全 文 ：　 Ｇｕｉｈａｉａ　 Ｍａｙ ２０１６ꎬ ３６(５):５８２－５８８
ｈｔｔｐ: / / ｊｏｕｒｎａｌ.ｇｘｚｗ.ｇｘｉｂ.ｃｎ
ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍ
ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１４１２０３５
唐明ꎬ汪超ꎬ谭韵雅ꎬ等. 不同种类无机盐对灰毡毛忍冬“渝蕾 １号”悬浮培养体系中细胞生长和绿原酸含量的影响 [Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(５):
５８２－５８８
ＴＡＮＧ ＭꎬＷＡＮＧ ＣꎬＴＡＮ ＹＹꎬｅｔ ａｌ. Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓａｌｔ ｏｎ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｃｅｌｌ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ
ｏｆ Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓ Ｈａｎｄ.￣Ｍａｚｚ. “Ｙｕｌｅｉ １”[Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６(５):５８２－５８８
不同种类无机盐对灰毡毛忍冬“渝蕾 １号”
悬浮培养体系中细胞生长和绿原酸含量的影响
唐　 明ꎬ 汪　 超ꎬ 谭韵雅ꎬ 李　 群∗
( 四川师范大学 生命科学学院ꎬ 成都 ６１０１０１ )
摘　 要: 为提高灰毡毛忍冬“渝蕾 １号”悬浮培养体系中绿原酸的含量ꎬ该研究探讨了 Ｂ５培养基中不同浓度的
无机盐对灰毡毛忍冬“渝蕾 １号”悬浮培养细胞生物量及绿原酸含量的影响ꎬ通过在悬浮培养体系中添加不同
浓度的无机盐ꎬ采用重量法测定灰毡毛忍冬“渝蕾 １号”悬浮培养细胞的生物量及采用高效液相色谱法测定绿
原酸的含量ꎮ 结果表明:当硝态氮和铵态氮配比与 Ｂ５培养基中硝态氮和铵态氮配比一致时ꎬ即 ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋摩
尔比值为 １３ ∶ １时ꎬ培养体系有利于细胞的生长和绿原酸的积累ꎮ 当 ＫＮＯ３浓度为 ３.５ ｇ􀅰Ｌ
￣１时ꎬ细胞生物量
达到最大ꎬ为 １９.２６ ｇ􀅰Ｌ￣１ꎻ当 ＫＮＯ３在较低浓度(０.５ ｇ􀅰Ｌ
￣１和 １.５ ｇ􀅰Ｌ￣１)时ꎬ积累较多的绿原酸ꎮ ＮＯ３
－的两项
研究结果均与对照浓度(２.５ｇ􀅰Ｌ￣１)有一定的差异ꎮ 另外ꎬ对 (ＮＨ４) ２ＳＯ４来说ꎬ在高于对照浓度 ０.１３４ ｇ􀅰Ｌ
￣１ꎬ
即浓度为 ０.２６８ ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ生物量和绿原酸含量都达到了最大ꎮ Ｐ、Ｃａ、Ｍｇ 三种矿质元素的研究结果表明ꎬ当
ＮａＨ２ＰＯ４􀅰２Ｈ２Ｏ浓度为 ０.１０ ｇ􀅰Ｌ
￣１、ＣａＣｌ２的浓度为 ０.２０ ｇ􀅰Ｌ
￣１时ꎬ细胞的生长和绿原酸的积累均可达到最大
值ꎻ而对 Ｍｇ２＋来说ꎬ低浓度促进细胞的生长ꎬ高浓度促进绿原酸的积累ꎮ 兼顾细胞生物量和绿原酸含量两个指
标ꎬ需选择适中的浓度ꎮ 这些结果均与对照浓度有一定的差异ꎮ 这说明灰毡毛忍冬“渝蕾 １号”悬浮细胞所需
无机盐的浓度与 Ｂ５培养基无机盐的浓度有一定的差异ꎬ选择适宜的浓度可促进其悬浮细胞的生长及次生代
谢产物绿原酸的积累ꎮ 该研究结果为绿原酸的工业化生产打下了基础ꎮ
关键词: 灰毡毛忍冬“渝蕾 １号”ꎬ 悬浮培养ꎬ 绿原酸ꎬ 高效液相色谱ꎬ 无机盐
中图分类号: Ｑ９４３.１　 　 文献标识码: Ａ　 　 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０５￣０５８２￣０７
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓａｌｔ ｏｎ ｔｈｅ
ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｃｅｌｌ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ
ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓ Ｈａｎｄ.￣Ｍａｚｚ. “Ｙｕｌｅｉ １”
ＴＡＮＧ Ｍｉｎｇꎬ ＷＡＮＧ Ｃｈａｏꎬ ＴＡＮ Ｙｕｎ￣Ｙａꎬ ＬＩ Ｑｕｎ∗
( Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１０１０１ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓ
Ｈａｎｄ.￣Ｍａｚｚ. “Ｙｕｌｅｉ １”ꎬ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓａｌｔ ｈａｄ ｍａｎｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏ￣
ｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｃｅｌｌ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｌ. ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓ Ｈａｎｄ.￣Ｍａｚｚ. “Ｙｕｌｅｉ １”. Ｗｅ ｗｅｉｇｈｅｄ ｔｈｅ
收稿日期: ２０１４￣１２￣２３　 　 修回日期: ２０１５￣０１￣１５
基金项目: 四川省教育厅成果培育项目(１２ＺＺ００９) [ Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ
(１２ＺＺ００９)]ꎮ
作者简介: 唐明(１９８８￣ )ꎬ男ꎬ甘肃人ꎬ在读硕士研究生ꎬ主要从事细胞生物学研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)１３２６６６５４５３＠ ｑｑ.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 李群ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ研究生导师ꎬ主要从事植物细胞工程方面的研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)Ｌｉｑｕｎ０１２３４＠ １６３.ｃｏｍꎮ
ｂｉｏｍａｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌ. ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓ Ｈａｎｄ.￣Ｍａｚｚ. “Ｙｕｌｅｉ １” ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｃｈｌｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ＨＰＬＣ
ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓａｌｔ ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｌ. ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓ Ｈａｎｄ.￣
Ｍａｚｚ. “Ｙｕｌｅｉ １”. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋ ｒａｔｉｏ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋(ｎｉｔｒａｔｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ /
ａｍｍｏｎｉｕｍ ｎｉｔｒｏｇｅｎ) ｒａｔｉｏ ｉｎ Ｂ５ｍｅｄｉｕｍ. Ｉｎ ｏｔｈｅｒ ｗｏｒｄｓꎬ ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｂｅｎｅｆｉｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗｈｅｎ ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋(ｎｉｔｒａｔｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ / ａｍｍｏｎｉｕｍ ｎｉｔｒｏｇｅｎ) ｒａｔｉｏ ｗａｓ １３ ∶ １. Ｗｈｅｎ
ｓｉｎｇｌｅ Ｎ ｓｏｕｒｃｅ ｗａｓ ａｄｄｅｄꎬ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｓｓ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ (１９.２６ ｇ􀅰Ｌ￣１) ｉｎ ３.５ ｇ􀅰Ｌ￣１ＫＮＯ３ . Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ
ｗｈｅｎ ＫＮＯ３ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ａｔ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｌｏｗ ｌｅｖｅｌｓ (０.５ ａｎｄ １.５ ｇ􀅰Ｌ
￣１)ꎬ ｈｉｇｈ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ａｃｃｕ￣
ｍｕｌａｔｅｄ. Ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ＮＯ３
－ ｈａｄ ｓｏｍｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ (２.５ ｇ􀅰Ｌ￣１). Ｗｈａｔ’ｓ ｍｏｒｅꎬ ｗｈｉｌｅ
(ＮＨ４) ２ＳＯ４ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ (０.２６８ ｇ􀅰Ｌ
￣１) ｅｘｃｅｅｄｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ (０.１３４ ｇ􀅰Ｌ￣１)ꎬ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｂｉｏ￣
ｍａｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌ. ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓ Ｈａｎｄ.￣Ｍａｚｚ. “Ｙｕｌｅｉ １” ａｎｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ. Ｉｎ ｔｈｅ
ｓａｍｅ ｗａｙꎬ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐꎬ Ｃａ ａｎｄ Ｍｇ ｍｉｇｈｔ ｈａｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｍｐａｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ
ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｃｅｌｌ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄꎬ ｗｈｅｎ ＮａＨ２ＰＯ４􀅰２Ｈ２Ｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ０.１０ ｇ􀅰Ｌ
￣１ . Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ
ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄꎬ ｗｈｅｎ ＣａＣｌ２ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ０.２０ ｇ􀅰
Ｌ￣１ . Ｓｏ ｆａｒ ａｓ Ｍｇ２＋ ｗａｓ ｃｏｎｃｅｒｎｅｄꎬ ａ ｌｏｗ ＭｇＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｃｅｌｌꎬ ｗｈｉｌｅ ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ
ＭｇＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗｏｕｌｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ. Ｔａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｓｓ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏ￣
ｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｇ ｗａｓ ｍｏｄｅｒａｔｅ. Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｈａｄ ｓｏｍｅ ｄｉｆｆｅｒ￣
ｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｏｕｒ ｓｔｕｄｙ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓａｌｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｈａｄ ｓｏｍｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓａｌｔ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ５ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｌ. ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓ Ｈａｎｄ.￣Ｍａｚｚ. “Ｙｕｌｅｉ １”. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐ￣
ｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｃｏｕｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｂｉｏｍａｓｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｄｅｒａｔｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓａｌｔ ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｌ. ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓ Ｈａｎｄ.￣Ｍａｚｚ. “Ｙｕｌｅｉ １”. Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｌａｙｓ
ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｌ. ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓ
Ｈａｎｄ.￣Ｍａｚｚ. “Ｙｕｌｅｉ １”. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｌｓｏ ｈａｓ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｔｏ ｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓ Ｈａｎｄ. ￣Ｍａｚｚ. “Ｙｕｌｅｉ １”ꎬ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅꎬ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄꎬ ＨＰＬＣꎬ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓａｌｔ
　 　 金银花(Ｆｌｏｓ Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａｅ) 为忍冬科植物
忍冬的花蕾以及它们初开的花(徐晓兰等ꎬ２０１３)ꎮ
金银花为中医临床使用的传统中药材ꎬ药用历史悠
久(倪付勇等ꎬ ２０１５)ꎮ 灰毡毛忍冬 “渝蕾 １ 号”
(Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓ Ｈａｎｄ.￣Ｍａｚｚ.‘Ｙｕｌｅｉ １’)是以
灰毡毛忍冬为砧木嫁接而成ꎬ经重庆市有关专家审
定的重庆首个药用植物新品种(黄昌银ꎬ２００９)ꎮ 同
时ꎬ该品种具有高产量、高品质、整个花期不开花等
优点(姜法强ꎬ２０１３)ꎬ同时ꎬ该品种的主要次生代谢
产物绿原酸含量较高ꎮ 因此ꎬ自从该品种被发现以
来ꎬ得到了重庆市政府的足够重视ꎮ 众所周知ꎬ绿原
酸具有清除自由基、抗菌(王世宽等ꎬ２０１０)等多种
功能ꎬ且绿原酸在医药和食品方面也有着广泛的应
用( Ｉｌａｉｙａｒａｊａ ｅｔ ａｌꎬ ２０１５ꎻ 马烽等ꎬ２０１０ꎻ王利等ꎬ
２００９)ꎬ加之我国目前对于绿原酸的开发利用水平
远低于发达国家(邓良等ꎬ２００５)ꎬ因此绿原酸供需
缺口会持续相当长的时间ꎮ
工业化生产中ꎬ要获得大量植物次生代谢产物ꎬ
植物细胞培养技术是继微生物发展技术之后的重要
发展领域(李冬杰等ꎬ２００３)ꎮ 本研究希望通过细胞
悬浮培养的方法ꎬ优化培养条件以获得灰毡毛忍冬
“渝蕾 １ 号”的主要次生代谢产物绿原酸ꎮ 在优化
培养条件过程中ꎬ大多研究均是报道优化培养过程
中的基础条件如 ｐＨ、接种量、糖的种类或浓度、培养
中激素组合等(Ｎａｇｅｌｌａ ｅｔ ａｌꎬ２０１０ꎻ李蕤等ꎬ２０１１)ꎬ
也有不少的文章研究培养基的成分对代谢产物的影
响ꎮ 对灰毡毛忍冬“渝蕾 １ 号”来说ꎬ基础条件方面
的优化已经研究过ꎬ本研究旨在前期研究的基础上ꎬ
进一步研究培养基成分ꎬ探究培养基中无机盐成分
对灰毡毛忍冬“渝蕾 １ 号”悬浮培养体系中细胞生
长和绿原酸积累的影响ꎬ为进一步提高绿原酸的含
量提供相关的理论依据ꎮ 由于灰毡毛忍冬“渝蕾 １
号”为新品种ꎬ以上研究没有相关报道ꎮ
１　 材料与方法
１.１ 材料
采自原产地重庆秀山县苗圃园ꎬ经宜宾学院魏
３８５５期　 　 唐明等: 不同种类无机盐对灰毡毛忍冬“渝蕾 １号”悬浮培养体系中细胞生长和绿原酸含量的影响
琴教授鉴定为灰毡毛忍冬 “渝蕾 １ 号” ( Ｌｏｎｉｃｅｒａ
ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓ Ｈａｎｄ.￣Ｍａｚｚ. ‘Ｙｕｌｅｉ １’)ꎮ
１.２　 方法
１.２.１ 悬浮培养体系的建立　 取灰毡毛忍冬“渝蕾 １
号”的幼嫩叶片为外植体ꎬ先将外植体用自来水连
续冲洗 １ ｈ 后ꎬ移至超净工作台ꎬ然后将外植体用
７５％酒精浸泡 ３０ ｓꎬ无菌水冲洗 ２ 次ꎬ再用 ０.１％升
汞溶液浸泡 ４ ｍｉｎꎬ无菌水清洗 ４ 次ꎬ最后放置超净
工作台上备用ꎮ 接下来将材料用自来水连续接种到
添加有 ２.０ ｍｇ􀅰Ｌ￣１６￣ＢＡ 和 ０.５ ｍｇ􀅰Ｌ￣１ＮＡＡꎬｐＨ 为
５.８的 Ｂ５ 培养基中ꎬ２５ ℃条件下自然光照培养ꎮ １
月左右ꎬ将诱导出的愈伤组织进行多次继代培养ꎬ培
养基及培养条件同初代培养ꎬ直至愈伤组织比较松
散ꎮ 选取松散的愈伤组织作为悬浮培养的起始材
料ꎮ 经过几次悬浮培养后ꎬ建立了合适的悬浮培养
体系ꎮ 在培养体系中ꎬ准确称取 ２.００ ｇ 悬浮培养细
胞ꎬ接种于 ４０ ｍＬ Ｂ５培养基中ꎬ最后转移至(２５ ±
１)℃ꎬ１６ ｈ光周期ꎬ１１０ ｒ􀅰ｍｉｎ￣１摇床中震荡培养ꎮ
１.２.２ Ｂ５培养基中主要矿质元素对“渝蕾 １ 号”悬浮
培养体系中细胞生长和绿原酸含量的影响　 首先考
察不同 ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋摩尔比值对细胞生长和绿原酸
含量的影响ꎮ 设计如下:保持总 Ｎ量不变(２７ ｍｍｏｌ􀅰
Ｌ￣１)ꎬ在去除无机氮源的 Ｂ５ ＋２.０ ｍｇ􀅰Ｌ￣１６￣ＢＡ＋０.５
ｍｇ􀅰Ｌ￣１ ＮＡＡ 的悬浮培养体系中添加不同 ＮＯ３
－ /
ＮＨ４
＋摩尔比值(１４ ∶ ０、１３ ∶ １、１０ ∶ ４、５ ∶ ９、０ ∶ １４)ꎬ
其中 １３ ∶ １为 Ｂ５培养基中的 ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋摩尔比值ꎬ
也为本实验的对照ꎮ 在 ２.１ 建立的悬浮培养体系中
培养 ２５ ｄ 后ꎬ检测其生物量和绿原酸的含量ꎮ 其
次ꎬ考察单一添加 ＮＯ３
－或 ＮＨ４
＋氮源对细胞生长和
绿原酸含量的影响ꎮ 设计如下:分别各自在去除无
机氮源的 Ｂ５＋２.０ ｍｇ􀅰Ｌ￣１６￣ＢＡ＋０.５ ｍｇ􀅰Ｌ￣１ＮＡＡ 的
悬浮培养基中添加不同浓度的(ＮＨ４) ２ＳＯ４(０.０３３ ５
ｇ􀅰Ｌ￣１ꎬ０.０６７ ｇ􀅰Ｌ￣１ꎬ０.１３４ ｇ􀅰Ｌ￣１ꎬ０.２６８ ｇ􀅰Ｌ￣１和
０.５３６ ｇ􀅰Ｌ￣１)和 ＫＮＯ３(０.５ ｇ􀅰Ｌ￣１ꎬ１.５ ｇ􀅰Ｌ￣１ꎬ２.５ ｇ􀅰
Ｌ￣１ꎬ５.０ ｇ􀅰Ｌ￣１和 ８. ０ ｇ􀅰Ｌ￣１ )ꎬ其中 ０. １３４ ｇ􀅰Ｌ￣１
(ＮＨ４) ２ＳＯ４与 ２.５ ｇ􀅰Ｌ￣１ ＫＮＯ３为 Ｂ５培养基中各自的
浓度ꎬ为本实验的对照ꎬ在 ２.１ 建立的悬浮培养体系
中培养 ２５ ｄ后检测其生物量和绿原酸的含量ꎮ
１. ２. ３ Ｈ２ ＰＯ４
－、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋ 　 分别在去除 Ｈ２ ＰＯ４
－、
Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋的 Ｂ５＋２.０ ｍｇ􀅰Ｌ￣１６￣ＢＡ＋０.５ ｍｇ􀅰Ｌ￣１ＮＡＡ
的悬浮培养基中添加不同浓度的 ＮａＨ２ＰＯ４􀅰２Ｈ２Ｏ
(０.０５ ｇ􀅰Ｌ￣１ꎬ０.１０ ｇ􀅰Ｌ￣１ꎬ０.１５ ｇ􀅰Ｌ￣１ꎬ０.２０ ｇ􀅰Ｌ￣１和
０.２５ ｇ􀅰Ｌ￣１)、ＣａＣｌ２(０.０５ ｇ􀅰Ｌ￣１ꎬ０.１０ ｇ􀅰Ｌ￣１ꎬ０.１５ ｇ􀅰
Ｌ￣１ꎬ０.２０ ｇ􀅰Ｌ￣１和 ０. ２５ ｇ􀅰Ｌ￣１)和 ＭｇＳＯ４ 􀅰７Ｈ２ Ｏ
(０.０５ ｇ􀅰Ｌ￣１ꎬ０.１５ ｇ􀅰Ｌ￣１ꎬ０.２５ ｇ􀅰Ｌ￣１ꎬ０.３５ ｇ􀅰Ｌ￣１和
０.５０ ｇ􀅰Ｌ￣１)ꎬ值得指出的是ꎬ本实验是以 Ｂ５培养基
中各自的浓度为对照(即 ０. １５ ｇ􀅰Ｌ￣１ ＮａＨ２ ＰＯ４ 􀅰
２Ｈ２Ｏ、０.１５ ｇ􀅰Ｌ￣１ ＣａＣｌ２以及 ０.２５ ｇ􀅰Ｌ￣１ＭｇＳＯ４􀅰
７Ｈ２Ｏ)ꎬ再分别在 ２.１ 建立的悬浮培养体系中培养
２５ ｄ后检测其生物量和绿原酸的含量ꎮ
１.３ 生物量测定和绿原酸提取
２５ ｄ后将收获的鲜重细胞于 ５０ ℃烘箱中烘干
至恒重ꎬ称重并计算其生物量ꎮ 将烘干的愈伤细胞
粉碎过 ６０目筛ꎬ精密称取其中 ０.１０ ｇ于 １０ ｍＬ ６０％
的甲醇试管中并称重ꎬ放入超声波清洗仪中超声萃
取 ３０ ｍｉｎꎬ再用 ６０％的甲醇补足其重量ꎬ取其上清液
用于 ＨＰＬＣ检测绿原酸的含量ꎮ
１.４ ＨＰＬＣ检测
ＨＰＬＣ检测:Ａｌｌｔｅｃｈ Ｃ１８ 色谱柱(４.６ ｍｍ × １５０
ｍｍ)ꎻ流动相甲醇 ∶ 醋酸水 ＝ ２２ ∶ ７８(ｐＨ ＝ ２.６)ꎻ检
测波长 ３２８ ｎｍꎻ柱温 ３５ ℃ꎻ流速 １ ｍＬ􀅰ｍｉｎ￣１ꎻ进样
量 １０ μＬꎮ
１.５ 数据分析
以上试验 ３ 次平行ꎬ２ 次重复ꎬ采用 ＳＰＳＳ １７.０
统计软件对所得试验数据进行单因素方差 Ｄｕｎｃａｎ
分析(Ｐ≤０.０５)
２　 结果与分析
２.１ “渝蕾 １号”愈伤组织和悬浮培养体系的建立
图 １:ａ为成功诱导的愈伤组织ꎬ从图 １:ａ 可以
看出ꎬ愈伤组织呈翠绿淡黄色ꎬ其长势旺盛ꎬ比较松
散ꎬ适宜作为悬浮的材料ꎮ 图 １:ｂ 为在添加有 ２.０
ｍｇ􀅰Ｌ￣１６￣ＢＡ和 ０.５ ｍｇ􀅰Ｌ￣１ＮＡＡ 的 Ｂ５培养基中建
立的悬浮体系ꎬ从图 １:ｂ可以看出细胞呈淡黄色ꎬ且
生长旺盛ꎮ
２.２ ＨＰＬＣ条件的建立
图 ２表示 ＨＰＬＣ 检测所获得的色谱图ꎬ图 ２:ａ
为样品色谱图ꎻ图 ２:ｂ 为绿原酸标品色谱图ꎮ 从图
２:ｂ可看出ꎬ主峰保留时间为 ６.２９ ｍｉｎꎬ标记为 ＣＡꎮ
通过比较ꎬ图 ２:ａ和图 ２:ｂ主峰出峰时间是一致的ꎬ
表明样品中的主峰即为 ＣＡ绿原酸ꎮ 根据以上标准
曲线ꎬ即可计算出样品中绿原酸的含量ꎮ Ｗｕ(２００７)
曾报道过用高效液相色谱对杜仲悬浮体系中绿原酸
含量定性以及定量ꎬ 测得的保留时间为 １３.９７ ｍｉｎꎬ
４８５ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
图 １　 “渝雷 １号”愈伤组织与悬浮培养体系　 ａ. 诱导出的愈伤组织ꎻ ｂ. 建立的悬浮培养体系ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｌｌｕｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ “Ｙｕｌｅｉ １”　 ａ. Ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｌｌｕｓꎻ ｂ. Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ.
图 ２　 绿原酸 ＨＰＬＣ 分析　 ａ. 样品 ＨＰＬＣ 色谱分析图ꎻ ｂ.
绿原酸标准品 ＨＰＬＣ色谱分析图ꎮ
Ｆｉｇ. ２　 ＨＰＬＣ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ　 ａ. Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａ￣
ｔｉｖｅ ＨＰＬＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｌｏｎｉｃｅｒａ
ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓ Ｈａｎｄ.￣Ｍａｚｚ. “ Ｙｕｌｅｉ１ ” ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅꎻ ｂ.
Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ＨＰＬＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｓｔａｎｄａｒｄ.
这与我们的结果不太一致ꎬ可能是植物材料、不同的
流动相和色谱柱长度不一致有关ꎮ
２.３ ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋对“渝蕾 １号”悬浮培养体系中细胞
的生长和绿原酸含量的影响
从图 ３可以看出ꎬ对生物量来说ꎬ当 ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋
低于 １３ ∶ １时ꎬ细胞生物量呈现出逐渐递增的趋势ꎬ
且各梯度之间差异性显著ꎻ当 ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋为 １３ ∶ １
(对照)时ꎬ其细胞生物量达到最大值ꎬ为 １７.９３ ｇ􀅰
Ｌ￣１ꎻ而当 ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋高于 １３ ∶ １ 时ꎬ细胞生物量呈
现出逐渐递减的趋势ꎬ差异性同样显著ꎮ 这表明
ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋的比值为 １３ ∶ １ 时最适合悬浮细胞生
长ꎬ这也正是 Ｂ５培养基中 ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋的比值ꎮ 对于
绿原酸含量来说ꎬ总体看来ꎬ随着 ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋比值
的增加ꎬ绿原酸含量逐渐增加ꎮ 当 ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋达到
１４ ∶ ０ 时ꎬ绿原酸的含量达最大ꎬ为 １３.５１ ｍｇ􀅰ｇ￣１
ＤＷꎮ 当比值超过 １０ ∶ ４以后ꎬ绿原酸含量增加较为
明显ꎬ保持了较高的绿原酸含量ꎮ 综合细胞生物量
和绿原酸含量两个指标ꎬ得出 ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋为 １３ ∶ １
时有利于积累ꎬ这和 Ｂ５培养基中的含量是一致的ꎮ
图 ３　 不同 ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋比值对细胞生物量和绿原酸含
量的影响 　 数据以平均值 ± 标准误来表示ꎬＤＷ. 细胞生物
量ꎻ ＣＡ. 绿原酸含量ꎮ 下同ꎮ
Ｆｉｇ. ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋ ｒａｔｉｏｓ ｏｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏ￣
ｍａｓｓ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ
ｃｕｌｔｕｒｅｓ　 Ｄａｔａ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｍｅａｎｓ ± ＳＥꎬ ＤＷ. Ｂｉｏｍａｓｓ ａｃｃｕｍｕｌａ￣
ｔｉｏｎꎻ ＣＡ. Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
２.４ ＮＯ３
－对“渝蕾 １号”悬浮体系中细胞生长和绿原
酸含量的影响
由图 ４可知ꎬ当 ＫＮＯ３浓度在 １.５~５.０ ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ
细胞生物量都维持了较高的生长量ꎬ且差异不显著ꎮ
当 ＫＮＯ３浓度在 ３.５ ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ细胞生物量达到最大
值ꎬ为 １９. ２６ ｇ􀅰Ｌ￣１ꎮ 对于绿原酸的含量来说ꎬ在
ＫＮＯ３较低浓度(０.５ ｇ􀅰Ｌ￣１和 １.５ ｇ􀅰Ｌ￣１)时ꎬ维持了
５８５５期　 　 唐明等: 不同种类无机盐对灰毡毛忍冬“渝蕾 １号”悬浮培养体系中细胞生长和绿原酸含量的影响
较高的绿原酸含量ꎬ且当 ＫＮＯ３浓度在 １.５ ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ
绿原酸的含量达到最大值(１８.４８ ｍｇ􀅰ｇ￣１ＤＷ)ꎻ当
ＫＮＯ３浓度高于 １.５ ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ绿原酸的含量呈现出
随着 ＫＮＯ３浓度的增加而减少的趋势ꎬ但各梯度之
间差异性不显著ꎮ 可以得出ꎬ稍高于对照组浓度
(２.５ ｇ􀅰Ｌ￣１)的 ＮＯ３
－浓度有利于细胞的生长ꎬ稍低
于对照组浓度的 ＮＯ３
－浓度有利于绿原酸的合成ꎮ
图 ４　 不同浓度的 ＫＮＯ３对细胞生物量
和绿原酸含量的影响
Ｆｉｇ. ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＫＮＯ３
ｏｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ
２.５ 单一无机氮源 ＮＨ４
＋对“渝蕾 １ 号”悬浮体系中
细胞生长和绿原酸含量的影响
由图 ５可知ꎬ随着 (ＮＨ４) ２ ＳＯ４浓度的增加ꎬ生
物量逐渐增加ꎬ当其浓度达到 ０.２６８ ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ细胞
生物量达最大值(１０.１８ ｇ􀅰Ｌ￣１)ꎬ浓度进一步增加
时ꎬ生物量略有减少ꎬ但各浓度梯度间差异不大ꎮ 对
于绿原酸的含量来说ꎬ当(ＮＨ４) ２ＳＯ４浓度低于 ０.１３４
ｇ􀅰Ｌ￣１(对照)时ꎬ绿原酸含量呈现出逐级递减的趋
势ꎬ各浓度间差异显著ꎻ但当(ＮＨ４) ２ ＳＯ４浓度高于
０.１３４ ｇ􀅰Ｌ￣１(对照)时ꎬ绿原酸含量呈现出逐级递增
的趋势ꎬ各浓度间差异亦显著ꎮ 当(ＮＨ４) ２ＳＯ４浓度
在 ０.２６８ ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ绿原酸含量达到最大值ꎬ为 ９.１７
ｍｇ􀅰ｇ￣１ＤＷꎮ
２.６ Ｈ２ＰＯ４
－对“渝蕾 １ 号”悬浮体系中细胞生长和
绿原酸含量的影响
由图 ６可知ꎬ当 ＮａＨ２ＰＯ４􀅰２Ｈ２Ｏ浓度小于 ０.１０
ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ细胞生物量随 ＮａＨ２ＰＯ４􀅰２Ｈ２Ｏ 浓度的增
加而增加ꎬ且各浓度间差异显著ꎮ 当 ＮａＨ２ ＰＯ４ 􀅰
２Ｈ２Ｏ浓度为 ０.１０ ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ细胞生物量达到最大
图 ５　 不同浓度的 (ＮＨ４) ２ＳＯ４对细胞生物量
和绿原酸含量的影响
Ｆｉｇ. ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ (ＮＨ４) ２ＳＯ４
ｏｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ
图 ６　 不同浓度的 ＮａＨ２ＰＯ４􀅰２Ｈ２Ｏ对
细胞生物量和绿原酸含量的影响
Ｆｉｇ. ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＮａＨ２ＰＯ４􀅰２Ｈ２Ｏ
ｏｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｍａｓｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ
值ꎬ为 ８.９０ ｇ􀅰Ｌ￣１ꎮ 当 ＮａＨ２ＰＯ４􀅰２Ｈ２Ｏ 浓度大于
０.１０ ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ细胞生物量随 ＮａＨ２ＰＯ４􀅰２Ｈ２Ｏ 浓度
的增加而减少ꎬ各浓度间差异不大ꎮ 对于绿原酸的
含量来说ꎬ当 ＮａＨ２ＰＯ４􀅰２Ｈ２Ｏ浓度小于 ０.１０ ｇ􀅰Ｌ￣１
时ꎬ绿原酸含量同样随 ＮａＨ２ＰＯ４􀅰２Ｈ２Ｏ 浓度的增
加而增加ꎬ各浓度间差异显著ꎻ当 ＮａＨ２ＰＯ４􀅰２Ｈ２Ｏ
浓度为 ０. １０ ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ绿原酸含量达最大值ꎬ为
１５.１６ ｍｇ􀅰ｇ￣１ＤＷꎻ当 ＮａＨ２ＰＯ４􀅰２Ｈ２Ｏ 浓度为 ０.１５
ｇ􀅰Ｌ￣１(对照)时ꎬ绿原酸的含量也较大ꎬ并和 ０.１０ ｇ􀅰
Ｌ￣１之间没有显著差异ꎮ 可以得出ꎬ当 ＮａＨ２ ＰＯ４􀅰
２Ｈ２Ｏ浓度为 ０.１０ ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ生物量和绿原酸的积累
６８５ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
均可达到最大值ꎬ是最适的浓度ꎮ
２.７ Ｃａ２＋对“渝蕾 １号”悬浮体系中细胞生长和绿原
酸含量的影响
由图 ７可知ꎬ对于生物量来说ꎬ当浓度低于 ０.１０
ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ细胞生物量随 ＣａＣｌ２浓度的增加而增加ꎬ
且差异显著ꎻ当 ＣａＣｌ２浓度为 ０.１０ ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ细胞生
物量达到最大值(８.０８ ｇ􀅰Ｌ￣１)ꎻ当浓度高于 ０.１０ ｇ􀅰
Ｌ￣１时ꎬ细胞生物量随 ＣａＣｌ２浓度的增加而减少ꎬ除
ＣａＣｌ２浓度在 ０.１０~ ０.２５ ｇ􀅰Ｌ￣１之间差异不显著外ꎬ
其他各浓度间差异均显著ꎮ 对于绿原酸的含量ꎬ当
ＣａＣｌ２浓度为 ０.０５、０.１０ 和 ０.２５ ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ绿原酸含
量差异不大ꎮ 当 ＣａＣｌ２浓度为 ０.２０ ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ绿原酸
含量达到最大值(１１.４６ ｍｇ􀅰ｇ￣１ＤＷ)ꎬ与其它各浓度
均保持显著差异ꎮ 因此ꎬＣａＣｌ２浓度并非在对照浓度
即 ０.１５ ｇ􀅰Ｌ￣１时生物量和绿原酸含量最高ꎬ而是稍
有偏离ꎮ
图 ７　 不同浓度的 ＣａＣｌ２对细胞生物量
和绿原酸含量的影响
Ｆｉｇ. ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣａＣｌ２
ｏｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ
２.８ Ｍｇ２＋对“渝蕾 １号”悬浮体系中细胞生长和绿原
酸含量的影响
由图 ８ 可知ꎬ生物量和绿原酸的含量趋向于相
反的走势ꎬ对于生物量来说ꎬ随着 ＭｇＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ 浓
度的增加ꎬ生物量逐渐较少ꎬ且各梯度间差异基本不
大ꎬ且在 ＭｇＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ 浓度为 ０.０５ ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ达到
最大值(７.２８ ｇ􀅰Ｌ￣１)ꎻ而对于绿原酸的含量ꎬ随着
ＭｇＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ的增加ꎬ绿原酸含量亦在增加ꎬ各浓
度梯度间差异还是较为显著ꎬ且在 ＭｇＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ浓
度为 ０. ５０ ｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬ达到最大值 ( １５. ９２ ｍｇ􀅰ｇ￣１
ＤＷ)ꎮ 特别值得一提的是ꎬ在本研究中ꎬ对 Ｍｇ２＋来
说ꎬ低浓度促进生物量的积累ꎬ高浓度促进绿原酸的
合成ꎮ 兼顾细胞生物量和绿原酸含量ꎬ只能选择适
中的浓度ꎬ即与对照组(０.２５ ｇ􀅰Ｌ￣１)相差不大的浓
度较为合适ꎮ
图 ８　 不同浓度的 ＭｇＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ对细胞
生物量和绿原酸含量的影响
Ｆｉｇ. ８　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＭｇＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ
ｏｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ
ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ
３　 讨论
植物细胞培养中常用培养基成分区别主要在于
无机盐的种类和含量ꎬ而培养基成分又与植物细胞
生长和次生代谢产物的形成有密切的关系ꎬ因此ꎬ在
选择培养基时ꎬ既要考虑培养基的种类ꎬ更要注重无
机盐的种类及含量ꎬ尤其是总氮水平、氮源种类及比
例ꎬ还有 Ｋ、Ｐ、Ｃａ、Ｍｇ等大量元素的含量等(李玉平
等ꎬ２０１０)ꎮ 本研究从无机总氮水平、无机氮源种类
及比例、Ｐ、Ｃａ、Ｍｇ 浓度等方面ꎬ探究其对灰毡毛忍
冬“渝蕾 １ 号”悬浮培养体系中生物量和绿原酸含
量的影响ꎬ旨在优化培养条件ꎬ为工业化生产其次生
代谢产物———绿原酸打下基础ꎮ 实验结果表明ꎬ在
总氮源方面ꎬ保持总 Ｎ 量 ２７ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１不变ꎬＮＯ３
－ /
ＮＨ４
＋摩尔比值为 Ｂ５培养基中 ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋摩尔比值
１３ ∶ １(即对照)时ꎬ即 ＮＯ３
－远多余 ＮＨ４
＋ꎬ细胞的生
物量和绿原酸含量都比较高ꎬ原因可能如李莉等
(２００６)研究一样ꎮ 李莉等(２００６)研究表明ꎬ当过量
的氨存在以及在较高 ｐＨ 条件下ꎬ苯丙氨酸解氨酶
(ＰＡＬ)能逆向催化代谢ꎬ不利于植物绿原酸代谢体
系的进行ꎬ这或许就是较低浓度的 ＮＨ４
＋比较适合目
７８５５期　 　 唐明等: 不同种类无机盐对灰毡毛忍冬“渝蕾 １号”悬浮培养体系中细胞生长和绿原酸含量的影响
标产物绿原酸合成的原因ꎮ 高日等(２０１１)研究发
现ꎬ在 ＭＳ 培养基中硝态氮比铵态氮更有益于人参
细胞皂苷的合成ꎬ这与本研究结果基本一致ꎮ Ｙｉｎ ｅｔ
ａｌ(２０１３)发现ꎬ保持 ６０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１总无机氮源不变ꎬ
当 ＮＯ３
－ / ＮＨ４
＋为 ２ ∶ １ 时ꎬ有利于柳钱属植物细胞
的生长和三萜类化合物的积累ꎬ这与本研究结果稍
有差异ꎬ可能与物种有关ꎮ 单一氮源的研究中ꎬ对硝
态氮来说ꎬＮＯ３
－浓度稍高于对照组(２.５ ｇ􀅰Ｌ￣１)时有
利于细胞的生长ꎬ稍低于对照组时有利于绿原酸的
合成ꎮ 对铵态氮来说ꎬ当(ＮＨ４) ２ＳＯ４浓度高于 ０.１３４
ｇ􀅰Ｌ￣１(对照)时ꎬ绿原酸含量呈现出逐级递增的趋
势ꎮ 可见单一氮源和复合氮源之间的结果差异较
大ꎮ 对于 Ｐ、Ｃａ、Ｍｇ离子浓度的选择ꎬ本研究表明均
应考虑适中浓度(即 ０.１ ｇ􀅰Ｌ￣１ＮａＨ２ ＰＯ４􀅰２Ｈ２Ｏ、
０.２０ ｇ􀅰Ｌ￣１ ＣａＣｌ２与 ０.２５ ｇ􀅰Ｌ￣１ＭｇＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ)ꎮ 李
玉平等(２０１０)报道ꎬ适中浓度的 Ｈ２ＰＯ４
－(５ ｍｍｏｌ􀅰
Ｌ￣１)有利于大花金挖耳细胞生长和黄酮的合成ꎻＹｉｎ
ｅｔ ａｌ(２０１３)也报道ꎬ适中浓度的 ＫＨ２ＰＯ４(１.２５ ｍｍｏｌ
􀅰Ｌ￣１)、ＣａＣｌ２(２ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１)均有利于柳钱属植物细
胞的生长和三萜类化合物的积累ꎬ这与本研究结果
一致ꎮ 但也有不同的研究结果ꎬ如 Ｒｅｍｙａ ｅｔ ａｌ
(２０１３)研究表明ꎬ在地钱细胞悬浮培养产黄酮的体
系中ꎬ加入不同浓度的 Ｃａ或 Ｍｇ 都不能使细胞生物
量和黄酮产量有显著变化ꎮ 另外ꎬ高永超等(２００３)
在大量元素对牛角藓愈伤组织悬浮细胞的研究中指
出ꎬ大量元素明显促进细胞的生长发育ꎬ大量元素浓
度越高ꎬ促进作用越明显ꎮ 以上结果表明不同植物
对于 Ｃａ或 Ｍｇ的吸收有差异ꎬ从而造成次生代谢产
物积累有所不同ꎮ 总之ꎬ植物在生长发育过程中ꎬ无
机盐是必不可少的一大营养成分ꎬ对于不同的植物
材料ꎬ需要进行具体的研究ꎬ得到的结果也千差万
别ꎮ 本研究对灰毡毛忍冬“渝蕾 １ 号”悬浮培养体
系中的主要无机元素进行了探索ꎬ旨在获得更高产
量的绿原酸ꎬ为绿原酸的生产化打下基础ꎮ
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(下转第 ６１８页 Ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｏｎ ｐａｇｅ ６１８ )
８８５ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷