
－ + + + +
棕榈酸
Palmitic
acid
+ － + + +
硬脂酸
Stearic
acid
+ － + + +
油酸
Oleic
acid
+ + + + +
袁丽红等: 利用麻风树油驯化筛选高活性脂肪酶产生菌及其催化酯化反应 1811

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图 3 X-2-45 脂肪酶催化的酯化反应产物薄层色谱图
Fig. 3 TLC of product of esterification reaction catalyzed
by X-2-45 lipase
注: 1: 油酸; 2: 月桂醇; 3: 酯化反应产物.
Note: 1: Oleic acid; 2: 1-dodecanol; 3: Reaction product.

在培养基中的稳定性提高。驯化菌 X-2-45 在以疯树
油为唯一碳源培养基中诱导合成的脂肪酶对麻风树
油的水解能力显著提高, 比原始菌株 LP-1 提高了
378%。X-2-45 脂肪酶可以催化月桂酸与正丁醇、正
辛醇、月桂醇和丙三醇之间, 棕榈酸、硬脂酸与甲醇、
正辛醇、月桂醇和丙三醇之间, 油酸与甲醇、正丁醇、
正辛醇、月桂醇和丙三醇之间发生酯化反应。
参 考 文 献
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