全 文 ：脐血造血细胞体外保存及扩增的研究
景 强，熊晓辉，熊 强，陆利霞!
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 !"###$）
摘 要：研究了脐血造血细胞在 % &冰箱保存过程中单核细胞活力、造血性能的变化以及细胞因子种类、组合、不
同培养基添加成分对造血细胞扩增的影响。研究表明脐血在 % &冰箱保存应不超过 ’ (；细胞因子组合 )*+ , -./0
, +. , 123扩增 *+4/*的效果最佳；培养基体系中添加脐血混合血浆对扩增 *+4/*作用明显，脐血混合血浆的最
佳浓度为 !56。
关键词：脐血；造血细胞；单核细胞；细胞因子；体外扩增
中图分类号：7"8 文献标识码：9 文章编号："08!/’08:（!##%）#’/##%0/#0
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自 "$:$年法国的 =GEJUL@A等进行了世界上首
例脐血移植并成功的治愈了一例 +@AJCA? 贫血以
来［"］，十几年来脐血已广泛用于治疗各种患急、慢性
恶性血液病、重组免疫缺陷病以及骨髓瘤的儿童。
人脐血中富含造血干细胞和各系祖细胞，且脐血造
血干细胞具有强于骨髓和外周血的分化和长期造血
能力［!，’］，且具有来源广泛、容易获得、传染病毒的
几率小、较骨髓细胞异体反应小、移植物抗宿主反应
症状轻等优点［%］。但单份脐中所含造血干 Y祖细胞
有限，每 "## L.脐血所含的干细胞数量只能满足体
重不大于 ’# UB的患儿，成人应用因数量不足而受
到限制［5］。脐血干细胞的体外扩增可望将脐血用于
成人移植，减少冻存体积、缩短植入时间、同时也为
基因治疗提供足够的造血干细胞为靶细胞以促进其
研究和应用［0］。本实验主要考察了脐血短期保存过
程中造血细胞活力的变化，并采用不同的细胞因子
组合扩增以及添加脐血血浆扩增造血细胞，以脐血
单核细胞（W<*）为直接起始细胞，简化了操作步骤、
! 收稿日期：!##%/#%/!"
作者简介：景 强（"$8$/），男，硕士，研究方向：细胞工程。
联系人：熊晓辉，1HG：#!5/:’5:8’%#，Z/L@?G：FFD’8"0[!0’\ AHQ
9EB\ !##%
·%0·
生 物 加 工 过 程
*D?AHPH ;CEKA@G CI ]?CSKCJHPP ZAB?AHHK?AB
第 !卷第 ’期
!##%年 :月
万方数据
降低了成本，为脐血造血干祖细胞移植用于临床探
索一条适合我国国情的道路。
! 材料与方法
!"! 脐血样本的采集
脐血采自南京市鼓楼医院产房，妇幼均健康的
产妇分娩后，立即用加入肝素钠 #$ % & ’(抗凝的无
菌血袋采集脐血。
!"# 细胞因子及其来源
干细胞生长因子（)*+，,-./01/-公司）；白介素 2
（,(32，北大医学院宝赛公司）；白介素 4（,(34，北大医
学院保赛公司）；粒细胞集落刺激因子（53*)+，北大
医学院宝赛公司）；粒3巨噬细胞击落刺激因子（563
*)+，北大医学院宝赛公司）；+7.32配基（+(，89:;9<9:-
公司）；血小板生成素（=>?，89:;9<9:- 公司）。
!"2 实验方法
!"2"! 脐血单个核细胞（6@*）的分离［#］
淋巴细胞分离液密度梯度离心脐血［A］，收集
6@*，,6B6 培养基中洗涤 2 遍，台盼蓝染色计数，
要求活力!CDE。
!"2"# 脐血血浆的制备
将脐血置于 !$ ’(离心管中，F G，2 $$$ 0 & ’9-，
离心 2$ ’9-；上层血浆装入 #$$ ’(血浆瓶中，微孔
过滤除菌；分装于离心管中，于3#$ G冰箱中保存。
使用前于 F G，2 $$$ 0 & ’9- 离心机中离心 #$ ’9-，去
除冷凝蛋白后于 H4 G水浴中保温 2$ ’9-灭活，置于
室温备用。混合血浆系不同个体的脐血血浆等体积
混合而成。
!"2"2 脐血单个核细胞的体外扩增培养
细胞培养基为 #$E胎牛血清 +8)、!$ 1 & (牛血
清白蛋白、!$3F ’:7 #3巯基乙醇（#36I）、#E (3谷氨酰
胺的 ,6B6培养基，用前加入青霉素和链霉素；单核
细胞接种密度为 # J !$HK/77< & ’(，根据具体实验需要
加入不同种类或组合的细胞因子于 #F孔板中，每孔
接种密度为 # J !$HK/77< & ’(，每孔接种量为 ! ’(，于
2A G、含 HE *?#的全湿培养箱中培养，一定时间半
量换液，吸取一半的细胞和培养基进行细胞记数和
集落分析，同时补加新鲜培养基和细胞因子继续培
养。
!"2"F 造血细胞集落（*+L）分析［D］
4孔板中每孔加入 ! ’( 含有 #$E胎牛血清
（+8)）、!$ 1 & (牛血清白蛋白、!$3F ’:7 #3巯基乙醇（#3
6I）、#E (3谷氨酰胺和 $"2E进口琼脂的 ,6B6的
半固体培养基；同时添加适量的双抗及细胞因子 ,(3
2、53*)+、*63*)+各 #$ -1 & ’(。6@*接种密度为 #
J !$FK/77< & ’(，于 2A G，HE *?# 的恒湿的培养箱中
培养 !$ M !F N后。于倒置显微镜下进行集落观察
并计数，大于 H$个细胞的细胞团为一个集落（*+L）
单位。形成集落以粒3巨噬细胞集落（*+L356）为
主；另可见粒系3红系3单核3巨噬细胞集落（*+L3
5I66）和红系爆式集落（8+L3I）以及混合集落形成
单位（*+L369O）；以其总和：*+L3*（总集落）表示。
!"F 统计学分析
实验中每个样本采用 2个平行样，实验数据用
平均值 P标准方差表示［C］；组内及组间差异采用数
学软件 69K0:<:Q. IOK/7 中的单因素方差表分析，
! R !K09.为具有显著性差异。
" 结果与分析
#"! F G冰箱保存过程中的造血细胞活力的变化
新鲜脐血从医院采出后，立即进行体积测定、然
后放入一只灭好菌的盐水瓶中，从第 $ N起，每天取
出 !$ ’(脐血，进行单核细胞分离计数、活力计数和
集落分析。结果见表 !。
#"!"! 脐血于 F G冰箱中保存过程中的造血细胞
活力的变化
表 ! 脐血于 F G冰箱中保存过程中造血细胞活力的变化
=ST ! *US-19-1 :Q U/’S.:V:9/.9K K/77< ;9S79.W XU/- K:0N T7::N
K:-保存时间
& N
6@*浓度
&（! J !$4 & ’(）
细胞活力
& E
集落（*+L）
产率（ & ! J !$H）
$ A"F P $"! CC"C P 4"! !DH"! P !2"#
! A"F P $"2 CA"F P 2"# !AD"H P #4"C
# A"2 P $"! CF"F P $"C !FH"4 P 4"F
2 4"C P $"D DD"# P F"A C$"D P !H"H
F 4"F P $"C D#"4 P A"2 FF"A P !$"A
H 4"# P $"H A4"4 P D"H !D"# P !"D
4 H"C P $"2 4C"C P !$"4 $
脐血 6@*在全血保存的过程中其细胞的活力
数是缓慢下降的，到第 4 N的时候下降了 2$E左右；
同时，6@*的浓度也处于一个缓慢下降的过程，在
$34 N内变化很小；但集落生成能力变化幅度较大，
从第 # N开始，集落产率呈加速下降趋势；第 H N时，
集落产率下降到不到原来时的 ! & !$，第 4 N 的时
6@*就彻底地丧失了集落生成能力。
#$$F年 D月 景 强等：脐血造血细胞体外保存及扩增的研究 ·FA·
万方数据
!"#"! $%&细胞悬液在 ’ (冰箱保存过程中造血
细胞活力的变化
$%&分离出后加入到 )$*$培养基中，调其浓度
为 # + #,- ./001 2 34，于 ’ (冰箱中保存，结果如表 !。
表 ! $%&细胞悬液于 ’ (冰箱中在保存过程中造血细胞
活力的变化
567 ! &869:;9: <= 8/36>;. ./001 @;60;>A B8/9 .<91/C@/D
;9 )$*$ 3/D;E3 ;9 ’ ( C/=C;:/C6>
2 D
细胞活力
2 F
集落（&GH）产率
（ 2 # + #,I）
, JJ"J K !"’ #LI"# K #!"-
# MN"N K !"J #N’"L K M"’
! IJ"N K ,"L ’L"M K #I"!
N !I"’ K N"I #,"- K ’"#
’ ##", K ,"I ,
I , ,
$%&悬液在 ’ (冰箱中保存过程中，细胞活力
和集落生成能力从开始就呈下降较快，第 ’ D 时
$%&细胞活力为 ##", K ,"I F，集落产率为 ,。此
时大部分$%&已经死亡 " 第 I D时细胞完全丧失活
力，说明 ’ (冰箱中以细胞悬液的方式保存脐血造
血细胞似乎并不合理。
!"! 细胞因子对造血细胞扩增的影响
!"!"# 单细胞因子对造血细胞扩增的影响
培养体系中只加入一种细胞因子，每种细胞因
子浓度为 !, 9: 2 34，每 ’ D半量换液培养两周后考
察其 $%&及 &GHO&的扩增情况，结果如图 #。
图 # 单细胞因子对 $%&扩增的影响
G;:P# Q==/.>1 <= D;==/C/9> .A>
由图 # 可知，几种因子中 TO&UG 和 T$O&UG对
$%&的扩增作用最为明显，可见 T组细胞因子更有
利于 $%&总细胞的扩增，其他几组差别不明显，其
中 G4和 )4O-对 $%&的扩增效果稍差。综合看来，
几种细胞因子单独使用时 $%&的扩增倍数都不大，
均不超过 I 倍。单因素方差分析结果为 ! V J"#L#
L#L W !.C;> V N"L-I JML，说明不同单细胞因子对 $%&
的扩增的影响具有显著性差异。
扩增前和培养后收集细胞做造血细胞集落分
析，结果如图 !。
图 ! 单细胞因子对 &GHO&扩增的作用
G;:P! Q==/.>1 <= D;==/C/9> .A>
这几种细胞因子中，)4ON对 &GHO&扩增的影响
最大，达到了 #!"! K ’"# 倍；TO&UG 和 T$O&UG 对集
落产率的影响略低于 )4ON；)4O- 对 &GHO&扩增的作
用最低。只扩增了 -"# K ,"M 倍。单因素方差分析
结果为 ! V #’"M L,! W !.C;> V !"L’M M!M，说明不同单
细胞因子间对 &GHO&的扩增作用具有显著性差异。
!"!"! 不同细胞因子组合对脐血造血细胞体外扩
增影响
单细胞因子对脐血造血细胞的作用较小，在细
胞因子协同的作用下则可达到较大扩增。在单细胞
因子的基础上寻找有效的细胞因子组合成了下一步
工作的关键。根据文献资料及以往工作经验，造血
细胞的体外扩增都需要 U&G；同时，)4ON及 T族细胞
因子的应用都存在一定的争议。本研究基于这一原
则，考察了含有 )4ON和 T族细胞因子的组合同其他
组合的区别，采用如下细胞因子组合，见表 N。
表 N 不同细胞因子组合
567 N *;==/C/9> .A>
第二组 Z O Z O O Z
第三组 Z O O Z O Z
第四组 Z Z O O Z Z
第五组 Z O Z O Z Z
第六组 Z O Z Z Z O
·’L· 生物加工过程 第 !卷第 N期
万方数据
共六组细胞因子，每种细胞因子的质量浓度为
!" #$ % &’，将 ()*接种于 !+ 孔板中，接种密度为 !
, -". % &’ ，每 / 天半量换液，换液后收集的细胞作
计数和集落分析，结果如图 /。
—!—第一组；—"—第二组；—#—第三组
— ,—第四组；—$—第五组；—%—第六组
图 / 不同细胞因子组合扩增 ()*的效果
01$2/ 3445678 94 :1445;5#7 6<79=1#58 69&>1#?719#8 9# ()* 5@A?#B
819#
各细胞因子组合对培养三周后 ()*扩增的作
用差异不显著，其中 C*0 D E’BF D GHI这一组合得到
的扩增倍数最低，扩增 /JK! L MK.倍；最高组为 C*0
D GHI D N(B*C0组，扩增了 .-K" L -+KO倍；()*细
胞在在前 /天扩增倍数较小，可能是因为造血细胞
大部分处于静止休眠（N"）期，由于细胞因子的刺激
作用而走出 N"期而开始进入增殖期（N-）期开始分
裂增殖需要一定的时间，在 + P -. :内 ()*扩增的
速度逐渐加快，-. :以后细胞扩增速度开始放缓，
此时脐血 ()*细胞已进入相对稳定生长期；如在生
物反应器中放大培养脐血造血细胞，可选择培养 +
P -. :时的 ()*细胞作为细胞来源。
每 / :半量换液收获细胞做集落分析，结果如
图 +。
脐血造血细胞在培养过程中其 *0QB* 经历一
个上升到一定阶段后又逐渐下降的过程。第六组在
第 J :时达到最大扩增倍数 -MKF L .K.倍，然后就逐
渐下降，到第 !- :时只有原来的 +KJ L "K!倍，其从
第 J :开始 *0QB*的整体趋势是逐渐下降的；第三
组同样具有这种特征，其在第 J :的时候 *0QB*提
高到 !-KO L -K/倍，然后缓慢下降至第 -! :的 -OK-
L "KM 倍，第 -. :的时候快速下降到 MK+ L "K. 倍，
最后为 !K! L "K- 倍。这两组虽然总细胞的扩增同
其他组差异不大，但其集落形成能力在一定时间后
呈现一个逐渐下降的趋势，值得注意的是：这两组都
含细胞因子 N(B*C0，引起上述现象的原因可能是
N(B*C0促进了造血细胞分化的原因。
—!—第一组；—"—第二组；—#—第三组
— ,—第四组；—$—第五组；—%—第六组
图 + 不同细胞因子组合扩增 *0QB*的效果
01$2 + 3445678 94 :1445;5#7 6<79=1#58 $;9RA8 9# 7S5 5@A?#819# 94
*0QB*
第五组效果最好，*0QB*的扩增是一个逐渐上
升的过程，并一直持续到 -M :后稍有回落，这一组
合能较好地维持造血细胞的集落形成能力，抑制其
过度分化并得到较高的扩增倍数，说明这种细胞因
子组合对于脐血造血细胞的扩增较为有利。
!K/ 不同培养基添加成份对造血细胞扩增的影响
实验中选取 +个组，分别为：空白对照组、添加
!"T的胎牛血清、!"T自体脐血血浆、!"T混合脐血
血浆，细胞因子组合为 C*0、E’BF、0’、GHI各 !" #$ %
&’。!+孔板中培养两周，每周半量换液，同时计算
细胞扩增倍数并进行集落分析，结果见图 .。
!K/K- 不同培养基添加成份对造血细胞扩增的影
响
由图 .可以看出，空白对照组的 ()*的扩增倍
数均明显低于其他 /个组合；添加 !"T的胎牛血清
和添加自体脐血血浆的组合差别不大，前者略高，两
者在培养的第 !周分别扩增了 -FK! L "KJ及 -.KO L
!K-倍；添加混合脐血血浆的组合扩增效果比前两
者稍高、达到了 -JK" L +KO 倍。本实验说明添加混
合脐血血浆更有利于 ()*的扩增。
每周半量换液后分离出细胞的进行集落分析，
结果如图 F。
!""+年 M月 景 强等：脐血造血细胞体外保存及扩增的研究 ·+J·
万方数据
图 ! 不同培养基添加成份对 "#$扩增的影响
%&’(! )**+,-. /* 012&/3. 4+5&34 2+67+8&.94+8- /8 -9+ +:618.&/8 /*
"#$
图 ; 不同培养基添加成分对 $%<=$扩增的影响
%&’(; )**+,-. /* 012&/3. 4+5&34 2+67+8&.94+8- /8 -9+ +:618.&/8 /*
"#$
空白对照组的 $%<=$ 的倍数明显低于其他 >
组；胎牛血清和自体脐血血浆对 $%<=$扩增效果相
近，而混合脐血血浆的作用较前两者明显，可能是因
为胎牛血清和自体血浆含有的造血生长因子的量不
足，而混合血浆中的各种未知造血生长因子更丰富
从而能够更有效地刺激非同型造血细胞体外扩增的
原因。
?@>@? 不同浓度混合脐血血浆对造血细胞扩增的
影响
选择培养基中添加混合脐血血浆的体积分数分
别为 !A、BCA、B!A、?CA、?!A、>CA、>!A；体外扩
增培养 "#$ BC 5时收获细胞并进行集落培养，考察
其扩增情况，结果如图 D。
图 D 不同浓度混合脐血血浆对 "#$扩增的影响
%&’( D )**+,-. /* 012&/3. ,/8,+8-21-&/8 /* 4&:+5 $EF /8 -9+ +:618=
.&/8 /* "#$
由图 D可以看出：混合脐血血浆含量较低的时
候 "#$的扩增倍数也较小，随着其浓度的上升，
"#$的扩增倍数也呈现出一个逐渐上升的趋势，在
浓度为 ?!A的时候出现拐点，此时 "#$ 扩增了
BG@C H I@B倍，比最低组含量为 !A的混合血浆组高
出 >D@IA。随后逐渐下降。提示对于脐血 "#$的
扩增，混合脐血血浆的浓度以 ?!A为最佳。"#$的
扩增倍数随着在混合脐血血浆浓度的不断上升而随
之增加，达到 ?!A的时候开始有所下降，可能是由
于在其浓度低于 ?!A的时候，混合脐血血浆内刺激
造血的成份占主导作用因素，但随着其所占比例的
上升，超过一临界值后，培养基营养成分成为了主要
限制因素，扩增倍数开始下降。方差分析表结果为
! J B?@DI I!? K !,2&- J >@BC! GD!，说明不同浓度混合
脐血血浆对 "#$扩增的效果具有显著性差异。收
获的细胞做集落分析，结果如图 G。
图 G 不同浓度混合脐血血浆对 $%<=$扩增的影响
%&’(G )**+,-. /* 012&/3. ,/8,+8-21-&/8 /* 4&:+5 $EF /8 -9+ */75
+:618. &/8 /* $%<=$
由图 G 可以看出，脐血混合血浆浓度和 $%<=$
的扩增无明显对应关系，其浓度为 ?!A的时候 $%<=
$的扩增倍数最大，达到 ?>@! H C@G 倍。方差分析
结果为 ! J D@DG; GBI K !,2&- J >@BC! GD!，说明不同
浓度混合脐血血浆各组之间对脐血造血细胞扩增的
影响具有较显著性差异。 （下转第 !!页）
·!C· 生物加工过程 第 ?卷第 >期
万方数据
和温度通过影响酶分子与底物分子的解离状态以及
酶蛋白的构象改变反应进程、影响反应得率，均存在
最适值。!"# $是 %!&（糖酵解途径）中酶系的辅助
因子，对酵母酶系具有较优的活化作用，作为激活
剂，!"# $只需极少量就可以使酶表现出较高的催化
活性。
参考文献：
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>(14,4*/1［&］8 G,F,1 JKJKKIU，
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’IJK?’U?’K 8
（上接第 BU页）
! 结 论
脐血在采集后应及时分离并使用，特别是前 K 0
分离和使用。脐血保存过程中 !CD 细胞活力缓慢
下降而集落产率下降较快；而在以细胞悬液的保存
方式下 !CD细胞活力和集落产率都呈急速下降趋
势。所以：体外短期保存的过程中以脐血全血的方
式保存要优于以细胞悬液的方式保存，且不超过 K 0
为宜。单细胞因子对脐血造血细胞扩增的作用不显
著，细胞因子组合中 3DN $ 92?Q $ N2 $ A&Z对 DNY?D
扩增的作用最明显，而含有 -族细胞因子的组合则
集落生成能力下降较快，故在造血细胞的扩增培养
中应尽量避免 -族细胞因子的应用。培养基中添加
自体脐血血浆同胎牛血清的作用差别不大，而添加
混合脐血血浆对 !CD及 DNY?D的扩增的作用明显
优于前两者，说明脐血混合血浆应用于体外扩增培
养造血细胞具有广阔的应用前景。
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