全 文 ：脐血造血细胞体外保存及扩增的研究
景 强，熊晓辉，熊 强，陆利霞!
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 !"###）摘要：研究了脐血造血细胞在% &’ ()*+*),-".&’ -’*/ ,.,& */(-’+.&’ &0 #12.3.4-3 4&) 23&&5*1-"&(&.*".4 4*33+ ;-<= >?@AB，7-3<= 7?@C/DE?，7-3<= >?@AB，.4 .?/F?@ （*CGGHBH CI .?IH )J?HAJH @A( 2D@KL@JM，<@AN?AB 4A?OHKP?QM CI 1HJDACGCBM，<@AN?AB !"###，JD?A@）
62+")-4"：1DH O?@R?G?QM CI QDH LCACAEJGH@K JHGGP @A( QDH @R?G?QM CI SKC(EJ?AB QDH JHGG JCGCAM ICKL?AB EA?QP
（*+4/*）(EK?AB QDH SHK?C( CI SKHPHKO@Q?CA ?A KHIK?BHK@QCK @Q % & T@P PQE(?H(；1DH HIIHJQP CI QDH JCAJHAQK@Q?CA
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QD@Q ELR?G?J@G JCK( RGCC( JCEG( ACQ RH SKHPHKOH( ICK ’ (；1DH BKCES CI JMQCU?AHP：)*+ , -./0 , +. , 123 JCEG(
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LH(?EL JCEG( KHL@KU@RGM ?AJKH@PH *+4/*V1DH CSQ?LEL JCAJHAQK@Q?CA CI L?FH( ELR?G?J@G JCK( RGCC( SG@PL@ ?A
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7*% 8&)+：ELR?G?J@GJCK(RGCC(；DHL@QCSC?HQ?JJHGGP；W<∗；JMQCU?AH；HFO?OCHFS@AP?CA自":年法国的=GEJUL@A等进行了世界上首例脐血移植并成功的治愈了一例+@AJCA?贫血以来［"］，十几年来脐血已广泛用于治疗各种患急、慢性恶性血液病、重组免疫缺陷病以及骨髓瘤的儿童。人脐血中富含造血干细胞和各系祖细胞，且脐血造血干细胞具有强于骨髓和外周血的分化和长期造血能力［!，′］，且具有来源广泛、容易获得、传染病毒的几率小、较骨髓细胞异体反应小、移植物抗宿主反应症状轻等优点［8/），男，硕士，研究方向：细胞工程。 联系人：熊晓辉，1HG：#!5/:’5:8’%#，Z/L@?G：FFD’8"0[!0’\ AHQ 9EB\ !##% ·%0· 生 物 加 工 过 程 *D?AHPH ;CEKA@G CI ]?CSKCJHPP ZAB?AHHK?AB 第 !卷第 ’期 !##%年 :月 万方数据 降低了成本，为脐血造血干祖细胞移植用于临床探 索一条适合我国国情的道路。 ! 材料与方法 !"! 脐血样本的采集 脐血采自南京市鼓楼医院产房，妇幼均健康的 产妇分娩后，立即用加入肝素钠 # % & ’(抗凝的无
菌血袋采集脐血。
!"# 细胞因子及其来源
干细胞生长因子（)*+，,-./01/-公司）；白介素 2
（,(32，北大医学院宝赛公司）；白介素 4（,(34，北大医
学院保赛公司）；粒细胞集落刺激因子（53*)+，北大
医学院宝赛公司）；粒3巨噬细胞击落刺激因子（563
*)+，北大医学院宝赛公司）；+7.32配基（+(，89:;9<9:-
公司）；血小板生成素（=>?，89:;9<9:- 公司）。
!"2 实验方法
!"2"! 脐血单个核细胞（6@*）的分离［#］
淋巴细胞分离液密度梯度离心脐血［A］，收集
6@*，,6B6 培养基中洗涤 2 遍，台盼蓝染色计数，
要求活力!CDE。
!"2"# 脐血血浆的制备
将脐血置于 !′(离心管中，FG，20 & ’9-， 离心 2$ ’9-；上层血浆装入 # ’(血浆瓶中，微孔
过滤除菌；分装于离心管中，于3#G冰箱中保存。使用前于FG，20 & ’9- 离心机中离心 #$ ’9-，去 除冷凝蛋白后于 H4 G水浴中保温 2$ ’9-灭活，置于 室温备用。混合血浆系不同个体的脐血血浆等体积 混合而成。 !"2"2 脐血单个核细胞的体外扩增培养 细胞培养基为 #$E胎牛血清 +8)、!$ 1 & (牛血 清白蛋白、!$3F ’:7 #3巯基乙醇（#36I）、#E (3谷氨酰 胺的 ,6B6培养基，用前加入青霉素和链霉素；单核 细胞接种密度为 # J !$HK/77< & ’(，根据具体实验需要 加入不同种类或组合的细胞因子于 #F孔板中，每孔 接种密度为 # J !$HK/77< & ’(，每孔接种量为 ! ’(，于 2A G、含 HE *?#的全湿培养箱中培养，一定时间半 量换液，吸取一半的细胞和培养基进行细胞记数和 集落分析，同时补加新鲜培养基和细胞因子继续培 养。 !"2"F 造血细胞集落（*+L）分析［D］ 4孔板中每孔加入 ! ’( 含有 #$E胎牛血清 （+8)）、!$ 1 & (牛血清白蛋白、!$3F ’:7 #3巯基乙醇（#3 6I）、#E (3谷氨酰胺和 $"2E进口琼脂的 ,6B6的 半固体培养基；同时添加适量的双抗及细胞因子 ,(3 2、53*)+、*63*)+各 #$ -1 & ’(。6@*接种密度为 # J !$FK/77< & ’(，于 2A G，HE *?# 的恒湿的培养箱中 培养 !$ M !F N后。于倒置显微镜下进行集落观察 并计数，大于 H$个细胞的细胞团为一个集落（*+L） 单位。形成集落以粒3巨噬细胞集落（*+L356）为 主；另可见粒系3红系3单核3巨噬细胞集落（*+L3 5I66）和红系爆式集落（8+L3I）以及混合集落形成 单位（*+L369O）；以其总和：*+L3*（总集落）表示。 !"F 统计学分析 实验中每个样本采用 2个平行样，实验数据用 平均值 P标准方差表示［C］；组内及组间差异采用数 学软件 69K0:<:Q. IOK/7 中的单因素方差表分析， ! R !K09.为具有显著性差异。 " 结果与分析 #"! F G冰箱保存过程中的造血细胞活力的变化 新鲜脐血从医院采出后，立即进行体积测定、然 后放入一只灭好菌的盐水瓶中，从第 $ N起，每天取 出 !$ ’(脐血，进行单核细胞分离计数、活力计数和 集落分析。结果见表 !。 #"!"! 脐血于 F G冰箱中保存过程中的造血细胞 活力的变化 表 ! 脐血于 F G冰箱中保存过程中造血细胞活力的变化 =ST ! *US-19-1 :Q U/’S.:V:9/.9K K/77< ;9S79.W XU/- K:0N T7::N K:-0;/N 9- F G 0/Q091/0S.:0<br保存时间 & N 6@*浓度 &（! J !$4 & ’(） 细胞活力 & E 集落（*+L） 产率（ & ! J !$H） $ A"F P $"! CC"C P 4"! !DH"! P !2"# ! A"F P $"2 CA"F P 2"# !AD"H P #4"C # A"2 P $"! CF"F P $"C !FH"4 P 4"F 2 4"C P $"D DD"# P F"A C$"D P !H"H F 4"F P $"C D#"4 P A"2 FF"A P !$"A H 4"# P $"H A4"4 P D"H !D"# P !"D 4 H"C P $"2 4C"C P !$"4 $ 脐血 6@*在全血保存的过程中其细胞的活力 数是缓慢下降的，到第 4 N的时候下降了 2$E左右； 同时，6@*的浓度也处于一个缓慢下降的过程，在 $34 N内变化很小；但集落生成能力变化幅度较大， 从第 # N开始，集落产率呈加速下降趋势；第 H N时， 集落产率下降到不到原来时的 ! & !$，第 4 N 的时 6@*就彻底地丧失了集落生成能力。 #F年 D月 景 强等：脐血造血细胞体外保存及扩增的研究 ·FA·
万方数据
!"#"! %&分离出后加入到 )∗培养基中，调其浓度
为 # + #,- ./001 2 34，于 ’ (冰箱中保存，结果如表 !。
表 ! *$ 3/D;E3 ;9 ’ ( C/=C;:/C6>
2 D
细胞活力
2 F
集落（&GH）产率
（ 2 # + #,I）
, JJ"J K !"’ #LI"# K #!"-
# MN"N K !"J #N’"L K M"’
! IJ"N K ,"L ’L"M K #I"!
N !I"’ K N"I #,"- K ’"#
’ ##", K ,"I ,
I , ,
%&细胞活力为 ##", K ,"I F，集落产率为 ,。此
时大部分%&及 &GHO&的扩增情况，结果如图 #。
图 # 单细胞因子对 $%&扩增的影响
G;:P# Q==/.>1 <= D;==/C/9> .A>
%&总细胞的扩增，其他几组差别不明显，其
中 G4和 )4O-对 %&的扩增倍数都不大，
均不超过 I 倍。单因素方差分析结果为 ! V J"#L#
L#L W !.C;> V N"L-I JML，说明不同单细胞因子对 $%&
的扩增的影响具有显著性差异。
扩增前和培养后收集细胞做造血细胞集落分
析，结果如图 !。
图 ! 单细胞因子对 &GHO&扩增的作用
G;:P! Q==/.>1 <= D;==/C/9> .A>
这几种细胞因子中，)4ON对 &GHO&扩增的影响
最大，达到了 #!"! K ’"# 倍；TO&UG 和 T$O&UG 对集
落产率的影响略低于 )4ON；)4O- 对 &GHO&扩增的作
用最低。只扩增了 -"# K ,"M 倍。单因素方差分析
结果为 ! V #’"M L,! W !.C;> V !"L’M M!M，说明不同单
细胞因子间对 &GHO&的扩增作用具有显著性差异。
!"!"! 不同细胞因子组合对脐血造血细胞体外扩
增影响
单细胞因子对脐血造血细胞的作用较小，在细
胞因子协同的作用下则可达到较大扩增。在单细胞
因子的基础上寻找有效的细胞因子组合成了下一步
工作的关键。根据文献资料及以往工作经验，造血
细胞的体外扩增都需要 U&G；同时，)4ON及 T族细胞
因子的应用都存在一定的争议。本研究基于这一原
则，考察了含有 )4ON和 T族细胞因子的组合同其他
组合的区别，采用如下细胞因子组合，见表 N。
表 N 不同细胞因子组合
567 N *;==/C/9> .A>
第二组 Z O Z O O Z
第三组 Z O O Z O Z
第四组 Z Z O O Z Z
第五组 Z O Z O Z Z
第六组 Z O Z Z Z O
·’L· 生物加工过程 第 !卷第 N期
万方数据
共六组细胞因子，每种细胞因子的质量浓度为
!" #—第五组；—%—第六组
图 / 不同细胞因子组合扩增 ()*的效果
012/ 3445678 94 :1445;5#7 6<79=1#58 69&>1#?719#8 9# ()* 5@A?#B 819# 各细胞因子组合对培养三周后 ()*扩增的作 用差异不显著，其中 C*0 D E’BF D GHI这一组合得到 的扩增倍数最低，扩增 /JK! L MK.倍；最高组为 C*0 D GHI D N(B*C0组，扩增了 .-K" L -+KO倍；()*细 胞在在前 /天扩增倍数较小，可能是因为造血细胞 大部分处于静止休眠（N"）期，由于细胞因子的刺激 作用而走出 N"期而开始进入增殖期（N-）期开始分 裂增殖需要一定的时间，在 + P -. :内 ()*扩增的 速度逐渐加快，-. :以后细胞扩增速度开始放缓， 此时脐血 ()*细胞已进入相对稳定生长期；如在生 物反应器中放大培养脐血造血细胞，可选择培养 + P -. :时的 ()*细胞作为细胞来源。 每 / :半量换液收获细胞做集落分析，结果如 图 +。 脐血造血细胞在培养过程中其 *0QB* 经历一 个上升到一定阶段后又逐渐下降的过程。第六组在 第 J :时达到最大扩增倍数 -MKF L .K.倍，然后就逐 渐下降，到第 !- :时只有原来的 +KJ L "K!倍，其从 第 J :开始 *0QB*的整体趋势是逐渐下降的；第三 组同样具有这种特征，其在第 J :的时候 *0QB*提 高到 !-KO L -K/倍，然后缓慢下降至第 -! :的 -OK- L "KM 倍，第 -. :的时候快速下降到 MK+ L "K. 倍， 最后为 !K! L "K- 倍。这两组虽然总细胞的扩增同 其他组差异不大，但其集落形成能力在一定时间后 呈现一个逐渐下降的趋势，值得注意的是：这两组都 含细胞因子 N(B*C0，引起上述现象的原因可能是 N(B*C0促进了造血细胞分化的原因。 —!—第一组；—"—第二组；—#—第三组 — ,—第四组；——第五组；—%—第六组
图 + 不同细胞因子组合扩增 *0QB*的效果
012 + 3445678 94 :1445;5#7 6<79=1#58;9RA8 9# 7S5 5@A?#819# 94
*0QB*
第五组效果最好，*0QB*的扩增是一个逐渐上
升的过程，并一直持续到 -M :后稍有回落，这一组
合能较好地维持造血细胞的集落形成能力，抑制其
过度分化并得到较高的扩增倍数，说明这种细胞因
子组合对于脐血造血细胞的扩增较为有利。
!K/ 不同培养基添加成份对造血细胞扩增的影响
实验中选取 +个组，分别为：空白对照组、添加
!"T的胎牛血清、!"T自体脐血血浆、!"T混合脐血
血浆，细胞因子组合为 C*0、E’BF、0’、GHI各 !" #扩增的影响
%&’(! )**+,-. /* 012&/3. 4+5&34 2+67+8&.94+8- /8 -9+ +:618.&/8 /*
"#图;不同培养基添加成分对%<=扩增的影响
空白对照组的 的倍数明显低于其他 >
组；胎牛血清和自体脐血血浆对 扩增效果相
近，而混合脐血血浆的作用较前两者明显，可能是因
为胎牛血清和自体血浆含有的造血生长因子的量不
足，而混合血浆中的各种未知造血生长因子更丰富
从而能够更有效地刺激非同型造血细胞体外扩增的
原因。
?@>@? 不同浓度混合脐血血浆对造血细胞扩增的
影响
选择培养基中添加混合脐血血浆的体积分数分
别为 !A、BCA、B!A、?CA、?!A、>CA、>!A；体外扩
增培养 "#BC 5时收获细胞并进行集落培养，考察 其扩增情况，结果如图 D。 图 D 不同浓度混合脐血血浆对 "#扩增的影响
%&’( D )**+,-. /* 012&/3. ,/8,+8-21-&/8 /* 4&:+5 EF /8 -9+ +:618= .&/8 /* "#
由图 D可以看出：混合脐血血浆含量较低的时
候 "#的扩增倍数也较小，随着其浓度的上升， "#的扩增倍数也呈现出一个逐渐上升的趋势，在
浓度为 ?!A的时候出现拐点，此时 "#扩增了 BG@C H I@B倍，比最低组含量为 !A的混合血浆组高 出 >D@IA。随后逐渐下降。提示对于脐血 "#的
扩增，混合脐血血浆的浓度以 ?!A为最佳。"#的 扩增倍数随着在混合脐血血浆浓度的不断上升而随 之增加，达到 ?!A的时候开始有所下降，可能是由 于在其浓度低于 ?!A的时候，混合脐血血浆内刺激 造血的成份占主导作用因素，但随着其所占比例的 上升，超过一临界值后，培养基营养成分成为了主要 限制因素，扩增倍数开始下降。方差分析表结果为 ! J B?@DI I!? K !,2&- J >@BC! GD!，说明不同浓度混合 脐血血浆对 "#扩增的效果具有显著性差异。收
获的细胞做集落分析，结果如图 G。
图 G 不同浓度混合脐血血浆对 扩增的影响
%&’(G )**+,-. /* 012&/3. ,/8,+8-21-&/8 /* 4&:+5 EF /8 -9+ */75 +:618. &/8 /*%<=由图G可以看出，脐血混合血浆浓度和%<=的扩增无明显对应关系，其浓度为?!A的时候%<=
的扩增倍数最大，达到 ?>@! H C@G 倍。方差分析 结果为 ! J D@DG; GBI K !,2&- J >@BC! GD!，说明不同 浓度混合脐血血浆各组之间对脐血造血细胞扩增的 影响具有较显著性差异。 （下转第 !!页） ·!C· 生物加工过程 第 ?卷第 >期 万方数据 和温度通过影响酶分子与底物分子的解离状态以及 酶蛋白的构象改变反应进程、影响反应得率，均存在 最适值。!"#是 %!&（糖酵解途径）中酶系的辅助
因子，对酵母酶系具有较优的活化作用，作为激活
剂，!"# 只需极少量就可以使酶表现出较高的催化 活性。 参考文献： ［’］ !()*++, !，-./0/1" 2，34(5,64 7 !8 91:*;*4*/1 /< =,)=*.> *10.=(0 *1? +.)*1 +(=6(4*/1 <6/> *14,=4 @9A?A’B /6 9C3?’!D())+ ;E -A& 0(F)(4*/1 ［G］8 H*/=:(> &:,6>，’IIJ，（BK）：’LJK?’LL# 8 ［#］ -E+;(6+ G M，&,4:;/1( ! &8 -A& ,10 ".,1/+*1( +E1(6"*+4*=,))E (1? :,1=( C-N?*10.=(0 1(.6*4( /.4"6/54: <6/> F=’# =())［G］8 914 G O(P) C(.6/+=*(1=(，’IIQ，（’R）：’I?KR 8 ［K］ -E+;(6+ G M，-.,61*(6* 3，!,6*""*/ ! 7，(4 ,) 8 %S46,=()).),6 ".,1/+*1( BT?46*F:/+F:,4( (1:,1=(+ 1(6P( "6/54: <,=4/6?*10.=(0 1(.6*4( /.4"6/54: P*, *1=6(,+( *1 *146,=()).),6 =,)=*.>［G］8 C(.6/+=*(1=(，#UUU，（IQ）： L’J?L#R 8 ［R］ M,61(6 7 @8 7 +*>F)( ,10 *1(SF(1+*P( >(4:/0 6 4:( F6(F,6,4*/1 /<<br".,1/+*1( BT?46*F:/+F:,4(［G］8 H*/=:*> H*/F:E+ 7=4,，’IJB，（KLK）： ##I?#KB 8 ［B］ M. V W8&6(F,6,4*/1 /< -O&?!，-O& ,10 -A& ;E F:/+F:/6E),4*/1［G］8 &(*?=:*1" A, @+.(: @+.(: &,/，’IJL，（R）：J’?JQ 8 ［Q］ 3*>/1 % 3，-6,;/5+X* 3，M:*4(+*0(+ - !8 D/1P(1*(14 +E14:(+*+ /< =E4*? 0*1( BT?46*F:/+F:,4(，".,1/+*1( BT?46*F:/+F:,4(，,10 .6*0*1( BT?46*F:/+? F:,4( ,10 4:(*6 .+( *1 4:( F6(F,6,4*/1 /< YO&?").=/+(，YO&?").=.6/1*= ,=*0，,10 -O&?>,11/+(［G］8 G Z6" D:(>，’IIU，（BB）：’LKR?’LR’ 8 ［J］ A,X(0, 9，M,4,1,;( 38 34,;*)*[*1" 1.=)(/4*0( 0(6*P,4*P(+［&］8 G,F,18 J#KJ，UKQ，’IJ#?UI?’L 8 ［L］ 王镜岩，朱圣庚，徐长法等 8生物化学［!］8第三版 8北京：高等 教育出版社，#UU#8R# 8 ［I］ !/14"/>(6E，O D8实验设计与分析［!］8北京：高等教育出版社， ’IIL8BI’?Q#Q 8 ［’U］谢 琦 8浅谈啤酒酵母的培养［G］8广西轻工业，’IIJ，（#）：RK? RR 8 ［’’］71+;(6", 3，G*6"(6+ 7，V,1), \8 DE4*0*1(?BT?0*F:/+F:,4( ,10 =E4*0*1(? BT?46*F/)EF:/+F:,4(+ ;E ;*/=:(>*=,) F:/+F:/6E),4*/1 *1 , >(0*.> =/1? +*+4*1" /< +.",6，4/).(1(，*1/6",1*= F:/+F:,4(+，F/4,++*.> =:)/6*0(，>,"? 1(+*.> =:)/6*0( *1 4:( F6(+(1=( /< ;((6 E(,+4+［&］8 Y8 38 38 ] B#’8 K’U，’IJQ?UJ?’B 8 ［’#］71+;(6", 3，G*6"(6+ 7，96;( 9，(4 ,) 8 DE4*0*1(?BT?0*F:/+F:,4( ,10 46*? F:/+?F:,4(［&］8 Y8 38 38 ]8R#B 8IKB，’IJR?UR?KU 8 ［’K］A,X(0, 9，M,4,1,;( 3，V*4,^*>, C8 DE4*0E)*= ,=*0 0(6*P,4*P(+ ;E <(6? >(14,4*/1［&］8 G,F,1 JKJKKIU， !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ’IJK?’U?’K 8 （上接第 BU页） ! 结 论 脐血在采集后应及时分离并使用，特别是前 K 0 分离和使用。脐血保存过程中 !CD 细胞活力缓慢 下降而集落产率下降较快；而在以细胞悬液的保存 方式下 !CD细胞活力和集落产率都呈急速下降趋 势。所以：体外短期保存的过程中以脐血全血的方 式保存要优于以细胞悬液的方式保存，且不超过 K 0 为宜。单细胞因子对脐血造血细胞扩增的作用不显 著，细胞因子组合中 3DN 92?Q N2 A&Z对 DNY?D
扩增的作用最明显，而含有 -族细胞因子的组合则
集落生成能力下降较快，故在造血细胞的扩增培养
中应尽量避免 -族细胞因子的应用。培养基中添加
自体脐血血浆同胎牛血清的作用差别不大，而添加
混合脐血血浆对 !CD及 DNY?D的扩增的作用明显
优于前两者，说明脐血混合血浆应用于体外扩增培
养造血细胞具有广阔的应用前景。
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