全 文 ：第７卷第４期
２００９年７月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．４
Ｊｕｌｙ２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０４．００１
收稿日期：２００８－０４－２８
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０６７１４５７）
作者简介：林俊芳（１９６２—），男，福建莆田人，教授，博士生导师，研究方向：生物转化与生物加工，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｎｊｆ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
真菌漆酶的酶活测定方法评价
林俊芳１，２，刘志明１，陈晓阳２，郭丽琼１，２，王 杰１
（１．华南农业大学 食品学院，广州 ５１０６４２；２．华南农业大学 生物质能研究所，广州 ５１０６４２）
摘 要：目前真菌漆酶酶活的测定方法多样，没有统一的标准，致使不同研究之间的漆酶酶活无法进行比较分
析，也造成漆酶产品在酶活质量意义上的混乱。因此，对测定真菌漆酶酶活的各种不同的分光光度法进行了综
述和比较分析，认为采用ＡＢＴＳ法作为测定漆酶酶活的方法较具合理性和科学性，建议作为漆酶酶活测定的统一
方法。
关键词：酶活测定；真菌漆酶；ＡＢＴＳ
中图分类号：Ｑ５５４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０４－０００１－０８
Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆａｓｓａｙｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｆｕｎｇａｌｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
ＬＩＮＪｕｎｆａｎｇ１，２，ＬＩＵＺｈｉｍｉｎｇ１，ＣＨＥＮＸｉａｏｙａｎｇ２，ＧＵＯＬｉｑｉｏｎｇ１，２，ＷＡＮＧＪｉｅ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ；
２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｍａｓｓＲｅｓｅａｒｃｈ，ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｌｔｈｏｕｇｈｔｈｅｒｅａｒｅｓｅｖｅｒａｌｋｉｎｄｓｏｆｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｆｕｎｇａｌｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ，ｎｏｎｅｏｆ
ｔｈｅｍｈａｖｅｂｅｅｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｔｏｂｅａｃｃｅｐｔａｂｌｅ．Ｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｄｉｆｅｒｅｎｔｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｗｅｒｅ
ｄｉｆｅｒｅｎｔｌｙｄｅｆｉｎｅｄａｎｄｗｅｒｅｎｏｔｃｏｍｐａｒａｂｌｅｗｉｔｈｏｔｈｅｒｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃａｓｓａｙｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｆｕｎｇａｌｌａｃ
ｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｏｒｉｇｉｎｓａｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄ．ＩｔｉｓｃｏｎｃｌｕｄｅｄｔｈａｔｕｓｉｎｇＡＢＴＳａｓｔｈｅ
ｓｕｂｓｔｒａｔｅｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｒｅａｓｏｎａｂｌｅａｎｄａｃｃｅｐｔａｂｌｅ．Ａｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｏｆａｕｎｉｖｅｒｓａｌａｎｄ
ｕｎｉｆｏｒｍｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｆｕｎｇａｌｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｂａｓｅｄｏｎＡＢＴＳｗａｓｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙ；ｆｕｎｇａｌｌａｃｃａｓｅ；ＡＢＴＳ
漆酶（ＥＣ１．１０．３．２）是 １种含铜的多酚氧化
酶，能够催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使之生
成相应的醌和水［１］。真菌漆酶因为具有降解木质
素、酚类物质的作用，所以在纺织、造纸、食品、饲
料、环保等方面具有广泛的应用潜力［２］，其研究越
来越受到重视。测定漆酶酶活是漆酶研究的重要
环节，酶活大小是评价漆酶产酶菌种和漆酶产品优
劣的直接依据。目前漆酶酶活的测定方法有分光
光度法［３］、测 Ｏ２法
［４］、高效液相色谱法［５］、极谱
法［６］、脉冲激光光声分析法［７］、微量热法［８］等，其中
分光光度法因为具有操作简单、快速、无需配备昂
贵仪器设备等特点，所以被广泛采用。然而因为真
菌漆酶来源广泛和作用底物多样，加上分光光度法
测定漆酶酶活又可分为多种方法，所以漆酶酶活的
测定方法及其酶活单位定义目前还没有形成统一
的约定，使得不同来源的漆酶产酶菌种和漆酶产品
的酶活无法进行比较，因此给漆酶的研究、生产和
应用带来许多不便。本文对普遍采用的测定漆酶
酶活的分光光度法及其酶活单位定义进行综述和
比较，旨在寻求１种能够被广泛接受的漆酶酶活测
定方法和酶活单位定义。
１ 漆酶酶活的测定原理
分光光度法测定漆酶酶活的基本原理是选定
某种漆酶作用的底物，底物在漆酶催化作用下首先
形成底物自由基［９］，底物自由基在特定的光波波长
下有最大的吸光系数，随着底物自由基浓度的增
加，吸光度值增大，依据吸光值（ＯＤ）随时间变化的
关系计算出酶活。
２ 漆酶酶活测定方法
根据测定漆酶酶活底物种类的不同，漆酶酶活测
定方法可划分为２，２′二氮 双（３乙基苯并噻唑 ６
磺酸）（ＡＢＴＳ）法、愈创木酚法、邻联甲苯胺法、２，６
二甲氧基酚（２，６ ＤＭＰ）法、丁香醛连氮法、苯二胺
法、酚红法、４ 二甲氨基吡啶（ＤＭＡＰ）法、ＭＢＱＨ２
法、儿茶酚法等。
２．１ ＡＢＴＳ法
ＡＢＴＳ，是测定漆酶酶活常用的底物。ＡＢＴＳ法
测定漆酶酶活（表１），通常采用醋酸钠溶液作为缓
冲溶液，在反应体系内的终浓度常为００２、００５或
０１０ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ主要在 ４～５之间。反应体系内
ＡＢＴＳ的浓度在 ０１～５ｍｍｏｌ／Ｌ，常用终浓度为
０５ｍｍｏｌ／Ｌ。测定反应一般在室温下进行，但有时
为了避免Ｈ２Ｏ２的影响，选择在较高的温度进行，以
去除Ｈ２Ｏ２
［１０］。ＡＢＴＳ经漆酶作用后形成 ＡＢＴＳ自
由基［９］，在４２０ｎｍ处ＡＢＴＳ自由基的吸光系数远大
于底物 ＡＢＴＳ，随着 ＡＢＴＳ自由基浓度的增加，吸光
度值变大，因此一般在４２０ｎｍ［１１－１２］处检测ＯＤ值的
变化，但也有选择４３６ｎｍ波长的报道［１３］。
表１ ＡＢＴＳ法测定漆酶酶活
Ｔａｂｌｅ１ ＬａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＡＢＴＳｓｕｂｓｔｒａｔｅ
漆酶来源
反应缓冲溶液
名称 浓度／（ｍｏｌ·Ｌ－１）
ｐＨ
底物浓度／
（ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
反应温度／
℃
反应时间／
ｍｉｎ
波长／
ｎｍ
ＧａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍＫＭＫ２［１４］ 醋酸钠 ００８０ ５０ １００ ３０ — ４２０
Ｌｅｎｔｉｎｕｓｅｄｏｄｅｓ［１５］ 丙二酸钠 ００５０ ４５ ０３０ ２２ — ４２０
Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｏｓｔｒｅａｔｕｓ［１６］ 柠檬酸盐 ００４０ ５６ ０５０ ２５ — ４２０
Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｏｓｔｒｅａｔｕｓ［１７］ 醋酸钠 ００５０ ５０ ０１７ ３０ — ４２０
Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ［１８］ 酒石酸钠 ００５０ ４０ ０５０ ３０ — ４２０
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｓａｍｍｏｔｉｃｕｓ［１９］ 磷酸钠 ０２００ ７５ ０５０ — １ ４２０
Ｔｒａｍｅｔｅｓｈｉｒｓｕｔａ［２０］ 琥珀酸 ００２５ ３０ ４７ ２５ ２ ４３６
Ｔｒａｍｅｔｅｓｖｉｌｏｓａ［２１］ 醋酸钠 ０１００ ５０ ０５０ ５０ — ４２０
注：表中所列浓度指的是反应体系内的终浓度，“—”表示没有具体数据。
２．２ 愈创木酚法
愈创木酚法测定漆酶酶活（表２），缓冲溶液常
用琥珀酸钠溶液，终浓度为００５ｍｏｌ／Ｌ。缓冲溶液
的ｐＨ基本为４５，个别如磷酸钠缓冲溶液的 ｐＨ则
为６０。底物愈创木酚有 ３种常用的终浓度 ０４、
０８和１０ｍｍｏｌ／Ｌ。反应温度基本都是在３０℃进
行，而反应时间都是３０ｍｉｎ。测定 ＯＤ值变化的光
波波长为４６５ｎｍ［２２］。
２．３ 邻联甲苯胺法
以邻联甲苯胺作为测定漆酶酶活底物时（表
３），以醋酸溶液为反应体系缓冲溶液，其 ｐＨ为
４０或 ４６，缓冲液浓度主要是 ００３９、００７７或
００８５ｍｏｌ／Ｌ３种。底物浓度基本是０３７３ｍｍｏｌ／Ｌ
或０４２０ｍｍｏｌ／Ｌ。反应温度可选择在４０、３０、２８或
２ 生 物 加 工 过 程 第７卷
２５℃。反应时间的选择与反应温度有关，通常在
４０℃和３０℃下反应５ｍｉｎ，在２８℃和２５℃下反应
３０ｍｉｎ。测 ＯＤ值 变 化 的 光 波 波 长 主 要 选 择
在６００ｎｍ。
表２ 愈创木酚法测定漆酶酶活
Ｔａｂｌｅ２ Ｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｇｕａｉａｃｏｌｓｕｂｓｔｒａｔｅ
漆酶来源
反应缓冲溶液
名称 浓度／（ｍｏｌ·Ｌ－１）
ｐＨ
底物浓度／
（ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
反应温度／
℃
反应时间／
ｍｉｎ
波长／
ｎｍ
Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａａｄｕｓｔａ［２３］ 琥珀酸 ００４ ４５ ０８ ３０ ３０ ４６５
Ｃｏｒｉｏｌｕｓｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ［２４］ 琥珀酸钠 ００５ ４５ ０４ ３０ ３０ ４６５
Ｃｏｒｉｏｌｕｓｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ［２５］ 琥珀酸钠 ００５ ４５ ０４ ４０ ３０ ４６５
Ｃｏｒｉｏｌｕｓｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ［２２］ 磷酸钠 — ６０ １ ３０ ３０ ４６５
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓａ［２６］ 琥珀酸 ＮａＯＨ ００４ ４５ ０８ ２５ ３０ ４６５
表３ 邻联甲苯胺法测定漆酶酶活
Ｔａｂｌｅ３ Ｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｏｔｏｌｉｄｉｎｅｓｕｂｓｔｒａｔｅ
漆酶来源
反应缓冲溶液
名称 浓度／（ｍｏｌ·Ｌ－１）
ｐＨ
底物浓度／
（ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
反应温度／
℃
反应时间／
ｍｉｎ
波长／
ｎｍ
Ａｍａｎｉｔａｖｅｒｎａ［２７］ 醋酸 ００７７ ４６ ０３７３ ２５ ５ ５９５
ＣｏｒｉｏｌｕｓＶｅｒｓｉｃｏｌｏｒ［２８］ 醋酸 ００７７ ４６ ０３７３ ２５ ３０ ６００
Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｌｉｇｎｅｔｉｌｉｓ［２９］ 醋酸 ００８５ ４６ ０４２０ ２５ ３０ ６００
Ｔｒａｍｅｔｅｓｇａｌｉｃ［３０］ 醋酸 ００８５ ４０ ０４２０ ４０ ５ ６００
ＴｒａｍｅｔｅｓｔｒｏｇｉＢｅｒｋ［３１］ 醋酸 ００３９ ４０ ０３７３ ３０ ５ ６００
２．４ ＤＭＰ法
ＤＭＰ法以 ２，６ ＤＭＰ作为酶活测定底物（表
４），可以选择醋酸、醋酸钠、柠檬酸盐 磷酸盐、柠檬
酸 柠檬酸钠、柠檬酸盐多种溶液作为缓冲溶液。
ｐＨ在３～６５之间，以酸性条件为主。底物终浓度
在０１～２０ｍｍｏｌ／Ｌ之间，常用１０ｍｍｏｌ／Ｌ。反应
温度较高，在３０℃以上，最高达５０℃。ＤＭＰ被转
化为３，５，３′，５′四甲氧基二苯醌，检测波长有
４６８［３２］、４７０［３３］和４７７ｎｍ［３４］这３种。
表４ ＤＭＰ法测定漆酶酶活
Ｔａｂｌｅ４ ＬａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＤＭＰｓｕｂｓｔｒａｔｅ
漆酶来源
反应缓冲溶液
名称 浓度／（ｍｏｌ·Ｌ－１）
ｐＨ
底物浓度／
（ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
反应温度／
℃
反应时间／
ｍｉｎ
波长／
ｎｍ
Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａｓｐ．［３２］ 柠檬酸盐 磷酸盐 ００２６ ６５ １５ ４５ ５ ４６８
Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ［３５］ 醋酸 ００３０ ４５ ０６０ ３０ — ４７０
ＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓＬｉｇｎｏｓｕｓ［３３］ 柠檬酸 柠檬酸 ００００２０ ３５ ０２０ ３０ — ４７０
Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓｓｐ．Ｗ１［３６］ 柠檬酸 柠檬酸 ００００２０ ３６ ０１０ — — ４７０
Ｔｒａｍｅｔｅｓｇａｌｉｃａ［３４］ 醋酸钠 ０１０ — １０ — — ４７７
Ｔｒａｍｅｔｅｓｍｏｄｅｓｔａ［３７］ 柠檬酸盐 ００５０ ５０ ２０ ５０ — ４６８
２．５ 丁香醛连氮法
丁香醛连氮法测定漆酶酶活（表５）的缓冲液为
柠檬酸盐 磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸和醋酸盐溶液，
ｐＨ在５～６之间。底物浓度的选择范围集中在低浓
度，一般在００１～００３ｍｍｏｌ／Ｌ。测定时的反应温
度基本在２５℃条件下进行。测量波长有 ５２０［３８］、
５２５［３９］和５４０ｎｍ［４０］这３个，但通常采用５２５ｎｍ的光
源进行检测。
３ 第４期 林俊芳等：真菌漆酶的酶活测定方法评价
表５ 丁香醛连氮法测定漆酶酶活
Ｔａｂｌｅ５ Ｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｓｙｒｉｎｇａｌｄａｚｉｎｅｓｕｂｓｔｒａｔｅ
漆酶来源
反应缓冲溶液
名称 浓度／（ｍｏｌ·Ｌ－１）
ｐＨ
底物浓度／
（ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
反应温度／
℃
反应时间／
ｍｉｎ
波长／
ｎｍ
Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ［３９］ 柠檬酸盐 磷酸盐 ００１５ ５０ ０１０ — ５ ５２５
Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｏｓｔｒｅａｔｕｓ［１６］ 柠檬酸盐 ００４０ ５６ ０２０ ２５ — ５２５
Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｓｐｅｃｉｅｓ［３８］ 醋酸 ０１０ ５０ １００ — １ ５２５
Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａｏｒｙｚａｅ［４０］ 磷酸盐 ００５０ ６０ ００２０ ２５ — ５４０
Ｔｒａｍｅｔｅｓｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ［４１］ 柠檬酸盐 磷酸盐 ００５０ ４８ ００２５ ２５ — ５２５
Ｔｒａｍｅｔｅｓｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ［４２］ 柠檬酸盐 磷酸盐 ００５０ ５２ ００２５ ３０ — ５２０
２．６ 其他底物法
此外，还有采用对苯二胺、酚红、ＤＭＡＰ、ＭＢＱＨ２
和儿茶酚作为底物测定漆酶酶活，不过，这些底物测
定法报道的文献较少，其具体操作参数如表６所示。
表６ 以其他底物测定漆酶酶活
Ｔａｂｌｅ６ Ｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｏｔｈｅｒｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ
漆酶来源
反应缓冲溶液
名称 浓度／（ｍｏｌ·Ｌ－１）
ｐＨ 底物
底物浓度／
（ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
反应温度／
℃
反应时间／
ｍｉｎ
波长／
ｎｍ
Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｅｒｙｎｇｉ［４３］ 磷酸盐
００５
（含０３０％底物） ７１ 对苯二胺 — ２５ — ４９０
Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｅｒｙｎｇｉ［４４］ 磷酸盐 ００２ ５０ ＭＢＱＨ２ ０５ ２５ — ３６０
Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａｏｒｙｚａｅ［４０］ 磷酸盐 ００５ ６０ ＤＭＡＰ ０２ ２５ — ３６８
Ｔｒａｍｅｔｅｓｇａｌｉｃａ［３４］ 醋酸钠 ０１ ６０ 酚红 １ — — ４３２
Ｔｒａｍｅｔｅｓｐｕｂｅｓｃｅｎｓ［４５］柠檬酸盐 磷酸盐 ０１ ４２ 儿茶酚 １０ ２５ — ４１０
３ 各种漆酶测定方法的特点与比较分析
漆酶含有 ４个铜原子，可分为 ３类：Ⅰ型 Ｃｕ２＋
（Ｔ１Ｃｕ）、Ⅱ型Ｃｕ２＋（Ｔ２Ｃｕ）和Ⅲ型Ｃｕ４＋２ （Ｔ３Ｃｕ）
［４６］。漆
酶与底物反应时，底物首先被 Ｔ１Ｃｕ氧化，并向漆酶
转移１个电子，底物同时形成自由基。随后，电子通
过保守的ＨｉｓＣｙｓＨｉｓ三肽结构传递到 Ｔ２和 Ｔ３Ｃｕ
组成的三核铜簇，在这里氧气被还原成水［９，４７］。漆
酶酶活是通过测定漆酶催化 ＡＢＴＳ、ＤＭＰ、丁香醛连
氮或愈创木酚所生成产物的速率来获得的。对于
ＤＭＰ、丁香醛连氮和愈创木酚是测定生产的醌类物
质，而对于 ＡＢＴＳ则是直接测定生产的 ＡＢＴＳ阳离
子自由基。
当用ＤＭＰ、丁香醛连氮和愈创木酚测定酶活
时，底物首先向漆酶转移１个电子，同时形成底物自
由基，这些底物自由基不稳定，可以进一步氧化形
成醌类物质，同时也可形成碳自由基，它们可以相
互聚合，因此产物中除醌外还有聚合物和 Ｃ—Ｏ、
Ｃ—Ｃ偶联产物［９，４６，４８］。由于只是在某波长下测定
产物醌类物质的数量来计算酶活，有一部分被转化
的底物所生成的产物未被计算在内，所以酶活是被
低估了。另外，底物自由基参与生成醌类物质的量
是不确定的，因此酶活的测定也存在不稳定性。相
比之下，用ＡＢＴＳ测定酶活就更合理一些，避免前３
种底物遇到的问题。ＡＢＴＳ被漆酶催化形成自由基
后，不会有其他副反应和产物形成，产物只有 ＡＢＴＳ
自由基，通过测定其数量就可以计算出酶活，更能
准确和稳定地反映出真实的漆酶酶活。
从漆酶对ＡＢＴＳ、ＤＭＰ、丁香醛连氮、愈创木酚的
催化特性来看［４７］（表７），漆酶对ＡＢＴＳ和丁香醛连氮
的Ｋｍ值很小而Ｋｃａｔ值很大，表明漆酶对ＡＢＴＳ和丁香
醛连氮有很高的亲和力和很强的催化反应能力。同
时，ＡＢＴＳ和丁香醛连氮的吸光系数较高，说明以其为
底物测定漆酶活性的灵敏度较高。这表明 ＡＢＴＳ法
４ 生 物 加 工 过 程 第７卷
和丁香醛连氮法都很适合作为漆酶酶活测定的方法。
与之相比，漆酶对 ＤＭＰ和愈创木酚的 Ｋｍ值很高而
Ｋｃａｔ值很低，说明漆酶对这两种底物的亲和力相对较
小，催化能力较弱。因而用愈创木酚法测定漆酶酶
活，其缺点是反应时间长，测得的酶活力较低，这正是
与该反应的米氏常数较大有关，而ＤＭＰ法则需要很
高的温度。另外，邻联甲苯胺测定漆酶酶活时，该底
物水溶性差，测得的酶活力也较低。
表７ 真菌漆酶催化特性
Ｔａｂｌｅ７ Ｃａｔａｌｙｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｆｕｎｇａｌｌａｃｃａｓｅｓ
底物
特性
米氏常数Ｋｍ／
（μｍｏｌ·Ｌ－１）
催化速率常数Ｋｃａｔ／
ｓ－１
摩尔消光系数／
（Ｌ·（ｍｏｌ·ｃｍ）－１）
ＡＢＴＳ ３９ ２４０５０ ３６０００
ＤＭＰ ４０５ ３６８０ ４９６００
丁香醛连氮 ３６ ２１５００ ６５０００
愈创木酚 ４２０ ２９５ １２１００
在国外的文献报道中，常用 ＡＢＴＳ法或丁香醛
连氮法测定漆酶酶活，而国内常用ＡＢＴＳ法、愈创木
酚法和邻联甲苯胺法测定漆酶酶活。根据漆酶对
底物的亲和力、催化产物的特点、摩尔消光系数、测
定条件和效果，笔者认为采用 ＡＢＴＳ法测定漆酶酶
活是１种比较理想的方法。这种方法具有如下优
点：ＡＢＴＳ易溶于水，常温放置性质稳定；催化反应
只有１步，即从 ＡＢＴＳ到它的阳离子自由基，ＡＢＴＳ
的离子自由基在水溶液中比较稳定，使得测定的
ＯＤ值相对稳定和准确；在 ｐＨ２～１１之间，ＡＢＴＳ的
氧化对 ｐＨ没有依赖性［４９］；在漆酶的作用下，ＡＢＴＳ
有色溶液的摩尔吸光系数较高，说明以其为底物测
定的灵敏度较高；到目前为止还未有 ＡＢＴＳ有致癌
作用、诱变作用或是强烈的毒性的报道，说明 ＡＢＴＳ
使用安全［５０］。虽然漆酶来源广泛，不同来源的漆酶
与底物反应的亲和力不一样，同一来源的漆酶与不
同底物的反应亲和力也不同，测得的酶活数值也不
同的，但是不同漆酶对 ＡＢＴＳ的亲和力和催化能力
普遍都很高，测得的酶活值也很高。所以，ＡＢＴＳ法
可以作为各种漆酶酶活测定的标准方法，使不同来
源的漆酶酶活便于比较。
４ 漆酶酶活单位定义
分光光度法测定漆酶酶活的底物多样性，造成
酶活定义的多样性及酶活单位的混乱，根据目前报
道，漆酶酶活单位定义可分成２类：１）单位时间内
转化单位量底物或生成单位量产物所需酶量定义
为１个酶活单位（Ｕ），具体有５种定义形式：Ａ）每
分钟氧化１μｍｏｌ底物所需要的酶量为１个酶活单位
（Ｕ）［５１－５３］；Ｂ）每分钟氧化生成１μｍｏｌ产物所需要的
酶量为 １个酶活单位（Ｕ）［３２，５４］；Ｃ）每秒钟氧化
１ｎｍｏｌ底物所 需 要 的 酶 量 为 １个 酶 活 单 位
（ｎｋａｔ）［３７］；Ｄ）每分钟氧化１ｎｍｏｌ底物所需要的酶量
为１个酶活单位（Ｕ）［５５］；Ｅ）每分钟氧化１ｍｍｏｌ底物
所需要的酶量为１个酶活单位（Ｕ）［５６］。２）单位时
间改变单位 ＯＤ值所需酶量定义为 １个酶活单位
（Ｕ），也有５种定义形式：Ｆ）每分钟使 ＯＤ值增加
１０所需要的酶量为１个酶活单位（Ｕ）［５７］；Ｇ）每分
钟使ＯＤ值增加０１所需要的酶量为１个酶活单位
（Ｕ）［５８］；Ｈ）每分钟使 ＯＤ值增加００１所需要的酶
量为１个酶活单位（Ｕ）［５９］；Ｉ）每分钟使ＯＤ值增加
０００１所需要的酶量为１个酶活单位（Ｕ）［６０－６１］；Ｊ）
每小时使ＯＤ值增加０１所需要的酶量为１个酶活
单位（Ｕ）［２２］。根据以上这些酶活单位定义，漆酶酶
活单位计算公式分别为
Ａ＝Ｂ＝１０
６
ε
×
Ｖ总
Ｖ（酶）×
ΔＯＤ
Δｔ
；Ｃ＝１０
３
６０×Ａ；Ｄ＝１０
３×
Ａ；Ｅ＝Ａ
１０３
；Ｆ＝Ｇ１０＝
Ｈ
１０２
＝ Ｉ
１０３
＝ Ｊ６００＝
１０３
Ｖ（酶）×
ΔＯＤ
Δｔ
；
Ｊ＝Ｇ×６０。
式中：Ｖ总 和Ｖ（酶）分别代表漆酶酶活测定反应体系
的总体积及反应添加的酶液体积；ε为吸光系数，
Ｍ－１·ｃｍ－１。除Ｃ外，所有公式计算出来的酶活单位
为Ｕ／Ｌ，Ｃ的酶活单位为 ｎｋａｔ／Ｌ。１ｋａｔ＝１０９ｎｋａｔ＝
６×１０７Ｕ。
从上述各种酶活单位定义的计算公式可以看
５ 第４期 林俊芳等：真菌漆酶的酶活测定方法评价
出，同一种漆酶对同一底物来说，Ａ定义与 Ｂ定义
的酶活在反应物与产物系数相同时是一样，而 Ｃ定
义的酶活是Ａ定义酶活的１６７倍，Ｄ定义的酶活是
Ａ定义酶活的１０００倍；Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ定义的酶活依次增
大１０倍，Ｊ定义的酶活是 Ｆ定义酶活的６００倍。因
此，采用不同的酶活单位定义，漆酶酶活的大小差
别相当大，这也是已报道的漆酶酶活在数值上相差
巨大的原因，造成了酶活大小比较上的困难和对漆
酶酶活单位大小的误解。为此，在采用相同漆酶酶
活测定方法的前提下，可以根据以上不同漆酶酶活
单位定义下的计算公式间的关系进行换算，得到一
个统一在某个定义下的漆酶酶活数值，方便进行酶
活大小的比较。然而，不同定义下的漆酶酶活虽然
可以进行换算比较，但笔者认为漆酶酶活定义应该
统一，这有利于不同研究者和不同文献材料的交流
比较和酶活大小比较的直观方便。根据国际上对
酶活单位的规定［６２］，笔者认为漆酶酶活定义可以统
一为在特定条件下，每分钟转化１μｍｏｌ底物或形成
１μｍｏｌ产物所需要的酶量为１个酶活单位（Ｕ）。这
个酶活单位定义符合酶催化活性的特点，能够直观
真实地表现出酶活的性质，应该易于普遍使用。
５ 结 论
分光光度法是目前测定漆酶酶活的常用方法，
迄今国内外发表的有关漆酶的文献中漆酶酶活的
测定大多是采用分光光度法进行的。但是，由于漆
酶来源广泛和底物多样等特点，在采用分光光度法
测定漆酶酶活时，不同研究者使用不同的底物并在
不同的条件下进行，所以不同研究者测定的漆酶酶
活差异很大，酶活的单位定义也差异很大，致使不
同研究者和不同文献之间的漆酶酶活无法进行比
较分析，也造成漆酶产品在酶活质量意义上的混
乱。因此，统一漆酶酶活测定方法和酶活单位定义
对于漆酶的研究、生产和应用是必要的。笔者认
为，漆酶的酶活单位定义建议采用国际酶学委员会
规定的定义［６２］，即在特定条件下（２５℃、最适底物
浓度、最适温度、最适ｐＨ和离子强度系统），每分钟
转化１μｍｏｌ底物或形成１μｍｏｌ产物所需要的酶量为
１个国际单位（Ｕ），漆酶的测定方法建议采用 ＡＢＴＳ
法进行。
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８ 生 物 加 工 过 程 第７卷