全 文 ：第 35 卷第 2 期
2015年 1月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.2
Jan.,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(CAFRIFEEP201102); 国家自然科学基金(31070571)
收稿日期:2013鄄04鄄01; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄07鄄03
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: luquan@ caf.ac.cn
DOI: 10.5846 / stxb201304010576
孟贤静,吕全,刘学伟,焦相杰,梁军,张星耀.落叶松八齿小蠹与长喙壳真菌间的种特异性伴生关系.生态学报,2015,35(2):313鄄323.
Meng X J, L俟 Q, Liu X W, Jiao X J, Liang J, Zhang X Y. The species specific associations between Ips subelongatus and ophiostomatoid fungi. Acta
Ecologica Sinica,2015,35(2):313鄄323.
落叶松八齿小蠹与长喙壳真菌间的种特异性伴生关系
孟贤静1,吕摇 全1,*,刘学伟1,焦相杰2,梁摇 军1,张星耀1
1 国家林业局森林保护学重点实验室,中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所,北京摇 100091
2 内蒙古赤峰市克什克腾旗广兴林场,赤峰摇 025350
摘要:小蠹虫与长喙壳类真菌(Ophiostomatoid fungi)在自然界中形成稳定的伴生关系,是森林生态系统内一种普遍的生态学现
象。 已有研究表明欧亚大陆的齿小蠹属( Ips)昆虫与多种长喙壳类真菌形成广泛的伴生关系,其中部分真菌是重要的针叶树病
原菌。 随着借助于 DNA信息特征的系统发育分析,揭示出形态特征和亲缘关系十分接近的 3种齿小蠹属昆虫,云杉八齿小蠹
(I. typographus),欧洲落叶松八齿小蠹( I. cembrae)和亚洲落叶松八齿小蠹( I. subelongatus)确定为不同种之后,相应地与之稳定
伴生的长喙壳类真菌 Ceratocystis polonica也由过去一个种揭示为 3个种的复合体,各自与 3种小蠹虫稳定伴生,形成密切的种
特异性伴生关系。 小蠹虫与真菌的种特异性伴生被认为是处于同一森林生态系统内的生物协同进化的结果。 通过对我国东北
地区落叶松八齿小蠹虫体、坑道标本上伴生真菌菌株的采集、分离和生理学、形态学特征观察,以及基于 ITS、茁鄄tubulin、MAT鄄 2
HMG box多位点 DNA序列的系统发育分析,首次确定了长喙壳真菌 Ceratocystis fujiensis 在我国东北地区异域分布的 3 种落叶
松林内普遍存在,与落叶松八齿小蠹形成稳定的伴生关系。 作为亚洲落叶松八齿小蠹伴生的主要真菌,也是伴生菌区系中的先
锋种和致病力最强的病原菌,C. fujiensis在我国落叶松人工林的广泛分布值得高度重视,将为制定防治病虫复合危害的有效策
略和措施提供科学基础。 研究结果进一步支持了齿小蠹属昆虫与长喙壳真菌间的种特异性伴生假说。 同时,多基因序列特征
表明落叶松八齿小蠹与 C. fujiensis在亚洲范围内的不同地理种群存在着显著的遗传多样性,预示特异性伴生在不同种群间发
生的可能,可以为种特异性伴生假说和小蠹虫鄄真菌间共生关系的研究提供良好的模式材料。
关键词:亚洲落叶松八齿小蠹; Ceratocystis fujiensis; 系统发育; 落叶松; 病原菌
The species specific associations between Ips subelongatus and ophiostomatoid
fungi
MENG Xianjing1, L譈 Quan1,*, LIU Xuewei1, JIAO Xiangjie2, LIANG Jun1, ZHANG Xingyao1
1 Key Laboratory of Forestry Protection, State Forestry Administration; Research Institute of Forest Ecology, Environment and Protection, Chinese Academy of
Forestry, Beijing 100091, China
2 Guangxing Forestry Farm, KeShiKeTengqi, Chifeng City in Inner Mongolia, Chifeng 025350, China
Abstract: The bark鄄beetles and ophiostomatoid fungi formed a stable association relationship in nature. It is a universal
ecology phenomenon occurring frequently in forest ecological systems. The association between the beetles and fungi are
regarded to some extent as a symbiosis in a broad sense. They have been extensively and intensively documented and
illustrated from all over the world since it was first realized. Some research showed that Ips beetles spread over Eurasia were
extensively associated with a number of ophiostomatoid fungi species. Among which, some species are important pathogens
of conifers. Although the morphology and ecology characteristics of three Ips beetles, I. typographus, I. cembrae, and I.
subelongatus were almost identical, these beetles were evidenced in a series studies as distinct species based on the
http: / / www.ecologica.cn
phylogenetic analysis of DNA information and critical morphological comparison. In parallel, an ophiostomatoid fungus,
Ceratocystis polonica previously recognized as a closely associated fungus with these beetles was also separated into three
distinct entities resided in the Ceratocystis coerulescens species complex, and stably associated with three kinds of bark
beetles, respectively, where a species specific association between bark beetles and ophiostomatoid fungi was established.
The species specific association was understood as a result of co鄄evolution in forests where both partners lived together in a
common habitat. The samples collected in this study from three allopatric Larix hosts which Ips subelongatus attacked
seriously. The ophiostomatoid strains were isolated from the body surface of Ips subelongatus, blue鄄stain tissue or the
galleries bark鄄beetles attacked. Observations of the colony, physiology and morphology characteristic, and comparisons of
anamorph and teleomorph structures of all Ceratocystis strains, confirmed that the strains are indistinguishable from
Ceratocystis fujiensis M.J.Wingf. The phylogenetic analysis based on sequences derived from the ITS regions of the rDNA
operon, the partial 茁鄄tubulin gene and the MAT鄄2 HMG box gene, further determined a total of nineteen fungal strains as
species Ceratocystis fujiensis. The study first determined Ceratocystis fujiensis extensively existed in three allopatric larch
forests in northeast and north China, which formed a stable association relationship with Ips subelongatus under such
ecological conditions. Ceratocystis fujiensis was proved as a dominant fungus associated with Ips subelongatus in Japan, and a
pioneer species and the strongest pathogenic fungus in all the bark鄄beetles associated fungi. Because C. fujiensis widely
infesting Larix spp. plants in China, inevitably, this phenomenon should be paid high attention. The study provides
scientific basis to make the policies and measures for the government to prevent and control the composite damages of
diseases and pests effectively. The result in this paper provides support to the hypothesis of species specific association
between Ips beetles and ophiostomatoid fungi. Meanwhile, the multi鄄gene sequences characteristic indicates that I.
subelongatus and C. fujiensis exist significant genetic diversity in different geographic populations, which probably predict
the possibility of the species specific association occurred under species levels. The associations between Ips beetles and
ophiostomatoid fungi exhibit an ideal insight into completely understanding the symbiotic relationship between the bark
beetles and ophiostomatoid fungi, and species specific association as well.
Key Words: Ips subelongatus; Ceratocystis fujiensis; phylogeny; Larix spp.; pathogen
落叶松属植物(Larix spp.)作为落叶松八齿小蠹( Ips subeolongatus)的主要寄主,是速生丰产用材林基地
建设的首选树种,在我国广泛分布。 然而,落叶松纯林的大量营造为落叶松的广泛分布和大量纯林为落叶松
八齿小蠹的发生和传播蔓延提供了条件。 目前发现,落叶松八齿小蠹在我国的地理分布范围极广[1],主要危
害东北和华北异域分布的兴安落叶松( L. gmelini)、长白落叶松( L. olgensis)和华北落叶松( L. prineipis鄄
rupprechtii) [2]。
落叶松八齿小蠹作为次期性害虫的先锋种,主要侵害伐倒木、濒死木,发生盛期也可危害健康或衰弱的的
活立木,给我国的落叶松人工林造成巨大的损失和威胁[3,4],被列入“全国林业危险性有害生物名单冶(国家林
业局 2013年第 4号公告) [5],同时也是欧洲和地中海植物保护组织(EPPO)预警名单 A2(http: / / www.eppo.
org / QUARANTINE / listA2.htm)里的种类。
小蠹虫和真菌之间的伴生是森林生态系统内一种普遍的生态学现象,是生物长期协同进化的结果。 伴生
真菌,尤其是长喙壳类真菌(ophiostomatoid fungi)在与昆虫形成广义上的共生关系体内,起到影响昆虫种群建
立、协同克服寄主抗性、引起树木病害和造成木质部变色的作用[6鄄7],带来直接和间接的经济损失。 长喙壳类
真菌主要包括微囊目(Microascales)的长喙壳属(Ceratocystis)、穴喙壳属(Sphaeronaemella)、Gondwanamyces 属
和 Cornuvesica 属,以及蛇口壳目(Ophiostomatales)的蛇口壳属(Ophiostoma)、Grosmannia 属和拟长喙壳属
(Ceratocystiopsis),以及对应于这些有性型的多种无性属[8]。
自 Hartig首次发现真菌与小蠹虫的伴生现象以来[9],二者之间的协同进化关系得到了越来越多的研究材
413 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
http: / / www.ecologica.cn
料和个例的证实。 小蠹虫和真菌各自形成了特定的形态构造以利于保持双方共生体的延续,其中小蠹虫体表
形成的贮菌器(mycangium)是这种进化最有力的证据[6]。
齿小蠹属目前包括约 36 个种,全部分布于北半球的针叶林内。 其中 13 个种分布于欧亚大陆[10]。 形态
和亲缘关系十分相似的 3种齿小蠹,云杉八齿小蠹( Ips typographus)、欧洲落叶松八齿小蠹( I. cembrae)和亚洲
落叶松八齿小蠹( I. subelongatus)作为欧亚大陆针叶林内的种类,引起了大范围的危害。 云杉八齿小蠹在欧
洲被列为危害最为严重的十大蠹虫之首[11],目前发现与云杉八齿小蠹及其日本变种 ( I. typographus f.
japonicus)相伴生的长喙壳真菌约有 30 种,其中形成稳定伴生关系的主要是 Ceratocystis polonica (Siem.) C.
Moreau,是伴生菌区系中的先锋种,往往在真菌侵染寄主的最前端分离率最高。 Ceratocystis polonica 是一种强
致病性病原菌[12],其致病性增强了害虫的危害性[6,13]。
在欧洲目前发现 11 种长喙壳真菌与欧洲落叶松八齿小蠹伴生[6,14鄄18],其中与强致病性病原菌 C.
laricicola形成稳定的伴生关系。 日本也较早开展了落叶松八齿小蠹伴生菌的研究[19],到目前报道与 12 个长
喙壳真菌的种类伴生[20鄄22]。 尽管最初认为这两种小蠹虫属同种,而且都可与病原菌 C. laricicola稳定伴生,但
随后借助 DNA序列为工具的系统发育学研究揭示了害虫和伴生菌分属两个不同种,在日本与亚洲落叶松八
齿小蠹伴生的主要真菌为 Ceratocystis fujiensis[23],而不是 C. laricicola。
上述 3种八齿小蠹形态极为相似,与此类似的是,3 种小蠹虫各自稳定的伴生菌 C. polonica、C. laricicola
和 C. fujiensis之间形态上也几乎无法区别,但基于多基因序列分析的系统发育分析清晰的表明它们属于不同
种,而且它们也可以通过寄主、媒介昆虫和地理区域的分化特征进行区分[23]。 即小蠹虫与伴生真菌在长期协
同进化过程中,特定种的小蠹虫只与特定种的真菌形成稳定的“种特异性伴生冶关系假说( species鄄specific
association of fungi with bark beetles) [24鄄26]。
我国近几年也对落叶松八齿小蠹伴生菌有一些零星的研究和报道[27鄄29],但缺乏系统性。 本研究通过对 3
种异域分布的落叶松林内的齿小蠹伴生菌进行系统调查和分析,期望验证种的特异性伴生假说,以明确稳定
伴生的长喙壳病原菌在我国森林生态系统中的分布范围,为森林病虫害的有效治理提供科学依据。
1摇 材料与方法
1.1摇 标本采集
于 2011—2012年,分别在内蒙古阿荣旗,根河,五岔沟,赤峰;黑龙江省古城,伊春;吉林长白,辽宁抚顺等
地区选择兴安落叶松、长白落叶松和华北落叶松进行标本采集。 标本包括落叶松八齿小蠹虫体标本与坑道
标本。
1.2摇 真菌分离纯化
采用组织分离法进行伴生真菌分离。 将坑道标本切成 3 mm伊3 mm大小的组织块,用 1.5%的次氯酸钠溶
液(每 100 mL含 1滴吐温 20)进行表面消毒处理 1 min,再用无菌水冲洗 3 次。 无菌滤纸吸干组织块上的水
分后接于 2%的无菌水琼脂培养基上进行真菌分离培养。 利用 1.5%的次氯酸钠溶液对落叶松八齿小蠹进行
体表消毒 30 s,用无菌的镊子将虫体置于 2%水琼脂培养基上进行虫体表面真菌分离。
采用菌丝先端纯化法对组织分离培养的真菌进行纯化,纯化后得到的真菌接于 2%MEA培养基,置于 25
益恒温培养箱中,黑暗条件下培养。
1.3摇 菌株形态学
将分离纯化得到的菌株在 2%MEA培养基上培养 20 d,每天记录菌丝形态,生长情况,待其长出子实体释
放出孢子后,在显微镜下观察菌株的子囊壳、子囊、子囊孢子、分生孢子梗、分生孢子的形态特征,并进行描述、
测量和拍摄。 每一形态特征测量 50组数据进行分析处理。
1.4摇 菌株生长速率测定
用直径为 5 mm的无菌打孔器从在 2%MEA培养基上旺盛生长的实验菌株边缘切下菌饼,置于相同培养
513摇 2期 摇 摇 摇 孟贤静摇 等:落叶松八齿小蠹与长喙壳真菌间的种特异性伴生关系 摇
http: / / www.ecologica.cn
基成分的培养皿中央。 菌饼生长菌丝的一面与培养基直接接触,每个菌株做 3 个重复,25 益黑暗条件下恒温
培养,每天观察菌落生长情况,采用十字交叉法测量菌落直径。
1.5摇 DNA提取
对纯化所得菌株采用 2%液体 PDA培养基置于 25 益摇床下黑暗培养 7 d,挑取适量菌丝于滤纸上,用无
菌水冲洗菌丝至滤液澄清,菌丝烘干,备用。 DNA 提取采用 CTAB 法用植物基因组 DNA 提取试剂盒进行
提取。
1.6摇 PCR扩增
试验采用 25 滋L的 PCR反应体系:模板 1 滋L,浓度 1 滋mol / L的引物各 1 滋L,2伊Taq PCR MasterMix(0.1 U
Taq Polymerase / 滋L, 500 滋mol / L dNTP each, 20 mmol / L Tris鄄HCL ( pH8. 3), 100 mmol / L KCl, 3 mmol / L
MgCl2)12.5 滋L, 9.5 滋L ddH2O。 不同 DNA基因片段的扩增条件及所需引物如表 1 所示[27]。 PCR 产物采用
2.2%琼脂糖凝胶电泳检测,条带单一、清晰的送往北京宝锐通生物科技有限公司进行双向测序。
表 1摇 基因扩增所需引物、引物序列及扩增程序统计表
Table 1摇 The information about the Primers and the PCR conditions
扩增序列 Gene 引物 Primers 引物序列 Primer sequences 扩增条件 PCR amplification conditions
ITS ITS1 5忆 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3忆 94 益 3 min,94 益 1 min,55 益 45 s
ITS4 5忆 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3忆 72 益 1 min,循环 35次;72 益 4 min
茁鄄tubulin Bt1鄄a 5忆 TTCCCCCGTCTCCACTTCTTCATG 3忆 95 益 5 min,94 益 30 s,58 益 50 s
Bt1鄄b 5忆 GACGAGATCGTTCATGTTGAACTC 3忆 72 益 2 min,循环 40次;72 益 5 min
MAT鄄2 HMG box gene COER2鄄1 5忆 GACACCAAGACGTCAAAGCC 3忆 95 益 5 min,94 益 30 s,58 益 50 s
COER2鄄2 5忆 GCTTTTCTTGTAAGTTTCAGC 3忆 72 益 2 min,循环 40次;72 益 5 min
1.7摇 系统发育分析
上述获得的基因序列首先在基因库(GenBank)内利用 BLAST 进行搜索比对,获得与已知序列初步的相
关性,下载相关已发表序列,连同本实验获得的 19 株菌株的核苷酸序列利用 ClustalX 2.0 进行序列比对
(Alignment)。 经过比对完成的序列利用最大简约法(PAUP伊version 4.0b10)以及贝叶斯方法(MrBayers3.1.2)
进行系统发育分析,建立系统发育树。 贝叶斯系统发育树构建时采用 MCMC 算法,运行 5000000 代,模型的
选择采用 MrModeltest2.3软件进行检测。 采用 PAUP 软件对 ITS,茁鄄tubulin以及 MAT鄄2 HMG box 三段基因进
行同质性检验,判断三段基因是否可以用来构建基因联合树。 选取 Ceratocystis polonica作为外群[23]。 实验所
采用菌株及构建系统发育树所需参考菌株信息如表 2所示。
表 2摇 实验用 Ceratocystis属菌株及构建系统发育树参考菌株信息表
Table 2摇 Fungal isolates obtained from different hosts Ips subelongatus infested and isolates of known species included for reference purposes
物种
Species identit
菌株编号 寄主 Host
植物 /昆虫 Plant / Insect
采集
Origin地
采集者
Collector
分离日期
Date of
isolation
登录号 Genbank No.*
ITS 茁鄄tubulin MAT鄄2HMG box
富士长喙壳
Ceratocystis CXY1505
兴安落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹
Larix gmelini / Ips subelongatus 内蒙古根河 本文 2011 KC762579 KF773013 KJ634488
fujiensis CXY1506 兴安落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹Larix gmelini / Ips subelongatus 内蒙古根河 本文 2011 KC762578
CXY1507 兴安落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹Larix gmelini / Ips subelongatus 内蒙古根河 本文 2011 KC762577 KF773015 KJ634489
CXY1508 兴安落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹Larix gmelini / Ips subelongatus 内蒙古根河 本文 2011 KC762576 KF773014 KJ634490
CXY1509 兴安落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹Larix gmelini / Ips subelongatus 内蒙古根河 本文 2011 KC762575
CXY1515 华北落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹L.principis鄄rupprechtii / I.subelongatus 内蒙古黄岗梁 本文 2011 KC762574 KF773017 KJ634494
613 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
http: / / www.ecologica.cn
续表
物种
Species identit
菌株编号 寄主 Host
植物 /昆虫 Plant / Insect
采集
Origin地
采集者
Collector
分离日期
Date of
isolation
登录号 Genbank No.*
ITS 茁鄄tubulin MAT鄄2HMG box
CXY1516 华北落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹L.principis鄄rupprechtii / I.subelongatus 内蒙古黄岗梁 本文 2011 KC762573 KF773018 KJ634495
CXY1517 华北落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹L.principis鄄rupprechtii / I.subelongatus 内蒙古黄岗梁 本文 2011 KC762572 KF773019 KJ634496
CXY1518 华北落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹L.principis鄄rupprechtii / I.subelongatus 内蒙古黄岗梁 本文 2011 KC762571
CXY1514 华北落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹L.principis鄄rupprechtii / I.subelongatus 内蒙古黄岗梁 本文 2011 KC762570 KJ634493
CXY1511 华北落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹L.principis鄄rupprechtii / I.subelongatus 内蒙古黄岗梁 本文 2011 KC762569
CXY1512 华北落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹L.principis鄄rupprechtii / I.subelongatus 内蒙古黄岗梁 本文 2011 KC762568 KF773020 KJ634491
CXY1513 华北落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹L.principis鄄rupprechtii / I.subelongatus 内蒙古黄岗梁 本文 2011 KC762567 KJ634492
CXY1510 华北落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹L.principis鄄rupprechtii / I.subelongatus 内蒙古黄岗梁 本文 2011 KC762566 KF773016
CXY1522 长白落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹L. olgensis / I. subelongatus 黑龙江古城 本文 2012 KC762584
CXY1519 长白落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹L. olgensis / I. subelongatus 黑龙江古城 本文 2012 KC762583 KF773023 KJ634497
CXY1520 长白落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹L. olgensis / I. subelongatus 黑龙江古城 本文 2012 KC762582
CXY1521 长白落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹L. olgensis / I. subelongatus 黑龙江古城 本文 2012 KC762581 KF773022 KJ634498
CXY1523 长白落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹L. olgensis / I. subelongatus 黑龙江古城 本文 2012 KC762580 KF773021 KJ634499
C. polonica CMW5026 欧洲云杉 /云杉八齿小蠹Picea abies / Ips typographus 澳大利亚, T. Kirisits 1997 AY233907 AY233932 AY233959
CMW8845 樟子松 /横坑切梢小蠹 Pinus sylvestris /Tomicus minor 澳大利亚 T. Kirisits 1998 AY233890 AY233926 AY233956
CMW2284 日本鱼鳞松 / 亚洲落叶松八齿小蠹变种 P.jezoensis / I.typographus japonicus 日本,北海道 Y. Yamaoka 1989 AY233894 AY233935 AY233964
CMW2210 日本鱼鳞松 / 亚洲落叶松八齿小蠹变种 P.jezoensis / I.typographus japonicus 日本,北海道 Y. Yamaoka 1990 AY233897 AY233936 AY233960
CMW8830 欧洲云杉 /云杉八齿小蠹 Picea abies /Ips typographus 挪威
T. Kirisits
H. Solheim 1992 AY233889 AY233929 AY233955
CMW8873 欧洲云杉 /云杉八齿小蠹 Picea abies /I. typographus 挪威
T. Kirisits
H. Solheim 1990 AY233888 AY233928 AY233954
CMW2272 日本鱼鳞松 / 亚洲落叶松八齿小蠹变种 P.jezoensis / I.typographus japonicus 日本,北海道 Y. Yamaoka 1990 AY233893 AY233934
CMW7151 欧洲云杉 /云杉八齿小蠹 Picea abies /I. typographus 澳大利亚
R. Grubelnik
T. Kirisits 1997 AY233896
CMW10522 欧洲云杉 /云杉八齿小蠹 Picea abies /I. typographus 波兰 W. Siemaszko 1938 AY233898 AY233933
CMW7748 欧洲云杉 /云杉八齿小蠹 Picea abies /I. typographus 捷克共和国
T. Kirisits
R. Jakus 2001 AY233899 AY233939
CMW7143 Picea abies / I. amitinus 澳大利亚 T. Kirisits 1997 AY233904
C. laricicola CMW4540 欧洲落叶松 /欧洲落叶松八齿小蠹 L.decidua / I. cembrae 苏格兰,阿瑟尔
T. Kirisits
et. al 1997 AY233910 AY233947 AY233966
CMW4546 欧洲落叶松 /欧洲落叶松八齿小蠹 L.decidua / I. cembrae 苏格兰,阿瑟尔
T. Kirisits
et. al 1997 AY233911 AY233945 AY233970
713摇 2期 摇 摇 摇 孟贤静摇 等:落叶松八齿小蠹与长喙壳真菌间的种特异性伴生关系 摇
http: / / www.ecologica.cn
续表
物种
Species identit
菌株编号 寄主 Host
植物 /昆虫 Plant / Insect
采集
Origin地
采集者
Collector
分离日期
Date of
isolation
登录号 Genbank No.*
ITS 茁鄄tubulin MAT鄄2HMG box
CMW3221 欧洲落叶松 /欧洲落叶松八齿小蠹 L.decidua / I. cembrae 苏格兰,阿瑟尔
T. Kirisits
et. al 1997 AY233921 AY233943
CMW1016 欧洲落叶松 /欧洲落叶松八齿小蠹 L.decidua / I. cembrae 苏格兰 D. B. Redfern AY233915 AY233946
CMW5064 欧洲落叶松 /欧洲落叶松八齿小蠹 L.decidua / I. cembrae 澳大利亚 T. Kirisits 1997 AY233912
CMW7760 欧洲落叶松 /欧洲落叶松八齿小蠹 L.decidua / I. cembrae 澳大利亚 T. Kirisits 1997 AY233918 AY233942 AY233969
CMW7759 欧洲落叶松 /欧洲落叶松八齿小蠹 L.decidua / I. cembrae 澳大利亚 T. Kirisits 1998 AY233919 AY233941 AY233965
C. fujiensis CMW1965 日本落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹 L.kaempferi / I.subelongatus 日本,富士山
M.J.Wingfield
Y.Yamaoka 1992 AY233922 AY233950 AY233972
CMW1969 日本落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹 L.kaempferi / I.subelongatus 日本,富士山
M.J.Wingfield
Y.Yamaoka 1993 AY233923 AY233951 AY233967
CMW1952 日本落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹 L.kaempferi / I.subelongatus 日本,富士山
M.J.Wingfield
Y.Yamaoka 1994 AY233924 AY233949 AY233971
NMG_11 兴安落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹Larix gmelini / Ips subelongatus 内蒙古 X.Zhou 2008 HM776416
HLJ_1 长白落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹 L.olgensis / I. subelongatus 黑龙江 X. Zhou 2009 HQ707818
HLJ_2 长白落叶松 /亚洲落叶松八齿小蠹 L.olgensis / I. subelongatus 黑龙江 X. Zhou 2009 HQ707819
C. pinicola CMW3273 欧洲云杉 Picea abies 挪威 H. Solheim 1994 AY233925 AY233952 AY233974
摇 摇 内蒙古根河实验林场,经纬度:121毅37忆12义E,50毅50忆15义N;内蒙古克什克腾旗黄岗梁实验林场,经纬度:117毅31忆14义E摇 43毅35忆08义N;黑龙江古城镇湖水林场,经纬
度:130毅13忆06义E摇 45毅23忆34义N; :该序列信息无
2摇 结果与分析
2.1摇 真菌分离和形态学鉴定
实验从 103份标本上共分离得到长喙壳类真菌 157株,其中包括 Ceratocystis属真菌 19株,这些菌株在生
长速率、培养特征和形态学特征上表现出一致性,可知 19 株真菌为同一个种。 19 株 Ceratocystis 属真菌菌株
分别在内蒙古根河、黄岗梁和黑龙江古城 3个地区分离得到,分离率分别为 40%、31%和 22%。
通过对上述菌株进行生理学以及形态学观察分析结果显示,在 25 益黑暗恒温,2%MEA培养基培养条件
下,菌株在第 4天到第 5天生长速率最快,达到 21 mm / d,在第 7天时可长满直径为 85 mm的一次性塑料培养
基。 在 2%MEA培养基上新生菌丝灰白色,中央橄榄绿色,菌丝生长较快,菌落中央呈绒毡状,致密,较厚(图
1鄄a,图 1鄄b)。
试验分离纯化得到的菌株在形态上基本一致,选用菌株 CXY1506 和 CXY1517 进行详细的形态学观察。
子囊壳褐色至黑色,基部球形,表生,子囊壳直径 132—274 滋m(图 1鄄c,图 1鄄d),着生大量褐色菌丝。 菌丝长度
250—626 滋m(图 1鄄g,图 1鄄h)。 颈暗褐色至黑色,直立或稍弯曲,长 360—1201 滋m,壁光滑,圆锥状,由颈基部
向颈顶部逐渐变细,颈基部宽 32—58 滋m,顶部宽 10—24 滋m(图 1鄄c,图 1鄄d)。 孔口缘丝透明,向外稍倾斜,孔
口缘丝长 25—57 滋m(图 1鄄e,图 1鄄f)。 子囊原囊壁渐消解,子囊孢子长 3.5—6.1 滋m,宽 1.2—2.4 滋m(图 1鄄i),
椭圆形,有胶质鞘,单细胞透明。 分生孢子圆柱形,单细胞透明,长 7.6—22.7 滋m,宽 3.5—7.8 滋m(图 1鄄j)。 显
微形态观察特征显示与 Ceratocystis fujiensis[23]无明显区别。
813 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
http: / / www.ecologica.cn
2.2摇 系统发育分析
用 ClustalX 2.0对 44个 ITS序列进行比对,利用 PAUP* version 4.0b10 最大简约法分析结果显示,比对
的 547个特征视为无序且权重相同,其中恒量特征 492个,29个有简约信息的变量特征。 利用最大简约法构
建的联合树步长(Tree length)为 71,一致性指数(Consistency index, CI)为 0.7587,保留指数(Retention index,
RI)为 0.9548,趋同性指数(Homoplasy index, HI)为 0.2143,可调一致性指数(Rescaled consistency index, RC)
为 0.8337。 MP 树表明 43个内群分为 3个主要分支,分别为 Ceratocystis polonica, C. fujiensis, C. laricicola(图
2)。 本实验分离所得菌株与日本 C. fujiensis 3 个菌株以及周秀华等[28]分离得到的 C. fujiensis 菌株聚集为 1
个分支,其中周秀华所分离的菌株构成 1 个亚分支,与其他 C. fujiensis 均有 4 个变化;CXY1510 和 CXY1512
构成一个亚分支,与其他 C. fujiensis均有 3个变化;日本菌株 CMW1952和 CMW1969与中国菌株 CXY1517,
913摇 2期 摇 摇 摇 孟贤静摇 等:落叶松八齿小蠹与长喙壳真菌间的种特异性伴生关系 摇
http: / / www.ecologica.cn
图 1摇 Ceratocystis fujiensis 形态学特征图(CXY1506,CXY1517)
Fig 1摇 Light micrographs of Ceratocystis fujiensis(CXY1506,CXY1517)
a.菌株 CXY1517在 MEA培养基上 25 益条件下培养 5 d的菌落形态;b.菌株 CXY1506在 MEA培养基上 25 益条件下培养 5 d的菌落形态;
c,d.子囊壳(100 滋m);e,f.孔口缘丝(20 滋m);g,h.营养菌丝(20 滋m);I.子囊孢子(10 滋m); j.分生孢子(10 滋m)
图 2摇 基于 ITS序列采用 PAUP软件构建的最大简约树(MP 树)
Fig.2摇 Phylogram obtained from DNA sequence data of the ITS region with the maximum parsimony method
023 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
http: / / www.ecologica.cn
CXY1516,CXY1523均有 1个变化;而 CXY1518具有两个变化。 基于 ITS 基因的 MP 树 3 个分支的节点支持
率(BS)均高于或等于 80%(图 2)。 采用贝叶斯方法进行贝叶斯树的构建,采用 MCMC 算法,共运行 5000000
代,构建的系统发育树与 MP 树拓扑结构完全一致,贝叶斯分析结果显示后验概率(PP)均高于或等于 0.80。
图 2中最后显示节点支持率为 BS / PP。
图 3摇 基于 ITS,茁鄄tubulin以及MAT鄄2 HMG box三段基因构建的MP联合树
Fig.3摇 Phylogram obtained from MP analyses of the ITS, 茁鄄tubulin and MAT鄄2 HMG box sequence data
对要进行系统发育分析的 3个位点的 DNA序列进行同质性检验(P value = 0.451),发现 3个位点的 DNA
序列可以进行基因联合树的构建。 利用 ClustalX 2.0 对 ITS、茁鄄tubulin 以及 MAT鄄 2 HMG box 三段基因进行
DNA序列比对。 最大简约法分析比对的 1269个特征视为无序且权重相同,结果显示,其中恒量特征为 1204
个,32个无简约信息的变量特征以及 33个有简约信息的变量特征。 利用最大简约法构建的联合树步长(Tree
length)为 72,一致性指数(CI)为 0.8974,保留指数(RI)为 0.9778,趋同性指数(HI)为 0.1026,可调一致性指
数(RC)为 0. 9325,得到各节点支持率为 BS。 MP 树表明 23 个内群分为 3 个主要分支,分别对应种 C.
polonica,C. fujiensis,C. laricicola(图 3)。 本实验分离所得菌株与日本 3个菌株聚为 1支,最后节点支持率 BS /
PP = 94 / 0.98。 其中本实验分离到的菌株与日本菌株 CMW1965 聚集为 1 个亚分支,后验概率 PP = 1.00,节点
支持率 BS= 96;其中菌株 CXY1512,CXY1505,CXY1507 构成 1 个亚分支,CXY1516 和 CXY1517 构成 1 个亚
分支,与其他 C. fujiensis均有 1 个变化。 CXY1508,CXY1515,CXY1523,CMW1519,CMW1521 具有一致性,而
日本菌株 CMW1969和 CMW1952构成 1个单独的分支。 该 MP 联合树 3个分支的节点支持率(BS)均高于或
等于 94%(图 3)。 利用 MrModeltese2.3进行模型检测,在 AIC(Akaike Information Criterion)标准下,获得最佳
模型 HKY+I。 贝叶斯系统发育树构建方法采用 MCMC算法,共运行 5000000代,构建的系统发育树拓扑结构
123摇 2期 摇 摇 摇 孟贤静摇 等:落叶松八齿小蠹与长喙壳真菌间的种特异性伴生关系 摇
http: / / www.ecologica.cn
与 MP 树完全一致,结果显示后验概率(PP)均高于或等于 0.83,多数节点后验概率值为 1.00。
3摇 结论与讨论
本研究对我国东北异域分布的 3种落叶松林内的落叶松八齿小蠹危害的寄主坑道组织和虫体标本进行
采集和系统分离长喙壳真菌,获得的 Ceratocystis属菌株进行生理学特性、菌落特征、微观形态学的观察,以及
基于 ITS、茁鄄tubulin、MAT鄄 2 HMG box 多位点 DNA 序列的系统发育分析。 研究结果表明,实验分离得到
Ceratocystis fujiensis菌株 19株。 该种首先在日本发现[23],已与亚洲落叶松八齿小蠹形成稳定的伴生关系,是
伴生菌区系中的先锋种和致病力最强的病原菌,人工接种条件下可以致死 30 年生的日本落叶松( Larix
kaempferi) [21鄄22]。 我国学者曾在长白落叶松和兴安落叶松的小蠹虫坑道分离到 3 株该病原菌[28]。 本研究首
次从大兴安岭的兴安落叶松,长白山地区的长白落叶松和大兴安岭余脉不同地域分布的华北落叶松林内系统
发现 C. fujiensis,表明该病原性真菌在我国东北、华北落叶松林内广泛分布,与落叶松八齿小蠹形成稳定的伴
生关系。
在欧洲分布的云杉八齿小蠹伴生菌 C. polonica和落叶松八齿小蠹伴生菌 C. laricicola 具有明显的寄主分
化特征,接种试验证明只能在各自的寄主(欧洲云杉 Picea abies 和欧洲落叶松 Larix decidua)上造成显著的病
斑,而无法成功侵染另一寄主,即形成了“Picea abies鄄Ips typographus鄄C. polonica冶和“Larix deciduas 鄄Ips cembrae鄄
C. laricicola冶的协同进化关系[30]。 日本也发现落叶松八齿小蠹伴生菌的分化特征,即“ Larix kaempferi鄄Ips
subelongatus鄄C. fujiensis冶的协同进化[23]。 本项研究结果显示 C. fujiensis在我国也与危害 3 种本土落叶松寄主
的落叶松八齿小蠹形成稳定的伴生关系,支持了这种协同进化关系,即特定种的小蠹虫与特定种的真菌稳定
伴生形成了种特异性伴生的进化趋势。 尚需进一步研究 C. fujiensis 和 C. laricicola 在不同落叶松寄主(欧洲
落叶松和亚洲落叶松)上的交叉接种,以及 C. fujiensis和 C. polonica在云杉(欧洲云杉、日本云杉等)和亚洲落
叶松(包括日本落叶松、兴安落叶松、长白落叶松和华北落叶松等)上的交叉接种试验,以验证这种协同进化
形成的伴生菌的寄主分化特征。
伴生菌适应寄主植物和小蠹虫的分化潜力已在不同地理(或寄主)种群中发现。 日本的云杉八齿小蠹( I.
typographus f. japonicus)被视为欧洲种的 1个变种,两个种群间存在明显的遗传隔离[31鄄32],危害不同的云杉寄
主;尽管二者均与 C. polonica形成稳定的伴生关系,但该伴生菌在两个地区存在显著的遗传差异,分化为明显
的两个地理(或寄主)种群[33],即“Picea abies 鄄 Ips typographus 鄄 C. polonica 欧洲种群冶和“Picea jezoensis(日本
云杉)鄄I. typographus f. japonicus鄄C. polonica日本种群冶。
尽管我国落叶松八齿小蠹与日本落叶松八齿小蠹属为同一种,但其线粒体基因序列显示二者存在不同单
倍体型的差异[18],而且我国落叶松八齿小蠹的长白落叶松种群和兴安落叶松种群间存在信息素响应的二型
现象,可能二者为不同的地理(或寄主)种群[26]。 亚洲落叶松八齿小蠹存在着丰富的种下分化现象。 由基于
ITS序列的 MP 树(图 2)可见,C. fujiensis表现出丰富的种内分化。 同时基于多 DNA 序列的联合系统发育分
析(图 3)可见,相比较地域分布更为广泛的 C. polonica和 C. laricicola,C. fujiensis却表现出更加丰富的种内分
化,聚类出两个亚分支,一支为日本的两个菌株,另一分支为日本的 1 个菌株和中国的所有菌株聚在一起;尽
管中国菌株并未表现出 3种寄主的分化特征,但危害长白落叶松的落叶松八齿小蠹的伴生菌种群表现出更加
一致的 DNA序列(图 3)。 这种伴生菌丰富的种下分化显示出与其寄主和媒介昆虫丰富的遗传多样性的平行
结构,值得从更大的样本量和更全面的分析,例如调查全基因组的遗传多样性,揭示 C. fujiensis 和小蠹虫种群
下是否有隐存种或种群分化的存在,以验证是否也存在着特异性伴生的进化现象。
参考文献(References):
[ 1 ]摇 杨静莉, 林强, 陈国发. 落叶松八齿小蠹的危险性分析. 东北林业大学学报,2007, 35(3):60鄄63.
[ 2 ] 摇 胡新生, Ennos R A, 王笑山. 论我国兴安落叶松、长白落叶松及华北落叶松种间遗传进化关系. 林业科学,1999, 35(3): 84鄄96.
[ 3 ] 摇 萧刚柔. 中国森林昆虫. 北京:中国林业出版社, 1992.
223 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
http: / / www.ecologica.cn
[ 4 ]摇 殷惠芬, 黄复生. 中国经济昆虫志. 北京: 科学出版社, 1984, 54鄄55.
[ 5 ] 摇 国家林业局 2013年第 4号公告 http: / / www.forestry.gov.cn / portal / main / govfile / 13 / govfile_1983.htm [2013鄄3鄄15]
[ 6 ] 摇 Kirisits T. Fungal associates of European bark beetles with special emphasis on the ophiostomatoid fungi / / Lieutier F, Day K R, Battisti A,
Gr佴goire J C, Evans H F, eds. Bark and Wood Boring Insects in Living Trees in Europe. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 2004:
181鄄236.
[ 7 ] 摇 Wingfield M J, Seifert K A, Webber J F. Ceratocystis and Ophiostoma: Taxonomy, Ecology and Pathogenicity. Minnesota, USA: American
Phytopathological Society, 1993.
[ 8 ] 摇 吕全.中国红脂大小蠹伴生菌的系统发育及其生物生态学习性[D]. 北京:中国林业科学研究院, 2007.
[ 9 ] 摇 Hartig T. Ambrosia des Bostrichus dispar. Allgemeine Forst鄄Und Jagdzeitung, 1844, 13: 73鄄73.
[10] 摇 Cognato A I, Sun J H. DNA based cladograms augment the discovery of a new Ips species from China (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae) .
Cladistics, 2007, 23(6): 539鄄551.
[11] 摇 Gr佴goire J C, Evans H. Damage and control of BAWBILT organisms an overview / / Lieutier F, Day K R, Battisti A, Gr佴goire J C, Evans H F, eds.
Bark and Wood Boring Insects in Living Trees in Europe. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 2004: 19鄄37.
[12] 摇 Christiansen E. Ceratocysts polonica inoculated in Norway spruce: Blue鄄staining in relation to inoculum density, resinosis and tree growth. European
Journal of Forest Pathology, 1985, 15(3): 160鄄167.
[13] 摇 Kirisits T. Fungi isolated from Picea abies infested by the bark beetle Ips typographus in the Bia覥owie 觶za forest in north鄄eastern Poland. Forest
Pathology, 2010, 40(2): 100鄄110.
[14] 摇 Aghayeva D N, Wingfield M J, deBeer Z W, Kirisits T. Two new Ophiostoma species with Sporothrix anamorphs from Austria and Azerbaijan.
Mycologia, 2004, 96(4): 866鄄878.
[15] 摇 Jankowiak R, Rossa R, Mista K. Survey of fungal species vectored by Ips cembrae to European larch trees in Raciborskie forests (Poland) . Czech
Mycology, 2007, 59(2): 227鄄239.
[16] 摇 Redfern D B. The roles of the bark beetle Ips cembrae, the woodwasp Urocerus gigas and associated fungi in dieback and death of larches / / Wilding
N, Collins N M, Hammond P M, Webber J F, eds. Insect鄄Fungus Interactions. 14th Symposium of the Royal Entomological Society of London in
collaboration with the British Mycological Society. London: Academic Press, 1989: 195鄄204.
[17] 摇 Redfern D B, Stoakley J T, Steele H, Minter D W. Dieback and death of larch caused by Ceratocystis laricicola sp. nov. following attack by Ips
cembrae. Plant Pathology, 1987, 36(4):467鄄480.
[18] 摇 Stauffer C, Kirisits T, Nussbaumer C, Pavlin R, Wingfield M J. Phylogenetic relationships between the European and Asian eight spined larch bark
beetle populations (Coleoptera, Scolytidae) inferred from DNA sequences and fungal associates. European Journal of Entomology 2001, 98(1):
99鄄105.
[19] 摇 Aoshima K. Studies on Wood鄄staining Fungi of Japan(in Japanese with English Sunnary) [D]. Tokyo: University of Tokyo, 1965.
[20] 摇 Chung W H, Kim J J, Yamaoka Y. Uzunovic A, Masuya H, Breuil C. Ophiostoma breviusculum sp. nov.(Ophiostomatales, Ascomycota) is a new
species in the Ophiostoma piceae complex associated with bark beetles infesting larch in Japan. Mycologia, 2006, 98(5): 801鄄814.
[21] 摇 Yamaoka Y C, Hizai M, Chung W H, Masuya H. Constant association of ophiostomatoid fungi with the bark beetle Ips subelongatus invading
Japanese larch logs. Mycoscience, 2009, 50(3):165鄄172.
[22] 摇 Yamaoka Y, Wingfield M J, Ohsawa M, Kuroda Y. Ophiostomatoid fungi associated with Ips cembrae in Japan and their pathogenicity of Japanese
larch. Mycoscience, 1998, 39(4):367鄄378.
[23] 摇 Marin M, Preisig O, Wingfield B D, Kirisits T, Yamaoka Y, Wingfield M J. Phenotypic and DNA sequence data comparisons reveal three discrete
species in the Ceratocystis polonica species complex. Mycological Research, 2005, 109(10): 1137鄄1148.
[24] 摇 Francke鄄Grosmann H. Ectosymbiosis in wood鄄inhabiting insects / / Henry S M, ed. Symbiosis. New York: Academic Press, 1967, 2: 141鄄205.
[25] 摇 Paine T D, Raffa K F, Harrington T C. Interactions among Scolytid bark beetles, their associated fungi, and live host conifers. Annual Review of
Entomology, 1997, 42(1): 179鄄206.
[26] 摇 Song L W, Zhang Q H, Chen Y Q, Zuo T T, Ren B Z. Field responses of the Asian larch bark beetle, Ips subelongatus, to potential aggregation
pheromone components: disparity between two populations in northeastern China. Insect Science, 2011, 18(3): 311鄄319.
[27] 摇 Paciura D, Zhou X D, DeBeer Z W, Jacobs K, Ye H, Wingfield M J. Characterisation of synnematous bark beetle鄄associated fungi from China,
including Graphium carbonarium sp nov. Fungal Diversity, 2010, 40(1): 75鄄88.
[28] 摇 周秀华, 宋瑞清, 曹翠, 崔磊, 梁晓东, 潘建中, 朱元金, 胡振宇. 落叶松八齿小蠹伴生真菌 3 个菌株的鉴定及生物学生理学特性. 林业
科学,2011, 47(5):82鄄86.
[29] 摇 周秀华, 宋瑞清, 周旭东, 崔磊, 曹翠. 落叶松八齿小蠹体内外和坑道内真菌类群. 菌物学报, 2011, 30(3): 400鄄407.
[30] 摇 Harrington T C, Pashenova N V, McNew D L, Steimel J, Konstantinov M Y. Species delimitation and host specialization of Ceratocystis laricicola
and C. polonica to larch and spruce. Plant Disease, 2002, 86(4): 418鄄422.
[31] 摇 Sall佴 A, Arthofer W, Lieutier F, Stauffer C, Kerdelhu佴 C. Phylogeography of a host鄄specific insect: genetic structure of Ips typographus in Europe
does not reflect past fragmentation of its host. Biological Journal of the Linnean Society, 2007, 90(2): 239鄄246.
[32] 摇 Stauffer C, Lakatos F. Ips typographus f. japonicus Niijima (Col., Scolytidae): a genetic analysis by allozymes and mitochondrial sequence data / /
Jandl R, Devall M, Khorchidi M, Schimpf E, Wolfrum G, Krishnapillay KB, eds. Pramaju Sdn. Bhd, Vol. 3, Poster Abstracts, Forests and
Society: The Role of Research. XXI IUFRO World Congress. Kuala Lumpur, 2000: 397鄄397.
[33] 摇 Marin M, Preisig O, Wingfield B D, Kirisits T, Wingfield M J. Single sequence repeat markers reflect diversity and geographic barriers in Eurasian
populations of the conifer pathogen Ceratocystis polonica. Forest Pathology, 2009, 39(4): 249鄄265.
323摇 2期 摇 摇 摇 孟贤静摇 等:落叶松八齿小蠹与长喙壳真菌间的种特异性伴生关系 摇