全 文 ：第 １３卷第 ６期
２０１５年 １１月
生 物 加 工 过 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ １３ Ｎｏ ６
Ｎｏｖ ２０１５
ｄｏｉ：１０ ３９６９ ／ ｊ ｉｓｓｎ １６７２－３６７８ ２０１５ ０６ ００３
收稿日期：２０１４－０１－０７
基金项目：国家科技支撑计划（２０１５ＢＡＤ１５Ｂ０９）；江苏省高校自然科学研究重大项目（１４ＫＪＡ２２０００３）；江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１３１４２６）
作者简介：顾夕梅（１９９１—），女，江苏南通人，硕士研究生，研究方向：木质纤维原料生物利用；李 鑫（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｌｉ＠ ｎｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
碱预处理玉米芯米根霉同步糖化发酵产富马酸
顾夕梅，周 瑾，陈 云，李 鑫
（南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京 ２１００３７）
摘 要：以碱预处理玉米芯渣为原料，采用单因素优化方法优化米根霉同步糖化发酵产富马酸。 在此基础上，研究
米根霉利用碱预处理玉米芯渣的同步糖化发酵，并与纯糖发酵进行对比。 结果表明：在 ５０ ｇ ／ Ｌ底物、（ＮＨ４） ２ＳＯ４质
量浓度 ０ ７１ ｇ ／ Ｌ、纤维素酶用量 ２０ ＦＰＩＵ（以 １ ｇ纤维素计）、ＣａＣＯ３加入量 ３０ ｇ ／ Ｌ、接种量 １０％（体积分数）和装液量
５０ ｍＬ的条件下，米根霉同步糖化发酵过程产富马酸 １３ ７８ ｇ ／ Ｌ，而纯糖发酵富马酸生成量仅 ６ ２１ ｇ ／ Ｌ。
关键词：碱预处理；玉米芯渣；富马酸；同步糖化发酵；米根霉
中图分类号：ＴＱ３５３ ６ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０６－００１３－０５
Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｋａｌｉ⁃ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ
ｃｏｒｎｃｏｂ ｔｏ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
ＧＵ Ｘｉｍｅｉ，ＺＨＯＵ Ｊｉｎ，ＣＨＥＮ Ｙｕｎ，ＬＩ Ｘｉｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００３７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ （ＳＳＦ） ｏｆ ａｌｋａｌｉ⁃ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｃｏｒｎｃｏｂ ｔｏ ｆｕｍａｒｉｃ
ａｃｉｄ ｂｙ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗ：ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｌｏａｄｉｎｇ ５０ ｇ ／ Ｌ，
ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ０ ７１ ｇ ／ Ｌ，ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｄｏｓａｇｅ ２０ ＦＰＩＵ ／ ｇ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ ３０ ｇ ／ Ｌ，ｉｎｏｃｕｌｕｍ
１０％（Ｖ ／ Ｖ），ａｎｄ ｌｏａｄｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ ５０ ｍＬ． Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＳＳＦ） ｏｆ ａｌｋａｌｉ⁃
ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｃｏｒｎｃｏｂ ｔｏ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｄｉｒｅｃｔ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＳＳＦ ｂｙ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｄｕｃｅ １３ ７８ ｇ ／ Ｌ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ， ｗｈｉｌｅ ｄｉｒｅｃｔ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｎｌｙ ｏｂｔａｉｎｅｄ ６ ２１ ｇ ／ Ｌ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｕｓｉｎｇ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｓ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｌｋａｌｉ⁃ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ； ｃｏｒｎｃｏｂ； ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ； ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
富马酸作为一种不饱和四元羧酸，含有不饱和
双键及 ２个羧基，这样的分子结构，使其能够参与众
多化学反应。 同时，富马酸具有无毒、不吸湿及可
增加聚合物坚硬度等特性，在食品、化工、医药、涂
料、树脂等领域具有广泛用途［１－４］。
目前，化石资源的衰竭及化学合成法对环境的
污染，使得微生物发酵产富马酸成为当前研究的热
点之一。 发酵法生产富马酸的微生物主要有霉菌、
酵母及细菌，而根霉具有营养要求简单、环境适应
能力强以及生长迅速等特点［２］。 此外，根霉菌可利
用碳源范围较广［５］，如葡萄糖、淀粉、纤维素和石
蜡［６］。 以来源广泛的非粮食基木质纤维原料为碳
源，低成本生物转化富马酸，符合可持续发展的
要求。
同步糖化发酵（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ＳＳＦ）技术将酶水解过程和发酵有机结
合，具有缩短发酵周期、节约成本、避免底物抑制等
优点［７－８］。 笔者以米根霉为发酵菌种，利用碱预处
理玉米芯渣为原料，ＳＳＦ法产富马酸，并对影响发酵
过程的因素进行优化，以确定最佳 ＳＳＦ条件。
１ 材料与方法
１ １ 菌种和原料
米根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ） ＣＩＣＣ４０３５１，购于中国
工业微生物菌种保藏中心。
碱预处理玉米芯渣：江苏康维生物有限公司
（纤维素质量分数 ６６ ３５％，半纤维素质量分数
２２ ３８％，木质素质量分数 ５ ９２％）。
纤维素酶（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ 公司，滤纸酶活力为 １１７
Ｕ ／ ｇ）、β 葡萄糖苷酶（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ公司，酶活力为 ３２３
Ｕ ／ ｇ），Ｓｉｇｍａ公司。
１ ２ 培养基
斜面培养基（ｇ ／ Ｌ）： 酵母膏 ３ ０、麦芽浸膏 ３ ０、
琼脂 ２０ ０、蛋白胨 ５ ０、葡萄糖 １０ ０。
基础培养基 （ ｇ ／ Ｌ）： 葡萄糖 ４０、 （ ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４
４ ４、ＫＨ２ ＰＯ４ ０ ６、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ ０ ５、ＺｎＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ
０ ０１７ ６、ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０ ０００ ４９８。 ｐＨ ２ ３～２ ７。
发酵培养基 Ｉ（ｇ ／ Ｌ）：（以葡萄糖为碳源）葡萄糖
３８、（ ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４ ０ ７１、 ＫＨ２ ＰＯ４ ０ ６、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ
０ ５、ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０ ０１、ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０ ０００ ４。 自
然 ｐＨ。
发酵培养基 ＩＩ（１ Ｌ）：（以碱处理玉米芯渣为碳
源）底物 ５０ ｇ、（ＮＨ４） ２ ＳＯ４ ０ ７１ ｇ、ＫＨ２ ＰＯ４ ０ ６ ｇ、
ＭｇＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ ０ ５ ｇ、ＺｎＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ ０ ０１ ｇ、ＦｅＳＯ４·
７Ｈ２Ｏ ０ ０００ ４ ｇ、ＣａＣＯ３ ３０ ｇ（单独灭菌）；纤维素酶
和 β 葡萄糖苷酶的加入量分别为 ２５ ＩＵ 和 ２０ ＩＵ
（以 １ ｇ纤维素计）；加入乙酸 乙酸钠缓冲液 ０ ０５
ｍｏｌ ／ Ｌ维持发酵液 ｐＨ ４ ８左右。
上述培养基均在 ０ １ ＭＰａ、１２１ ℃条件下灭菌
１５ ｍｉｎ。
１ ３ 培养方法
１ ３ １ 产孢斜面
从 ４ ℃冰箱中取出保藏菌种，接种环挑取少量
孢子，接种于斜面，３０ ℃培养 ６～７ ｄ。
１ ３ ２ 基础培养
２５０ ｍＬ三角瓶加入 ５０ ｍＬ种子培养基，根据孢
子密度与吸光度曲线：ｙ ＝ ０ ５５３ｘ＋０ ０１４（ ｘ：×１０７ ／
ｍＬ）确定接种量，置于 ３５ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 的摇床培养
２４ ｈ。
１ ３ ３ 发酵培养
２５０ ｍＬ的三角锥形瓶，适当装液量和接种量，
置于 ３８ ℃、２２０ ｒ ／ ｍｉｎ的摇床培养 ６０ ｈ。
１ ４ 分析方法
水分含量测定：采用 ＦＤ ７２０ 型红外水分测定
仪（日本 ＫＥＴＴ公司）测定。
孢子数量的确定：采用血球计数板计数。
试样制备：发酵结束，加入 ２５０ ｇ ／ Ｌ ＮａＯＨ溶液，
将发酵液 ｐＨ调至偏碱，再加入 ３６０ ｇ ／ Ｌ 的 Ｈ２ＳＯ４，
将 ｐＨ调至 ７ 附近，将富马酸转化为易溶于水的钠
盐进行检测。 离心后，倒出上层清液待测。
葡萄糖、富马酸、乙醇含量测定：采用 Ａｇｉｌｅｎｔ
１２００型高效液相色谱仪，Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ ８７
糖柱，以 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｈ２ＳＯ４ 为流动相，流速为 ０ ６
ｍＬ ／ ｍｉｎ，柱温 ５５ ℃，示差折光检测器，进样量 １０ μＬ。
２ 结果与讨论
２ １ 同步糖化发酵培养基的优化
２ １ １ （ＮＨ４） ２ＳＯ４用量的确定
氮源的浓度对微生物的菌体生长和产物产量
都有较大的影响，对于米根霉为代表的丝状真菌而
言，氮源限制造成的环境胁迫是积累有机酸的重要
营养特征［９］。 以 （ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４作为唯一氮源，考察
（ＮＨ４） ２ＳＯ４用量（０ ７１、０ ５１、０ ３１ 和 ０ ２１ ｇ ／ Ｌ）对
米根霉 ＳＳＦ产富马酸的影响，结果见表 １。
表 １ （ＮＨ４） ２ＳＯ４用量对米根霉 ＳＳＦ产富马酸的影响
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｏｎ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ＳＳＦ ｕｓｉｎｇ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
ｇ·Ｌ－１
ρ（（ＮＨ４）２ＳＯ４） ρ（剩余葡萄糖） ρ（富马酸） ρ（乙醇）
０ ７１ ３ ４２ ± ０ ３２ １１ ８１ ± ０ ９２ １ ７９ ± ０ １２
０ ５１ ９ １６ ± ０ ３９ １０ ４４ ± ０ ６７ １ ５６ ± ０ ２２
０ ３１ １８ ５４ ± ０ ７２ １１ ３７ ± ０ ３２ ０ ０９ ± ０ ０９
０ ２１ ２２ １９ ± ０ ８７ １０ ５４ ± ０ ４２ ０ ００ ± ０ ００
由表 １ 可知：氮源用量的变化对富马酸产量的
影响较小，（ＮＨ４） ２ ＳＯ４质量浓度为 ０ ７１ ｇ ／ Ｌ 时，富
马酸产量最高（１１ ８１ ｇ ／ Ｌ）。 随着（ＮＨ４） ２ ＳＯ４浓度
的逐渐减少， 菌体对葡萄糖的利用率下降，
（ＮＨ４） ２ＳＯ４用量为 ０ ２１ ｇ ／ Ｌ 时，剩余葡萄糖质量浓
４１ 生 物 加 工 过 程 第 １３卷
度高达 ２２ １９ ｇ ／ Ｌ，而富马酸的产量并未有明显下
降，且乙醇产量呈下降趋势。 这可能是由于 Ｃ ／ Ｎ 比
的增加，导致菌体胞质内富马酸酶酶活的提高，使
碳流更倾向于形成富马酸的途径［１０］。 从菌体生物
量的表现来看，氮源的减少，菌体颗粒直径明显较
小，氮源的减少限制了菌体生物量的生长。
２ １ ２纤维素酶用量的确定
纤维素酶的高成本是阻碍纤维工业化的一个
重要原因，因此，除了开发高效廉价的纤维素酶之
外，优化纤维素酶的用量也是降低生产成本的有效
途径之一。 考察纤维素酶用量（２０、２５、３０ 和 ３５ Ｕ）
对米根霉 ＳＳＦ产富马酸的影响，结果如表 ２所示。
表 ２ 纤维素酶用量对米根霉 ＳＳＦ产富马酸的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｄｏｓａｇｅ ｏｎ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ＳＳＦ ｕｓｉｎｇ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
纤维素
酶用量 ／
Ｕ
ρ（剩余葡萄糖） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（富马酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（乙醇） ／
（ｇ·Ｌ－１）
２０ ２ ２０ ± １ １１ １３ ２０ ± ２ ０９ １ ０４ ± ０ ５２
２５ ３ ６８ ± １ １５ １１ ６５ ± ０ ０３ ２ ２７ ± ０ １１
３０ ３ ８５ ± ０ ４３ １０ ６６ ± ０ １５ ２ ０５ ± ０ ３６
３５ ２ ８８ ± ０ ２７ １２ ４９ ± ０ ３３ １ ４４ ± ０ ４６
由表 ２可知：随着纤维素酶用量的增加，富马酸
产量较为稳定，没有出现大幅度的变化。 增加纤维
素酶的用量可以增加纤维素酶与纤维素的黏附几
率，可有效地将纤维素转化为还原糖，然而在一定
条件下，纤维素分子能与纤维素酶分子结合的位点
数量有限，当这些结合位点全被纤维素酶分子占据
后，再增加纤维素酶用量，达不到增加酶解作用，加
快还原糖的释放；另一方面从经济角度考虑，酶用
量也要尽可能少［１１］。 因此，确定纤维素酶最佳用量
为 ２０ Ｕ。
２ １ ３ ＣａＣＯ３用量的确定
微生物都有它们生长的最适 ｐＨ 范围，为了维
持环境中 ｐＨ，同时降低产物抑制作用，培养基中往
往要加入一定量的中和剂［１１］。 微生物发酵产富马
酸的研究中，ＣａＣＯ３是最常用的中和剂［４，１０，１２
－１３］。 使
用 ＣａＣＯ３为中和剂作用温和，不会对细胞造成损伤，
有利于菌体生长；但 ＣａＣＯ３一次性投加过量时会对
菌体造成包埋现象，不利于菌体与培养基接触而影
响发酵进程［５］。 因此，考察 ＣａＣＯ３加入量（１０、２０、３０
和 ４０ ｇ ／ Ｌ）对米根霉 ＳＳＦ 产富马酸的影响，结果如
表 ３所示。
表 ３ ＣａＣＯ３加入量对米根霉 ＳＳＦ产富马酸的影响
Ｔａｂｌｅ ３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｏｎ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ＳＳＦ ｕｓｉｎｇ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
ｇ·Ｌ－１
ρ（ＣａＣＯ３） ρ（剩余葡萄糖） ρ（富马酸） ρ（乙醇）
１０ ８ ９８ ± ０ ２６ ９ ４２ ± ０ ４１ ２ ３５ ± ０ ４３
２０ ５ ３５ ± ０ ３０ １１ ３８ ± ０ ４３ ２ ８３ ± ０ １８
３０ ２ ５３ ± １ １２ １４ ６５ ± ０ ８０ １ ９８ ± ０ ２１
４０ １ ８９ ± ０ ４７ １３ ８２ ± ０ １３ ２ ７７ ± ０ ４２
由表 ３ 可知：当 ＣａＣＯ３添加量为 １０ ｇ ／ Ｌ 时，富
马酸产量较低，且 ＣａＣＯ３的加入量过少时，米根霉对
葡萄糖的利用率下降，这说明较低的 ＣａＣＯ３浓度不
足以维持发酵液在一个适宜的 ｐＨ 范围，同时
ＣａＣＯ３能够提供一定的 ＣＯ２，以激活丙酮酸羧化酶，
使碳流主要分布于产生富马酸的胞质途径。 所以，
当 ＣａＣＯ３加入量不足时，会影响碳流的分布［１４］。 由
表 ３还可知，当 ＣａＣＯ３的添加量过高或过低时，乙醇
的浓度都较高。 综合考虑，确定 ＣａＣＯ３的最适添加
量为 ３０ ｇ ／ Ｌ。
２ １ ４ 接种量的确定
接种量是由发酵时菌体生长繁殖的速度决定
的，通常较大的接种量可以缩短生长周期，使产物
合成提前，但如果接种量过大则可能使菌种生长过
快，溶氧量不足，从而影响产物的合成［１５］。 考察接
种量（５、１０、１５ 和 ２０％（体积分数））对碳源的利用
情况和 ＳＳＦ产富马酸的影响，结果见表 ４。
由表 ４可知：随着接种量的增加，发酵剩余葡萄
糖逐渐减少，但是过高的接种量，并未带来高的富
马酸积累，原因可能是接种量提高，菌球数目增多，
有氧呼吸较强，葡萄糖经糖酵解生成的丙酮酸大量
进入三羧酸循环（ＴＣＡ循环）被消耗，最终进入胞质
转化为富马酸的量也较低［１３］。 而高接种量下乙醇
的产量也较高，说明在一定阶段，高接种量会加速
无氧呼吸。 当接种量为 ５％时，富马酸产量低于接
种量为 １０％时的产量，这是因为适当地增加接种
量，有利于微生物快速进入到对数期，使整个发酵
周期中的产酸期相对延长。 因此，选定米根霉发酵
产富马酸的最佳接种量为 １０％。
５１ 第 ６期 顾夕梅等：碱预处理玉米芯米根霉同步糖化发酵产富马酸
表 ４ 接种量对米根霉 ＳＳＦ产富马酸的影响
Ｔａｂｌｅ ４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｏｎ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｂｙ ＳＳＦ ｕｓｉｎｇ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
φ（接种量） ／
％
ρ（剩余葡萄糖） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（富马酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（乙醇） ／
（ｇ·Ｌ－１）
５ ７ ０６ ± ０ ３０ １４ ３９ ± １ ７２ ０ ６８ ± ０ ３９
１０ １ ５３ ± ０ ８２ １５ ９４ ± １ ７２ ０ ８４ ± ０ ６０
１５ ０ ０９ ± ０ ０３ １４ ９９ ± ０ ２３ １ ０８ ± ０ １５
２０ ０ ０４ ± ０ ０４ １３ ８３ ± ０ ８１ １ ２５ ± ０ ４１
２ １ ５ 装液量的确定
对好氧性真菌米根霉而言，溶氧对于其菌体生
长和产物积累都有较大影响，溶氧越多，菌体生长
越快，有氧呼吸越强，ＴＣＡ循环产生的 ＡＴＰ 越多，可
以为丙酮酸羧化酶催化丙酮酸转化为草酰乙酸所
用，同时 ＴＣＡ 循环本身也是积累富马酸的次要途
径［４－５］。 因此，在一定范围内，高的溶氧可以带来高
的富马酸积累［１３］。 锥形瓶中的装液量直接影响溶
氧水平，从而影响根霉细胞生长和富马酸的积累。
考察装液量（５０、７５、１００ 和 １２５ ｍＬ）对米根霉 ＳＳＦ
产富马酸的影响，结果如表 ５所示。
表 ５ 装液量对米根霉 ＳＳＦ产富马酸的影响
Ｔａｂｌｅ ５ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｏａｄｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ ｏｎ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ＳＳＦ ｕｓｉｎｇ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
装液量 ／
ｍＬ
ρ（剩余葡萄糖） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（富马酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（乙醇） ／
（ｇ·Ｌ－１）
５０ １ ３４ ± ０ ２７ １３ ４１ ± ０ ０６ １ ８１ ± ０ ７９
７５ １ ４４ ± ０ ４７ ７ １５ ± ０ ２１ ４ ７８ ± １ ０４
１００ １ １７ ± ０ ００ ３ ３３ ± ０ ０２ ９ ５８ ± ０ ４９
１２５ ０ １１ ± ０ ０１ １ ９６ ± ０ ２５ １１ ４０ ± ０ ９１
由表 ５ 可知，相同转速下，装液量越少，溶氧条
件越好。 随着装液量的升高，富马酸产量越来越
低，而乙醇的积累则越来越高。 这说明，装液量越
低，米根霉的无氧呼吸越弱。 由此可知，装液量是
影响摇瓶发酵溶氧的重要因素。 装液量越高，溶氧
越少，无氧呼吸越强，进而促进了副产物乙醇的积
累。 因此，最佳装液量为 ５０ ｍＬ。
２ ２ 碱预处理玉米芯同步糖化发酵产富马酸
经过碱预处理的玉米芯渣，作为一种木质纤维
原料，含有丰富的纤维素，可以作为 ＳＳＦ碳源进行米
根霉同步糖化发酵产富马酸。 碱预处理破坏了玉
米芯的结构，使其结构松散，且去除了大量的半纤
维素和木质素，这些都有利于纤维素降解成单糖的
酶解过程［１６］。 而以玉米芯为唯一碳源的培养基中，
除了大量的纤维素成分外，蛋白质、脂类等也为米
根霉提供了生长所需的营养成分［１７］。 以碱预处理
玉米芯渣为碳源的同步糖化发酵过程，与米根霉纯
糖发酵产富马酸的对比，结果如图 １所示。
图 １ 米根霉同步糖化发酵与纯糖发酵产富马酸的对比
Ｆｉｇ １ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ
ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＳＦ ｏｆ ａｌｋａｌｉ⁃ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｃｏｒｎｃｏｂ
ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ
由图 １ 可知：以碱预处理玉米芯渣为碳源的发
酵，前期积累的葡萄糖较多，当米根霉菌体小球生
长完全并开始产酸时，葡萄糖的含量急剧下降。 而
以葡萄糖为碳源时，菌体可直接利用培养基中的碳
源进行生长和产酸，３６ ｈ 时，葡萄糖已经完全耗尽。
米根霉是非生长耦联型的产酸机制［１］，因此富马酸
的分泌均在菌体生长完全以后，且 ＳＳＦ过程中乙酸
乙酸钠缓冲液的存在，延迟了菌体的生长，但适宜
浓度的乙酸会促进乙酰辅酶的生成，有利于细胞的
代谢［１８］。 对于 ＳＳＦ发酵 ６０ ｈ 后，葡萄糖完全耗尽，
富马酸的产量达到最高 １３ ７８ ｇ ／ Ｌ，而葡萄糖发酵富
马酸的产量最高仅 ６ ２１ ｇ ／ Ｌ。 且葡萄糖发酵后期，
菌体死亡导致发酵液 ｐＨ的明显上升。
根霉利用木质纤维原料同步糖化发酵产富马
酸的研究较少，李硕［１９］以小麦麸皮为碳源，利用戴
尔根霉同步糖化发酵产富马酸，底物添加量为 １００
ｇ ／ Ｌ，而富马酸产量仅为 ６ ０６ ｇ ／ Ｌ。 本研究虽然只是
在低底物浓度的条件下进行了同步糖化发酵的试
验，但是为米根霉利用木质纤维原料同步糖化发酵
产富马酸的发展奠定了一定的前期基础。
３ 结论
米根霉利用碱预处理玉米芯渣 ＳＳＦ发酵产富马
６１ 生 物 加 工 过 程 第 １３卷
酸的培养基优化结果：５０ ｇ ／ Ｌ 碱预处理玉米芯渣，
（ＮＨ４） ２ＳＯ４质量浓度 ０ ７１ ｇ ／ Ｌ，纤维素酶用量 ２０ Ｕ
（以 １ ｇ 纤维素计），ＣａＣＯ３加入量 ３０ ｇ ／ Ｌ，接种量
１０％（体积分数），装液量 ５０ ｍＬ。
米根霉利用碱预处理玉米芯渣 ＳＳＦ 与纯糖发酵
产富马酸对比表明，在 ＳＳＦ过程中富马酸产量最高可
达 １３ ７８ ｇ ／ Ｌ，纯糖发酵的富马酸产量仅 ６ ２１ ｇ ／ Ｌ。
参考文献：
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（责任编辑 荀志金）
７１ 第 ６期 顾夕梅等：碱预处理玉米芯米根霉同步糖化发酵产富马酸