全 文 ：第6卷第2期
2008年3月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Mar．2008
·43·
盾叶薯蓣悬浮培养细胞生长及薯蓣皂苷
袁丽红，周海霞，于 潇，欧阳平凯
(南京工业大学 制药与生命科学学院，南京210009)
；；△／L口成
摘要：研究了盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中细胞生长、薯蓣皂苷元合成、蔗糖和磷酸盐的吸收利用以及酸性磷酸
酶活性与薯蓣皂苷元合成的关系。结果表明，对数生长期细胞最大比生长速率肛。为0．19d一；倍增时间为3．68d；
薯蓣皂苷元的形成与细胞的生长相关，培养6d时薯蓣皂苷元质量分数和产量分别为0．20％和25．93ms／L；蔗糖
利用率达到95．65％，磷酸盐吸收率达到最大，为90．36％。盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中酸性磷酸酶活性动态变
化规律与薯蓣皂苷元的动态合成规律基本一致。此外，研究还发现在相同供磷水平下，酸性磷酸酶活性高低与薯
蓣皂苷元合成能力呈正相关；而在不同供磷水平下，酸性磷酸酶活性高低与薯蓣皂苷元合成能力没有相关性。
关键词：盾叶薯蓣；悬浮培养；细胞生长；薯蓣皂苷元合成；酸性磷酸酶
中图分类号：Q943．1 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)02—0043—05
Diosgeninbiosynthesisinsuspensionculturesof
Dioscoreazingiberensisc lls
YUANLi-hong，ZHOUHai-xia，YUXiao，OUYANGPing—kai
(CollegeofLifeScienceandPharmaceuticalEnsineefing，N趴jingUniversityofTechnology，Nanjing210009，China)
Abstract：Growth，diosgeninbiosynthesis，theconsumotionfsucroseandinorganicphosphateinthme—
dium，aswellastherelationshipofac dhosphatasectivityandiosgeninbiosynthesisinD．zingiberen-
siscellsuspensionculturesw restudied．Theresultsshowthatthemaximalspecificgrowthratewas0．19
d～anddoubletimewas3．68dinthexponentialphase．Theint nsityofdiosgeninbiosynthesiswacor-
relatedocellgrowth．Onthe6thdayofcultivation，thecon enta dyieldofdiosgeninreachedthemaxi-
mallevel，constituting0．20％and25．93ms／L，95．65％ofsucrosewasdepletedanthemaximalab—
sorptionofphosphate(90．36％)arrived．Duringtheincubationperiod，thedynamicchangeofacid
phosphatasectivityxhibitedasimilartrendwiththatofdiosgeninbiosynthesis．Furthermore，therewag
apositivecorrelationbetweenacidphosphatasectivityandthecapabilityofdiosgeninsynthesisunderthe
samephosphatelev l；however，noneco relationexistedb tweenthemunderdifferentphosphatelevels．
Keywords-+Dto$coreazingib rensis；suspensionculture；cellgr wth；diosgeninbiosynthesis；acidphosphatase
盾叶薯蓣(DioscoreazingiberensisC．H．Wright)
为薯蓣科薯蓣属植物，从其根状茎提取的薯蓣皂苷
元(Diosgenin)是合成甾体激素类药物的重要原
料⋯，提取的皂苷素是生产盾叶冠心宁、地奥一L,fflt
康等治疗心血管疾病药物的重要原料‘21。薯蓣人
工栽培生长周期，一般为3—5a，且易受环境、季节、
收稿日期：2007-04-10
基金项目：国家自然科学基金资助项目(20276030)
作者简介：袁丽红(1965一)，女，教授，吉林白城人，研究方向：植物细胞工程与微生物。
联系人：欧阳平凯。教授，博士生导师，E·mail：ouyangpk@njut．edu．cn
万方数据
·44· 生物加工过程 第6卷第2期
虫害等因素影响∞J，同时还面临品种退化、产量降
低等问题【4J。利用植物组织和细胞培养技术解决
薯蓣皂苷元资源问题成为当前研究热点。
美国Kaul和Staba首先开展三角叶薯蓣(D．del-
toidea)组织培养研究工作，从未分化的愈伤组织培养
物中分离检测出薯蓣皂苷元，含量为培养物干质量的
1．5％[5】。盾叶薯蓣是我国特有薯蓣种，单株薯蓣皂
苷元含量在薯蓣科植物中最高瞪】。成都生物所和江
苏植物所较早开展盾叶薯蓣组织培养研究，愈伤组织
中薯蓣皂苷元质量分数为0．5％左右”剖。毕世荣
等【_列利用细胞克隆技术获得了淡黄色、质地较疏松、
生长快的盾叶薯蓣优良细胞株，并筛选出18株高含
量薯蓣皂苷元的克隆细胞系。李文谦等旧1研究了不
同NAA与6-BA浓度配比对盾叶薯蓣愈伤组织生长
的影响，并用Logistic方程描述了细胞生长特征。任
建伟等旧1以盾叶薯蓣愈伤组织为接种物，研究了悬浮
培养细胞生长及薯蓣皂苷元合成的动态变化，发现薯
蓣皂苷元合成与生长关系属于延迟型。
多数研究认为甾体皂苷元生物合成是由甲羟
戊酸途径而得到的¨01。由鲨烯合成甾体皂苷配基
的具体合成途径和催化酶类目前尚少见报道。在
甲羟戊酸代谢途径中许多中间产物和关键酶
(HMG—CoA还原酶)发生磷酸化和去磷酸化反应，
HMG—CoA还原酶磷酸化活性低，去磷酸化活性高。
酸性磷酸酶(acidphosphatase，ACP)是生物体内磷
酸酯代谢的重要酶类，催化磷酸化的中间产物和磷
酸化酶去磷酸化¨1J，同时它还参与细胞间物质转
运、能量转运以及信号转导等重要生命活动u2|。
目前，盾叶薯蓣细胞培养研究多集中在愈伤组
织培养方面，对悬浮细胞培养和薯蓣皂苷元合成的
研究较少。本文在已建立的盾叶薯蓣悬浮细胞体
系基础上，研究细胞生长与薯蓣皂苷元合成和积累
规律，以及培养过程中酸性磷酸酶酶活变化与薯蓣
皂苷元合成的关系，为利用盾叶薯蓣细胞大规模培
养生产薯蓣皂苷元奠定基础。
1实验材料和方法
1．1 盾叶薯蓣悬浮细胞继代培养
将2倍体积新鲜MS培养基(其中附加NAA2
mg／L，BA0．2mg／L，蔗糖30g／L，灭菌前调pH5．8)
加入到盾叶薯蓣悬浮细胞培养物中，混匀后分装于
250mL三角瓶，每瓶50mL。于(26±O．5)℃黑暗下
振荡培养，转速120r／rain，每12d继代一次。
1．2盾叶薯蓣悬浮细胞培养
将种龄10d的细胞接种于新鲜的MS培养基
中，附加成分、pH同上。接种量体积比1．8／5。培
条件同上，每2d取样测定。
1．3细胞生长测定
收获细胞培养物，量出总体积，抽滤，滤液供蔗
糖、果糖和磷酸盐等分析用，细胞用蒸馏水洗涤3
次，称鲜细胞质量。称取0．50g鲜细胞于60℃烘箱
中烘干至恒重，称质量并计算出干细胞含量。生物
量以每升培养物中干细胞质量表示(g／L)。实验重
复3次。
1．4蔗糖、果糖和磷酸盐测定
蔗糖、果糖测定参照文献[13]方法。磷酸盐测
定参照文献[14]方法。实验重复3次。
1．5盾叶薯蓣细胞培养物薯蓣皂苷元水解提取和
RP．HPLC定量分析
薯蓣皂苷元水解提取方法参照文献[15一16]并
加以改进。称取10．00g鲜细胞置平底烧瓶内，加
入30mL、1．5mol·L“H2S04—70％异丙醇溶液，
沸水浴回流提取8h，冷却、抽滤，滤液中加入等体积
蒸馏水后用等体积正己烷萃取3次，合并，用1％
NaOH溶液洗至无色，再用蒸馏水洗至中性。于50
℃减压蒸干并用无水乙醇洗出，再蒸干，用甲醇溶
解并定容至5mL，供RP．HPLC分析用。ALLTECH
PlusChromatographyHPLC仪(美国ALLTECH公
司)，KromasilC一18色谱柱(250mm×4．6mm，5
¨m)，流动相纯甲醇，流速1mL·min～，紫外检测
器，检测波长208nm，薯蓣皂苷元标准品购自Sig-
ma公司。薯蓣皂苷元产量以薯蓣皂苷元占干细胞
质量的百分数和每升培养物积累的薯蓣皂苷元的
量(mg·L。1)表示。实验重复3次。
1．6酸性磷酸酶提取和酶活性测定
称取1．0g鲜细胞，加入5mL、0．05mol·L。1
Tris—HCl缓冲液(含2mol·L～EDTA，pH7．5)和
少许石英砂，研磨，4℃离心15min，转速8000r／
min，上清液即为酶液。酸性磷酸酶活性的测定及酶
活定义参照文献[14]。实验重复3次。
2结果与讨论
2．1 盾叶薯蓣悬浮培养细胞生长和薯蓣皂苷元
合成与积累
盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中细胞生长和糖
万方数据
2008年3月 袁丽红等：盾叶薯蓣悬浮培养细胞生长及薯蓣皂苷元合成 ·45·
及磷酸盐吸收与利用情况见图l。
，
■
●
警
嘲
霉
划
璺
再
≮
●
●
●
芒
窭
镁
X
100
80 3
60零
加要
20冬
0
O
土
皂
g
摹
X
t／d t／d
(a)细胞生长； (b)糖吸收利用； (c)磷酸盐吸收利用
图1盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中细胞生长和营养吸收利用
Fig．1Growthandnutrientup akeofD．zingiberensissuspensioncellcultures
10d培养过程中细胞生长曲线呈S形。0～2
d为延迟期，此时细胞迅速地将培养基中蔗糖分解
为葡萄糖和果糖，磷酸盐也被细胞迅速地吸收，2d
时约79％磷酸盐被吸收；2—6d为对数生长期，
蔗糖已被大量水解，6d时蔗糖利用率达到
95．65％，对磷酸盐吸收速度减慢，培养6d磷酸盐
吸收率达到最大，为90．36％。对数期细胞大量吸
收培养基中还原糖等营养物质而迅速增殖，生长
速度最快，最大比生长速率肛。为0．19d一，倍增时
间为3．68d；6—8d为减速期，细胞生长速度开始
减慢，培养8d细胞生物量达到最大，为15．63g／L，
培养基中残留蔗糖很低，蔗糖利用率接近100％。
8d后培养基中可利用的还原糖含量很低，细胞生
长基本停止，生物量开始缓慢下降。同时发现6d
后基质中磷酸盐浓度提高，这可能是由于细胞进
入到培养后期，部分细胞死亡而使胞内磷酸盐释
放到胞外。
图2反映了盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中薯蓣
皂苷元合成和积累情况。培养初期(0～2d)细胞培
图2盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中薯
蓣皂苷元合成与积累特征
Fig．2Biosynthesisandaccumulationofd sgeninin
D．zingiberensisc Hsuspension—cultured
三
X
誊
养物中薯蓣皂苷元含量虽然有所下降，但其产量
(以每升培养物中甙元的积累量表示)有所提高，说
明在细胞培养初期薯蓣皂苷元即开始合成，但合成
速度较慢；2d后甙元迅速合成，6d时甙元含量和
产量达到最高，分别为0．20％和25．93mg／L；6d后
甙元含量和产量开始下降，说明甙元合成停止并且
开始降解。
比较盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中细胞生长
和产物合成与积累特征，发现薯蓣皂苷元含量和积
累量随细胞生物量增加而提高，在对数生长期甙元
大量合成，但也发现甙元形成高峰时间要略早于细
胞生物量积累高峰时间。尽管如此，基本可以认为
薯蓣皂苷元的形成与细胞的生长相关。这一研究
结果与Deliu等¨71对高加索薯蓣(D．caucasica)细
胞生长与薯蓣皂苷元合成的关系的报道相似，但与
任建伟等报道的盾叶薯蓣细胞薯蓣皂苷元的合成
与细胞生长的关系属延迟型结果相反一J，也与国外
有关三角叶薯蓣研究结果相反¨引。从利用细胞培
养技术生产薯蓣皂苷元产业化角度上看，我们建立
的盾叶薯蓣悬浮细胞系只要采取适当措施提高培
养细胞生物量即可合成和积累较高产物。另外，该
细胞悬浮系培养周期短，培养6～8d即可收获
细胞。
2．2酸性磷酸酶活性与薯蓣皂苷元合成关系
以甲羟戊酸为前体生物合成途径中许多中间
产物和关键酶发生磷酸化和去磷酸化。酸性磷酸
酶是催化磷酸化的中间产物去磷酸化重要酶类¨1I，
为此研究了盾叶薯蓣悬浮细胞培养过程中，酸性磷
酸酶活性与甙元合成的关系，结果见图3。
细胞培养0～2d时，酸性磷酸酶活性略有下
降，甙元含量也下降；2—6d时酶活迅速增加，甙元
万方数据
·46· 生物加工过程 第6卷第2期
曼
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图3 细胞悬浮培养过程中酸性磷酸酶活性
与薯蓣皂苷元含量的变化
Fig．3ACPactivit)randiosgenincontenti
nzingiberensiscellsuspension-cultureceUs
含量亦显著增加，6d时酶活性最高，甙元含量也最
高；6d后酶活性下降，甙元含量下降。可见，盾叶
薯蓣细胞培养过程中酸性磷酸酶活性动态变化规
律基本能够反映出薯蓣皂苷元合成的变化规律，因
此可以将细胞培养过程中酸性磷酸酶活性变化作
为甙元合成能力高低的指标。
在植物细胞培养中酸性磷酸酶活性受无机磷
酸盐的调控，磷酸盐水平高低也影响次生代谢产物
合成¨1|，用于植物细胞培养的磷酸盐浓度一般在
0．05～3．00mmol／L之间。实验研究了不同初始供
磷水平对盾叶薯蓣悬浮细胞酸性磷酸酶活性和薯
蓣皂苷元合成与积累的影响。结果发现，培养基中
供磷水平对培养细胞酸性磷酸酶活性和薯蓣皂苷
元合成与积累具有一定影响(图4、表1)。在初始
磷酸盐浓度为0时，酸性磷酸酶活性显著高于供磷
下酶的活性，但细胞生长缓慢，生物量低，薯蓣皂苷
元合成与积累能力也较低，说明缺磷激活了酸性磷
酸酶，但被激活的酶主要作用是将细胞内有机磷分
解成无机磷用于维持细胞活性或参与一些重要的
基本代谢。可见，盾叶薯蓣细胞对缺磷能够表现出
一定的适应机制，并且培养基中缺磷影响了酸性磷
酸酶在次生代谢中的作用。在供磷情况下，细胞生
物量和薯蓣皂苷元合成与积累较无磷情况均有明
显提高，并且随着磷酸盐浓度的增大，细胞生物量
和薯蓣皂苷元合成与积累能力亦提高，但两种水平
磷酸盐对培养细胞酸性磷酸酶活性影响的略有不
同，较高浓度磷酸盐对酶活性表现出一定抑制作
用。这一结果与Panda等¨u对Holarrhenaantidys．
enterica的研究结果相类似。可见，在不同供磷水平
下培养细胞所表现出的酸性磷酸酶活性的差异与
薯蓣皂苷元的合成能力的高低没有相关性，若通过
改变供磷水平提高培养细胞酸性磷酸酶活性并不
能相应地提高薯蓣皂苷元的合成能力。
图4不同磷酸盐水平对酸性磷酸酶活性的影响
Fig．4EffectofdifferentphosphatelevelsonACPactivity
表1磷酸盐浓度对盾叶薯蓣悬浮细胞培养10d
时细胞生长和薯蓣皂苷元合成的影响
Table1 EffectofphosphatelevelsOilcellgrowthand
diosgeninbiosynthesisofD．zingiberensiscell
suspensioncuhuresafter10daysofcultivation
盾叶薯蓣悬浮培养的细胞酸性磷酸酶活性除
了受供磷水平调节外，也随培养基中初始硫酸镁和
硫酸亚铁浓度的变化而变化(表2、表3)。在起始
磷酸盐水平相同条件下，改变培养基中初始硫酸镁
浓度或硫酸亚铁浓度，发现培养细胞酸性磷酸酶活
性和薯蓣皂苷元含量不同，并且酸性磷酸酶活性高
低与薯蓣皂苷元合成能力呈正相关。
3 结论
盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中细胞生长周期
可分为延迟期、对数生长期、减速期和稳定期。培
养2—6d时细胞生长最快，最大比生长速率肛。为
0．19d～，倍增时间为3．68d，此时蔗糖利用率达
95．65％，磷酸盐吸收率达到最大，为90．36％，薯蓣
皂苷元含量和产量达到最高。比较盾叶薯蓣细胞
万方数据
2008年3月 袁丽红等：盾叶薯蓣悬浮培养细胞生长及薯蓣皂苷元合成 ·47·
悬浮培养过程中细胞生长和产物合成与积累特征，
发现薯蓣皂苷元含量和产量随细胞生物量增加而
提高，因此，认为薯蓣皂苷元的形成与细胞的生长
相关。
表2硫酸镁对酸性磷酸酶活性和薯蓣皂苷元合成的影响
Table2 Effectof heinitialmagnesiumulphateconcentrationonACPactivityandiosgeninbiosynthesis
表3硫酸亚铁对酸性磷酸酶活性和薯蓣皂苷元合成的影响
Table3 Effectof heinitialferrouss lfateconcentrationOilACPactivityandiosgeninsynthesis
。(FeSO。)／ 堕鲞鱼璺： 堕鲞!!!
cmmd．h酶活／cV．mg-1，以雩剥／ 嚆零婴学／ 以雩劫／
0．00 9．61 0．12 7．33 0．09
0．10 19．47 0．22 17．2l 0．19
0．15 21．26 0．24 19．07 0．21
0．20 8．46 0．10 7．05 0．06
盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中酸性磷酸酶活
性变化规律基本能够反映出薯蓣皂苷元合成规律，
因此可以将细胞培养过程中酸性磷酸酶活性变化
作为甙元合成能力高低的指标。在相同供磷水平
下，酸性磷酸酶活性高低与薯蓣皂苷元合成能力呈
正相关。而在不同供磷水平下，培养细胞所表现出
的酸性磷酸酶活性的差异与薯蓣皂苷元的合成能
力的高低没有相关性，若通过改变供磷水平提高培
养细胞酸性磷酸酶活性并不能相应地提高薯蓣皂
苷元的合成能力。
参考文献：
[1]封玉贤，周振起．我国薯蓣皂甙元的工业生产和资源回顾与展
望[J]．天然产物研究与开发，1994，6(1)：93-97．
[2]袁绍杰，梁艳丽，赵庆云，等．盾叶薯蓣的研究进展[J】．西南
农业学报，2004，17(s1)：355．358．
[3]徐向丽．薯蓣植物组织培养研究进展[J]．湖南林业科技，
2000，27(1)：5-9．
[4]晏婴才，林宏辉，代其林，等．盾叶薯蓣组织培养与快速繁殖研
究[J]．四川大学学报：自然科学版，2002，39(1)：136—140．
[5]丁志遵，唐世蓉，秦慧贞，等．甾体激素药源植物[M]．北京：
科学出版社．1983．
[6]四川生物研究所一室体细胞组．盾叶薯蓣组织培养研究初报
[J]．植物学报，1978，20(3)：279-280．
【7]毕世荣，张忠福，苏成端．高含量薯蓣皂素植株的细胞克隆
[J]．天然产物研究与开发，1997，9(4)：1-6．
[8]李文谦，袁丽红，顾永明，等．盾叶薯蓣细胞生长特征的研究
[J]．南京工业大学学报，2004，26(5)：12一16．
[9]任建伟，白云，郭秋月．盾叶薯蓣培养细胞的生长及薯蓣皂
苷元产生的变化规律[J]，中草药，1994。25(2)：93-94．
[10]丁曼．次生代谢作用[M]．曹日强，译．北京：科学出版社，
1983，136．
[11]PandaAK，MishraS。BisariaVS．Alkaloidpro uctionbyplantcell
suspensionculturesofHo／arrhenaant／dysemenkaLEffectofmajorBU—
trimats[J]．Biotechnology＆Bioengineering，1992，39：1043．1051．
[12]SackerJA．Senescenceandpostharvestphysidogy[J]．Plant
Physiol，1973(24)：197-224．
[13]上海植物生理学会．植物生理学实验手册[K]．上海：科学技
术出版社。1985：136-137．
[14]宋克敏，焦新之，李琳磷酸饥饿时番茄幼苗酸性磷酸酶活性的
变化与Pi吸收的关系[J]．云南植物研究，1999，21(1)：101．108．
[15]袁丽红，邵辉，顾永明，等．盾叶薯蓣薯蓣皂苷元水解原位提
取研究EJ]．高校化学工程学报，2007，21(3)：538342．
[16]顾永明，袁丽红，李文谦，等．RP-HPLC法测定盾叶薯蓣细胞
中薯蓣皂苷元的含量[J]．天然产物研究与开发，2004，
16(4)：331-333．
[ 7]DeliuC，TamasM，DobrotaC，eta1．Kineticsofcellulargrowth
anddiosgeninbiosynthesisinDioscorea∞Ⅱc∞f∞cellsusp nsion
culturesinbatchsystem[J]．PlantSei，1992(85)：99．105．
[18]TalB，GoldbergI．GrowthandiosgeninproductionbyDioscorea
deltoideacellsinbatchandcontinuouscultures[J]．PlantaMed，
1982(44)：107—109．
万方数据