全 文 ：应用分子伴侣共表达系统表达 pfu基因及酶活性测定?
张海军1 , 杨 君2 , 3 , 刘晓光1 , 胡向阳2 ,3
??
(1 江苏大学生命科学研究院 , 镇江 江苏 212013; 2 中国科学院昆明植物研究所 , 云南 昆明 650204;
3 中国科学院青藏高原研究所昆明部 , 云南 昆明 650204)
摘要 : 将通过 In-fution方法构建的 pET32a- pfu质粒与可以促进可溶性表达的 HG-PGRO7 质粒一起转入大肠
杆菌 BL21 (DE3) 共表达 , 以 pET32a- pfu单独在 BL21 (DE3) 中表达作为对照。用热变性和 (NH4 )2 SO4 沉
淀去除部分杂蛋白 , 再经 Ni-NAT 亲和层析柱纯化分离 pfu蛋白 , SDS-PAGE 检测结果表明目的蛋白大小约
为 90 kD, 与预计的分子量大小一致。最后对其酶活性测定结果表明分子伴侣能够促进 pfu基因表达 , 并
能够提高酶活性。
关键词 : Pfu; 分子伴侣 ; 基因克隆 ; 载体构建 ; 原核表达 ; 蛋白纯化 ; 酶活测定
中图分类号 : Q 78 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2009) 06 - 499 - 05
Expression and Enzyme Activity Assay of pfu
with Molecular Chaperone
ZHANG Hai-J un1 , YANG Jun2 , 3 , LIU Xiao-Guang1 , HU Xiang-Yang2 , 3 * *
( 1 Instituteof LifeSciences, J iangsu University, Zhenjiang 212013 , China; 2 Kunming Instituteof Botany,
Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204 , China; 3 Instituteof Tibetan Plateau
Research at Kunming, ChineseAcademy of Sciences, Kunming 650204 , China)
Abstract: Co-expressing the plasmid pET32a- pfu which was constructed using In-fution technique with chaperone plasmid
HG-PGRO7 at the sametimein E. coli . BL21 (DE3) . The expression system, which expressed pfu genealone in E. coli .
BL21 (DE3) , was usedas control .Most of unnecessary proteinswereexenterated by heat treatment and (NH4 )2 S04 precipi-
tation . The purified fusion protein was obtained by the Ni chelating resin affinity chromatography . The SDS-PAGE analysis
showed that themolecular mass of the purifiedfusion proteinwas about 90 kD, conforming to the expectedmolecular mass of
Pfu protein . The results of enzyme activity assay of pfu demonstratedthat molecular chaperonewas able to activate pfu gene
expression and its enzymeactivity .
Key word : Pfu; Molecular chaperone; Clonging; Construction of a Expression Vector; Prokaryotic expression; Protein
purification; Enzyme activity assay
现今所使用的酶 ( 简称 Taq polymerase) , 是
于 1976 年从温泉中的细菌 ( Thermus aquaticus)
分离出来的。它的特性就在于能耐高温 , 是一个
很理想的酶 , 但它于 80 年代之后才被广泛运用。
该酶没有 3′至 5′外切酶活性 (Barnes, 1994) , 如
果发生脱氧核苷酸的错误掺入时 , 这种酶没有校
正能力 , 不能很好地保证扩增产物的忠实性。
Pfu DNA Polymerase简称 Pfu酶 , 是一种来源于
嗜热菌 Pyrococcus furiosus的高度热稳定的 DNA 聚合
酶。由于 Pfu酶有 3′至 5′的外切酶活性 (Takagi 等 ,
云 南 植 物 研 究 2009 , 31 (6) : 499～503
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2009.09183
?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : huxiangyang@ mail .kib. ac. cn
收稿日期 : 2009 - 09 - 14 , 2009 - 11 - 14 接受发表
作者简介 : 张海军 (1984 - ) 男 , 07 级硕士研究生 , 主要研究内容为生物防治。 ?
基金项目 : 国家自然科学基金面上项目 ( 30871704) 、中国科学院百人计划项目
1997) , 出错率为 2.6×10 - 6 per nt per cycle, 仅为
Taq酶的 1?10, 也低于一些其它的高保真 DNA 聚合
酶例如 Vent、DeepVent、Pwo、Tli 等 (Li 等 , 1998) ,
因此 Pfu酶通常作为首选的高保真 DNA 聚合酶。
原核表达是分子生物学领域的一项重要技
术 , 常出现于生物工程中 , 是指通过基因克隆技
术 , 将外源目的基因 , 通过构建表达载体并导入
表达菌株的方法 , 使其在特定原核生物或细胞内
表达。而在实际的操作中 , 包涵体形成、酶活比
较低等干扰因素 (Thomas 等 , 1997 ) , 为后续的
研究工作带来障碍。一般认为 , 导致表达蛋白形
成包涵体或酶活较低的原因常是由于表达蛋白不
能正确折叠形成正确的空间结构 ( Thomas 等 ,
1997; Check 等 , 1992 )。最近的研究表明 , 分子
伴侣不仅可以防止蛋白质在折叠过程中形成聚集
物或无活性结构 , 提高正确折叠率 , 而且还可能
影响折叠路径 ( 王会峰 , 2009) 。
本文通过分子克隆技术克隆出 Pfu 酶基因 ,
运用 In-fution 技术成功构建 pET32a- pfu 重组质
粒 , 应用分子伴侣共表达系统在 BL21 (DE3 ) 表
达菌株成功表达 pfu基因 , 并通过 Ni-NAT 亲和
层析柱纯化分离 Pfu 酶 , 并对其活性进行测定。
目的是了解共表达分子伴侣能否提高编码基因的
表达产量及表达蛋白的生物活性 , 同时也为实验
室制作实验用 Pfu酶奠定基础。这种在原核表达
中同时表达外源性活性工具酶和分子伴侣的尝
试 , 在国内还罕见报道。
1 材料与方法
1 .1 材料
菌株和质粒 : 载体 pET32a、大肠杆菌 DH5a本室保
存 , BL21 ( DE3 ) 菌 株 ( TIANGEN 公 司 ) , HG-PGRO7
(HaiGene公司)。
试剂和仪器 : Pfu DNA 聚合酶、DNA Marker、质粒抽
提试剂盒、DNAMarker、蛋白 Marker 及 CompETent Cell
Preparation Lit ( TaKaRa 公司 )。梯度 PCR 仪 ( PCYL200 ,
美国 Thermo公司 )。CloneEZTM Kit聚合酶 (美国 genscript
公司 ) ; dNTP 及限制性内切酶 EcoRI ( 美国 Promega 公
司) ; IPTG、氨苄青霉素 (amp)、氯霉素 ( ahl ) (上海生
工生物工程有限公司 ) ; 丙烯酰胺、N, N一亚甲基双丙
烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、考马斯亮蓝 G-250、DTT
(Sigma公司 ) ; Ni-NTA 亲和层析介质 (Qiagen公司 )。其
他试剂为国产分析纯。
1 .2 方法
1 .2 .1 引物设计 根据 DDBJ 公布的 Pfu DNA 聚合酶
的基因序列 , 设计引物如下 :
上游引物 : attttagatgtggattacata
下游引物 : ctaggattttttaatgttaagcca
利用高保真 KOD酶扩增出的片段与经过 EcoRI 酶切
的 pET32a构建重组载体。
1 .2 .2 基因克隆、pET32a- pfu载体构建及鉴定 PCR 扩
增条件为 : PCR 扩增条件为 95℃预变性 2 min, 95℃ 15 s、
60℃ 15 s及 72℃ 2 min, 循环 30 次 , 末次循环 72℃ 10min。
取 3μl 反应产物在 1% 琼脂糖凝胶 (含 0.05% EB 染料 )
上电泳 , 在紫外灯下观察结果。PCR 扩增产物经纯化回
收 , 再通过 In-fution的方法与经过 EcoRI 酶切的 pET32a载
体连接 , 连接产物转化至 DH5a感受态菌中 , amp抗性筛
选阳性克隆并进行 PCR 及 EcoRI 酶切鉴定。将阳性重组子
用试剂盒提取质粒 DNA , 命名为 pET32a- pfu。
1 .2 .3 共表达载体构建 将分子伴侣 HG-PGRO7 在
42℃热激 60 s 转入 BL21 ( DE3 ) 表达菌株 , 加入 900μl
LB , 37℃培养 1 h, 吸取 100μl 涂布于 ahl 平板 , 挑取阳
性克隆菌株 37℃培养过夜 , 次日以 1∶100 接种于含 ahl
的 20 ml LB 培养基中 , 当 OD600 值达到 0 .35～0 .50 时 , 用
CompETent Cell Preparation Lit试剂盒将其制成感受态 , 并
将重组质粒 pET32a- pfu进行转化 , 用含有 ahl 及 amp的
平板筛选阳性克隆。将重组质粒 pET32a- pfu直接转入
BL21 (DE3) 作为对照试验。
1 .2 .4 目的蛋白的诱导表达与 SDS-PAGE 电泳鉴定
挑选共表达菌株的阳性克隆以 1∶100 接种于含 ahl 和
amp (只转入重组质粒 pET32a- pfu只加 amp) 的 100 ml LB
培养基中 , 37℃培养至菌液浓度至 OD600 值为 0 .4～ 0 .6
时 , 用终浓度为 1 mmol L - 1 的 IPTG诱导 , 未诱导菌作对
照 , 继续培养 4 h, 离心集菌 , 用 10% SDS-PAGE 电泳观
察蛋白表达情况。
1 .2 .5 Pfu酶的纯化 将菌体悬浮于 5 ml 的 TAQA 缓
冲液与 5 ml TAQB 缓冲液中 , 冰浴中超声波破菌。上清
液在 75℃水浴保温 30 min, 12 000 r min- 1 离心 20 min去除
沉淀 , 向上清液中加入 (NH4 )2 S04 至 70% 饱和度 , 4℃
静置 2 h, 12 000 r min- 1 离心 20 min, 收集沉淀。将沉淀
溶解于 10 ml PB 缓冲液中 , Ni-NTA 亲和层析柱用 20 mmol
L
- 1 的 PB 缓冲液平衡后 , 样品以 0 .4 ml min- 1 的速度上 Ni
柱。先用 5 mmol l - 1 咪唑的 PB 缓冲液洗脱杂蛋白 , 然后
直接用含 50 mmol L - 1 咪唑的 PB 缓冲液洗脱目的蛋白 ,
然后用 TAQC 缓冲液透析过夜 , 纯化效果用 SDS-PAGE 电
泳检测 , PCR 扩增检测酶活。
1 .2 .6 Pfu 酶活的测定 以 1 μl 纯化后的 pfu 酶及
TaKaRa公司的酶 1 U 在相同条件下分别进行 PCR 扩增 ,
测定透析后的样品酶活。
005 云 南 植 物 研 究 31 卷
2 结果
2 .1 ?pfu 基因 PCR 扩增及 pET 32a- pfu 载体的
酶切鉴定
pfu基因编码序列长 2 .3 kb, 如图 1 第 1 条
带所示 ; 第 2、3 条带分别为阴性、阳性对照 ,
第 4 条为重组质粒 pET 32a- pfu的质粒 PCR; 第 5
条带为重组质粒经 EcoRI 酶切后的鉴定结果。因
pfu基因编码序列长 2 .3 kb, 在 1 kb 处有 EcoRI
酶切位点 , 所以酶切结果分别为 1 kb 和 1 .3 kb
的两条带 , 结果与分析一致。
图 1 PCR 扩增 pfu 基因 , pET 32a- pfu 质粒 PCR ,
pET 32a- pfu 酶切鉴定
M . Marker DL2000; 1 . 为 PCR 产物 ; 2 . 为阴性对照 ; 3 . 为阳性
对照 ; 4 . 为 pET32a- pfu 质粒 PCR; 5 . 为 pET32a- pfu EcoRI 酶切
Fig . 1 PCR amplification of pfu gene, The PCR products of plasmid
pET32a- pfu, the identification of enzyme digestion
test for pET32a- pfu
M . Marker DL2000; 1 . PCR product; 2 . The negotive control ;
3 . The positive control ; 4 . The PCR products of plasmid
pET32a- pfu; 5 . pET32a- pfu digested by EcoRI
2 .2 pfu在 BL21 (DE3 ) 表达菌株中的表达
重组蛋白 N 端含有 6× his 多肽标签 , 经
DNAMAN预测其分子质量约为 90 kD。SDS-PAGE
显示诱导组比未诱导组多一目的条带 , 位于蛋白
质分子质量标准 90 kD, 说明融合蛋白表达成功。
由图 2 可知当 pET32a- pfu在 BL21 (DE3) 单
独表达时 , 加 IPTG 诱导与对照比较可得目的条
带 ( 1 , 2 总蛋白 ) ; 由第 3 , 4 , 5 , 6 条带可以看
出 , 在诱导后上清与沉淀中均有表达。图 3 为分
子伴侣 HG-PGRO7 与 pET32a- pfu 在 BL21 (DE3)
原核共表达。由第 4 和 6 条带可知目的条带在上
清与沉淀均有表达。图 2 和图 3 的第 2 条带对比
可得 加 分子 伴 侣 共 表达 目 的 条带 总 产 量 比
pET32a- pfu在 BL21 (DE3 ) 单独表达量要高。图
2 和图 3 的第 4 条带比较可知在上清中共表达比
单独表达的量明显高。由第 6 条带比较可得 , 在
沉淀中显示共表达也比单独表达量要高。
图 2 pET32a- pfu 在 BL21 (DE3) 中单独表达
1 . 对照总蛋白 ; 2 . 诱导总蛋白 ; 3 . 对照上清 ; 4 . 诱导上清 ;
5 . 对照沉淀 ; 6 . 诱导沉淀 ; M . Marker
Fig . 2 The individul expression of pET32a- pfu gene in BL21 ( DE3 )
1 . The control of total protein; 2 . The induced total protein;
3 . The control of upper; 4 . The induced upper; 5 . The control
of precipitation; 6 . The induced precipitation; M . Marker
图 3 HG-PGRO7 与 pET32a- pfu在 BL21 ( DE3 ) 原核共表达
M . Marker; 1 . 对照总蛋白 ; 2 . 诱导总蛋白 ; 3 . 对照上清 ;
4 . 诱导上清 ; 5 . 对照沉淀 ; 6 . 诱导沉淀
Fig . 3 The Prokaryotic co-expression of HG-PGRO7
and pET32a- pfu in BL21 ( DE3 )
M . Marker; 1 . The control of total protein; 2 . The induced total protein;
3 . The control of upper; 4 . The induced upper; 5 . The control of
precipitation; 6 . The induced precipitation
2 .3 纯化
由图 4 与图 5 可知目的条带纯化的条带很单
一 , 说明纯化的效果很好 , 没有其他的杂蛋白的
污染。
2 .4 酶活检测
由图 6 第 4 和第 6 条带可知 , pET32a- pfu在
BL21 (DE3) 中单独表达与共表达的阳性对照纯
化后得到的 pfu 酶均有活性 , 但是与第 2 条带
(TaKaRa公司购买的酶做阳性对照 ) 对比可得第
图 4 pET32a- pfu在 BL21 ( DE3 ) 中单独表达纯化
1～9 为纯化的目的条带 ; M 为 Marker
Fig. 4 The purificated band of individual expression
of pET32a- pfu in BL21 (DE3)
1 - 9 the target purification band; M marker
1056 期 张海军等 : 应用分子伴侣共表达系统表达 pfu基因及酶活性测定
图 5 HG-PGRO7 与 pET32a- pfu BL21 ( DE3 ) 原核共表达纯化
1～9 为纯化的目的条带 ; M 为 Marker
Fig . 5 The purificated band of the Prokaryotic co-expression
of HG- PGRO7 and pET32a- pfu in BL21 ( DE3 )
1 - 9 the target purification band; M marker
图 6 Pfu 酶活测定
M . Marker; 1 . 为 TaKaRa 酶阴性对照 ; 2 . 为 TaKaRa 酶阳性对照;
3 . 为 pET32a- pfu 在 BL21 ( DE3) 中单独表达阴性对照 ;
4 . 为 pET32a- pfu 在 BL21 ( DE3) 中单独表达阳性对照 ;
5 . 为共表达阴性对照 ; 6 . 为共表达的阳性对照
Fig . 6 EnzymeActivity Assa of Pfu
M . marker; 1 . the negetive control of takara enzyme; 2 . the positive
control of takara enzyme; 3 . the negetive control of the individual
expression of pET32a- pfu in BL21 ( DE3) ; 4 . the positive control
of the individual expression of pET32a- pfu in BL21 ( DE3) ;
5 . the negetive control of the Prokaryotic co-expression;
6 . the positive control of the Prokaryotic co-expression
6 条带的亮度与第 2 条相差不大 , 但是比 4 条有
很大差异 , 说明由分子伴侣一起共表达得到的
Pfu酶活性远高于 pET32a- pfu在 BL21 (DE3) 直
接表达得到的 Pfu酶。
3 讨论
3 .1 BL21 (DE3) 表达菌存在的缺陷
BL21 (DE3) 表达菌存在的较为突出的缺陷
是被表达的外源蛋白质经常不能形成正确的空间
结构 ( Hoffmann and Rinas, 2004) 。尽管蛋白质的
折叠是一个自发过程 , 但由于蛋白过表达过程中
存在动力学屏障 , 即蛋白质翻译的速率超过了新
合成蛋白质折叠的能力 , 因此产生了部分折叠蛋
白质或折叠中间产物 ( Check 等 , 1992) 。它们有
着疏水的表面 , 易于自身结合 , 构成了包涵体形
成的基础 ( Villaverde and Carrio, 2003 )。包涵体
蛋白质虽易于纯化 , 但要进行复性才能得到正确
折叠 的 功 能 蛋 白 质 ( Kurganov and Topchieva,
1998)。复性过程一般复杂低效 ( 通常效率低于
10% ) , 且代价昂贵 , 因此开发能够直接表达正
确折叠的可溶性功能蛋白的表达系统非常有必
要。
3 .2 共表达系统改良原核表达
实际上蛋白质折叠的过程是折叠中间态的正
确途径与错误途径相互竟争的过程 ( Van den
Berg等 , 1999; 章林溪 , 2006 )。大量研究表明 ,
分子伴侣在蛋白质正确折叠实现过程中起了关键
作用 ( Zhou, 2004) 。分子伴侣主要由三个高度保
守的蛋白质家族组成 , 这三个家族的成员广泛分
布于原核和真核细胞中。分子伴侣在新生肽的折
叠和组装成蛋白过程中 , 能识别与稳定多肽链的
部分折叠的构象 , 从而参与新生肽链的折叠与装
配 ( 蒋自立 , 2007; 章林溪 , 2006) 。分子伴侣在
蛋白质折叠过程中防止多肽链形成聚集物或无活
性结构 , 提高 正确 折叠 率 ( Friedel and Shea,
2004)。
本研究 中 , 当共 表 达分 子 伴 侣时 , SDS-
PAGE 胶结果显示 , 与单独表达目的蛋白比较时
都有目的条带 , 但是从总蛋白和上清蛋白中可以
显而易见的是 , 共表达分子伴侣时目的蛋白的表
达量明显提高。从而说明分子伴侣能够促进蛋白
质的正确的折叠 , 另一个方面还降低了包涵体的
积累。但是在共表达分子伴侣与单独表达的沉淀
相比 , 共表达的沉淀还是有大量的积累 , 这说明
应用的表达系统仍需改进 , 或者是考虑应用其他
表达系统 , 或者可以尝试其他的分子伴侣或者是
增加共表达的分子伴侣的种类。
Pfu酶活测定的结果显示 , 共表达的目的蛋
白活性比单独表达的目的蛋白的活性有很大的提
高 , 可能是由于在单位目的蛋白中 , 结构正确的
可溶性蛋白比例增加。由此可以推论 , 分子伴侣
共表达体系有助于获得天然构象的有活性的蛋
白。对于某些在通常情况下 , 目的蛋白以包涵体
形式存在 , 如果需要对于这种情况加以改进 , 共
同表达分子伴侣不失为一种可供选择的方法。但
是 , 需要注意的是 , 已知分子伴侣并不总能辅助
蛋白折叠减少聚集 , 而且很难预测哪种分子伴侣
会辅助某一特定蛋白的折叠 , 因此需要尝试共表
达多种分子伴侣以提高成功表达的可能性。
3 .3 Pfu 酶活影响因素
本研究将 pfu 基因克隆到 pET32a 载体中 ,
成功表达了 N 端带有 6×His纯化标签的 DNA 聚
205 云 南 植 物 研 究 31 卷
合酶 , 首先利用热变性和 ( NH4 )2 S04 沉淀去除
大部分杂蛋白 , 然后将粗酶液用 Ni-NAT 亲和层
析柱纯化 , 得到纯度高的酶 , 并且具有很高的活
性。
Pfu酶和其他生物酶一样 , 其催化效率和速
度受诸多因素的影响。但是研究报道 His标签不
影响酶的活性 ( 景建洲等 , 2008)。其他的因素 ,
如缓冲液为聚合酶提供 PCR 过程中可能的、适
宜的反应环境 , 是 PCR 反应成败的关键之一 ,
其中 pH 和 Mg2 + 浓度又是缓冲液中两个至关重要
的因素。本实验利用 TaKaRa Pfu酶的反应条件来
进行酶活测试 , 结果可得共表达的 Pfu 酶的活
性 , 相同单位下 , 扩增的量略少于对照。说明
Pfu酶纯化以及 PCR 扩增的条件还要进一步的改
进 , 以最大限度的提高酶的活性。
总之 , 本实验成功地利用共表达载体表达了
活性相对比较高的 Pfu酶 , 与 TaKaRa公司 Pfu酶
扩增性能相当 , 可以用于实验室一般性保真性实
验与分析以节约科研成本。
〔参 考 文 献〕
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