全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第5期
收稿日期:2008-03-17
作者简介:王洪涛(1975-),男,山东菏泽人,硕士研究生,研究方向:生物催化
通讯作者:玄光善,E-mail:myqust@yahoo.com.cn
生物转化是一种高效的生产重要化学品的路
线,并能实现绿色生产。但是在化学工业中大部分
底物,如类固醇类,都是非水溶性的,它们的生物转
化率会受到水溶解度低的影响。在有机溶剂中,许
多细菌和它们的酶会被破坏和失活,这限制了生物
转化在化学工业上的应用,一个可行的解决办法是
利用耐有机溶剂的细菌作为生物催化剂[1]。有机溶
剂耐受菌是一类新的能与有害影响因素竞争并能
在有机溶剂中茁壮生长的微生物。一般来说,有机
溶剂对细菌有毒性,能破坏细胞膜,危害细胞的结
构和功能完整性[2,3],然而,有机溶剂耐受菌有不同
的适应性如溶剂输出泵、快速修复膜、降低膜透性、
增加膜严密度和降低细胞表面疏水性等能使细菌
设法避开有害因素。细菌特别是假单胞菌属和大肠
杆菌属的有机溶剂耐受性机理已被广泛研究[4~8]。
Neumann等[9]研究表明降解酚的耐有机溶剂菌株
PseudomonasputidaP8和 Enterobactersp.能通过增
大细胞尺寸来适应有害的有机化合物。郑晓冬等[10]
对 10株酵母进行了有机溶剂耐受试验,结果发现
酵母对有机溶剂的抗性不仅与溶剂的极性、毒性和
剂量范围有关,而且与酵母细胞膜的成分、生长培
养基、温度等有关。
近年来,对酶在有机介质中催化作用的研究已
有大量报道,而对有机溶剂耐受菌在有机介质中作
为生物催化剂的研究却不多。
1 有机溶剂对细菌的毒性机理
有机溶剂的作用基本位点是细胞膜,细菌的细
胞膜是一层包含多种酶和转运蛋白的基质。这层膜
在溶质转移、维持细胞能量状态、信号转运和能量
转换过程中发挥重要作用。有机溶剂能破坏脂双
层,并危害细胞[3]。试验证明对细胞产生毒性的因
素是有机溶剂在细胞膜内积累的浓度,而不是溶剂
的化学结构 [11]。对微生物的生理研究揭示了溶剂毒
性和它的 logP值有关联,参数 logP是指给定的溶
有机溶剂耐受菌的研究进展
王洪涛 王孝平 玄光善
(青岛科技大学化工学院,青岛 266042)
摘 要: 有机溶剂耐受菌是一类新的能与有害影响因素竞争并能在有机溶剂中茁壮生长的微生物。介绍了有机溶
剂对细菌的毒性机理,有机溶剂耐受菌的获得方法,讨论了有机溶剂耐受菌的两种反应形式,并对有机溶剂耐受菌的应
用进行了展望。
关键词: 有机溶剂 生物催化剂 耐受菌 研究进展
ResearchonOrganicSolventTolerantBacteria
WangHongtao WangXiaoping XuanGuangshan
(DepartmentofChemicalEngineeringofQingdaoUniversityofScienceandTechnology,Qingdao266042)
Abstract: Organicsolventtolerantbacteriaareanovelgroupofmicroorganismsthatcanbeabletocombatwith
destructiveefectsandthriveinpresenceoforganicsolvents.Inthisarticle,themechanismsoftoxicityoforganicsolvents
whichcanharm thestructuralandfunctionalintegrityofcels,werediscused.Curently,organicsolventtolerantbacteria
canbegainedbymethodssuchasscreeningandgenecloning.Methodsofreactionandapplicationsofbacteriawerealso
reviewed.Finaly,prospectsoftheapplicationsoftheorganicsolventtolerantbacteriawerediscused.
Keywords: OrganicsolventBiocatalystTolerantbacteria Advances
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
剂在等摩尔辛醇和水中的分配系数。极性越大,
logP值就越小,溶剂毒性也越大。一般认为,logP值
在 1~4之间的溶剂毒性极大,即在水层(细胞存在
于水层)的分配比例就高,亦即从那里进入细胞膜
脂双层的溶剂就多。亲脂溶剂(logP>4)也能在膜外
积累较高的浓度,但由于它们的水溶解度低而不会
达到很高的膜浓度,所以不会对微生物有害。而
logP值在 1~4的有机溶剂易溶于水,易于进入膜,
那么这些溶剂的膜浓度就会很高,这对细胞非常有
害[4]。
每种微生物有其内在的对有机溶剂的耐受度,
这是由基因决定的并受环境因素的影响,有机溶剂
耐受性是一种细菌特性[12]。每种微生物的耐受水平
用指数值来表示,指数值是微生物所能耐受的所有
有机溶剂中最有害的一种溶剂的 logP值。如 Pseud
omonas菌株的指数值是 2.5(甲苯的 logP值),E.
coli的 xylenetolerant突变株的指数值是 3。Sardessai
等[13]从红树林生态系中分离到一株 Bacilus(SB1)
能够耐受丁醇(logP=0.8),这是已经报道的耐受程
度最大菌。
2 有机溶剂耐受菌的获得
通常采用微生物菌种的分离和基因克隆等方
法获得有机溶剂耐受菌。目前从受污染的土壤和海
洋沉积物中已分离得到多种有机溶剂耐受菌。
Gupta等[14,15]利用环己烷富集培养基,从土壤样品
中分离得到 2株耐有 机溶剂菌株 Pseudomonas
aeruginosa和 Enterobacteraerogenes,这 2个菌株都
能在多种有机溶剂中维持和生长,其中 Enterobacter
aerogenes还能在汞存在时生长,可以被用来处理富
含有机溶剂的废水。Faizal等[16]把活性污泥样本加
入到以甲苯作为惟一碳源的矿物盐类基本培养基
上富集培养,从中分离得到了 Pseudomonasputida
T-57菌株。PseudomonasputidaT-57可以利用丁醇、
甲苯、苯乙烯、二甲苯、乙苯、己烷和丙苯作为生长
底物。这个菌株能够在甲苯和矿物盐类培养基的配
比在 10%~90%的范围内生长,并能忍受 logP高于
2.5的有机溶剂。因此,T-57可以被认为在有机溶
剂中转化水不溶性底物的很好的菌株。Kyung-su等[17]
也分离得到了耐苯菌株 RhodococcusopacusB-4。
Fang等[18]从中国江苏的海水中分离得到了一株新
型的耐有机溶剂菌株 Staphylococcussaprophyticus
M36,能够产生高酶活脂肪酶。
由于从环境中分离既耐有机溶剂又具有高催
化酶活性的菌株比较困难,研究者们开始考虑利用
基因克隆技术来获得所需要的目的菌株。Fei等[19]
通过把从 RhodococcuserythropolisXP得到的基因
dszABCD引入到耐有机溶剂菌株 P.putidaIdaho中
而构建得到耐有机溶 剂脱硫菌株 Pseudomonas
putidaA4。P.putidaA4在许多有机溶剂中能够保持
脱硫活性,是一种很有前途的高效生物脱硫技术。
Ogino等[20]利用基因克隆技术,把有机溶剂耐受菌
株 PseudomonasaeruginosaLST-03的 脂 解 酶 基 因
(lip8)在大肠杆菌中表达,Lip8脂肪酶具有很高的
酯解活性,能够酯解具有短链脂肪酸的甲基脂肪酸
酯。Nick等[21]利用分子克隆技术从 Pantoeaagglome
rans中获得 tpl基因,然后把它转入到有机溶剂耐
受菌株 PseudomonasputidaS12中,该基因可表达酪
氨酸苯酚裂解酶,能够使菌株 Pseudomonasputida
S12利用葡萄糖生产苯酚,在培养基中加入辛醇,
可使 苯酚积累达到 58mM。Mar1a-IsabelRamos-
Gonzalez等[22]也利用基因工程技术获得了一株耐有
机溶剂菌 Pseudomonasputida能够把甲苯转化为羟
苯酸盐。
3 有机溶剂耐受菌的反应形式
有机溶剂耐受菌的催化反应一般可采用游离
化和固定化 2种反应形式。若直接用游离细胞作为
催化剂,产物的分离提取比较繁琐,难以实现催化
剂的重复使用。细胞经固定化以后,能够提高细胞
催化剂的稳定性,降低产物提取的难度,并能实现
催化剂的重复利用[23]。不同固定化细胞制备方法对
反应的传质、细胞的活性和反应的特性有影响。固
定化方法种类很多,制备时应考虑如下因素:可以
控制固定化细胞的大小和孔隙度;固定化细胞具有
良好的稳定性;用于固定化细胞的载体应为惰性[24]。
詹喜等[25]利用固定化 Bakers酵母细胞在有机溶剂
中催化香叶醇转化为香茅醇,结果表明,以正己烷
作为有机溶剂,其生物相容性明显好于乙酸丁酯,
更加有利于该生物转化反应进行,乙二醇作为能量
物质,该反应转化率较高。
4 有机溶剂耐受菌的应用
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2008年第5期
4.1 在工业生产中的应用
在有机相催化中,酶和完整细胞都可以作为生
物催化剂,而利用完整细胞作为生物催化剂具有更
多的优点:可以催化未知目标酶的反应、增加催化
剂对有机溶剂的适应性、在还原生物转化中简化辅
酶因子的再生过程等[25]。在有机溶剂中利用酶作为
催化剂已经实现了工业化,但到目前为止,还未见
有机溶剂耐受菌工业化方面的报道,但这并不影响
有机溶剂耐受菌在非水生物催化和有机相中的转
化两方面所具有的巨大潜力。有机溶剂耐受菌可以
在有机溶剂饱和系统中进行所需要的生物转化。如
类固醇的转化在医药工业中非常重要,在这个过程
中主要限制因素是类固醇在水溶液中的溶解度非
常低。由于大部分类固醇和其产物的溶解度极低
(10-2~10-3g/L),这既降低转化率又会增加生产成
本。Sardessai等[26]从阿拉伯海底沉积物中分离得到
一株 Bacilussp.BC1能够降解胆固醇,并对有机溶
剂特别是氯仿有很高的耐受性。一些有机溶剂耐受
菌 也 能 够 在 双 相 系 统 中 转 化 胆 固 醇 ,如
Pseudomonassp.ST-200菌株在有机混合溶剂(二甲
苯﹕苄苯=3﹕7v/v)中,通过把羟基或酮基引入到胆
固醇的 C3和 C6位上而高效氧化胆固醇[27]。在苯、
甲苯、二甲苯或丙基苯存在时,其胆固醇的消耗速
率是没有有机溶剂时的 3~3.5倍[28]。当癸烷(C10H22)
和十二烷作为有机相时,ArthrobacterST-1表现出
很高的胆固醇降解比例[29]。Devi等[30]利用从海洋中
得到的菌株 Moraxelasp.(MP1)能把桔霉素转化为
半胱胺。桔霉素是一种对动物有毒的抗生素,而半
胱胺对动物是安全的,而同时又具有与桔霉素相似
的活性。所有这些都为有机溶剂耐受菌的工业化应
用打下了基础。
4.2 有机溶剂耐受菌在环保中的作用
苯和甲苯等的污染具有持久性,现在还缺乏能
有效降解这些化合物的方法。尽管许多芳香烃降解
菌株被分离,但它们通常对有机溶剂敏感,对芳香
烃的降解也只有在化合物浓度较低时可行[3]。在这
种情况下,对能在有机溶剂中生长的微生物的分离
就变得非常重要,因为这样的微生物能被用来消除
低分子量芳香烃,而这些芳香烃即使是 ppm级的
量也具有强致癌性。由于许多污染地点被有机溶剂
如苯、甲苯等所饱和,所以有必要开发能分解代谢
这些芳香烃的有机溶剂耐受菌。如:从悉尼一处污
染源分离得到的 Rhodococcussp.33菌株能降解浓
度为 200ppm的苯,还可以忍受高浓度的苯[31]。这个
菌株还能在 NaCl浓度为 6%和温度变化从 0℃~
37℃范围内能生长,如果这菌株被用来处理海面油
污,将具有很好的应用前景。Lim等[32]分离得到了
一株耐有机溶剂菌株恶臭假单胞菌 GM73,能够用
来处理被有机溶剂污染的环境。
5 有机溶剂耐受性菌应用前景
工业生物转化正引起生物技术的革命性变化,
主要是因为生物催化剂具有高选择性和高效率;造
成的污染也远低于化学催化剂所造成的污染。在有
机相的生物转化中,由于有机溶剂耐受菌表现出很
高的灵活性而变得非常有吸引力。耐有机溶剂的酶
在工业上已开始应用,如脂肪酶有机相催化在食品
工业中的应用[33];但到目前为止,还未见有机溶剂
耐受菌实现工业化的相关报道。这可能有 2个方面
的原因:(1)还没有获得高转化率的有机溶剂耐受
菌;(2)有机溶剂耐受菌的反应条件需要优化。作者
认为可以利用基因工程方法获得有机溶剂耐受菌
株,这些菌株不但能耐受有机溶剂,而且有很高的
转化率。由于现代分子生物学和基因克隆技术的发
展,很有希望能构建出这样的菌株。
虽然目前关于有机溶剂耐受菌的很多研究还
处于实验室阶段,但由于其在工业生产和环境保护
方面具有无法比拟的优势,将会吸引更多的研究者
投入更多精力进行研究,相信不久的将来,有机溶
剂耐受菌将会有光明的应用前景。
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