全 文 ：·1684· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月
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当归多糖对脐血造血细胞冷冻损伤的可恢复性研究
杨 慧，吴 宏
(重庆医科大学干细胞与组织工程研究室，组织胚胎学教研室，重庆400016)
摘 要：目的探讨当归多糖(APS)是否具有恢复脐血造血细胞冷冻损伤的作用及与造血生长因子(HGFs)联
合促进冷冻复苏后脐血单个核细胞(MNC)体外扩增的效应。方法将冷冻30d的脐血MNC复苏后，立即在常
规培养体系中分别加入APS0、50、100、200、400pg／mL，或同时加入HGFs组合，培养24h或1d，采用MNC计
数，台盼蓝拒染实验、MTT法、CFU—Mix集落形成实验以及流式细胞术计数CD34+细胞等方法分别观察APS促
进冷冻损伤的脐血造血细胞恢复的能力以及APS联合HGFs对脐血造血细胞的扩增能力。结果冷冻复苏后加
入一定质量浓度的APS可使脐血MNC数量与台盼蓝拒染率明显增加，造血细胞的增殖能力显著提高，CFU—Mix
集落产率明显提高(P<0．05)。且能明显提高冻存脐血MNC中CD34+细胞率(P联合HGFs可显著提高冷冻复苏后的脐血MNC扩增倍数及CFU-Mix集落产率(尸关系。结论APS能提高冷冻复苏后脐血造血细胞的活力、增殖能力以及CD34+细胞率，可促进脐血造血细胞冷
冻损伤的恢复；与HGFs联合可促进冷冻复苏后的脐血MNC体外扩增。
关键词：当归多糖(APS)；脐血；造血细胞I冷冻保存
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)11—1684—05
EffectofAPSonrecoverableabilityfromcryopreserVationdamage
OfUCBhematopoieticcells
YANGHUi．WUHong
(LaboratoryofStemCellandTissueEngineering．DepartmentofHistologyandEmbryology，
ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China)
Abstract：ObjectiveTostudytheffectofangelicapolysaccharides(APS)onrecoverableabi ity
fromcryopreservationdamageofumbilicalcordblood(UCB)hematopoieticcellsandAPSwith
hematopoieticgrowthfactors(HGFs)oninvitroexpansionofUCBmononuclearells(MNC)after
thawing．MethodsT‘ awedUCBMNCwerecultured24hor14dwithvariousconcentrationofAPS(O，
50，100，200，and400pg／mL)orwithAPSandHGFs．TheMNCcountingassay，typanblueexclusion
assay．colorimetricMTTassayforcellproliferation，CFU—Mixcolong—formingassay，andflowcytometry
forCD34+cellrateweredetected．ResultsAfteraddingcertainco centrationAPSinthawedUCBcells，
收稿日期：2008—01—08
作者简介：吴 宏(1963一)，女，浙江义乌人。硕士，教授，主要研究方向为干细胞生物学以及中药有效成分对血细胞发生及调控的影响·
发表相关论文20余篇，研究成果获重庆市人民政府自然科学三等奖和中国中西医结合学会科学技术三等奖．
Tel：(023)68485050E—mail：wuhon96368@126．com
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阻
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万方数据
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thenumberofMNC，therateoftrypanbluexclusion，theproliferationofMNC，andthecolony
productionofCFU—Mixweresignificantlye hanced(P<0．05)．ThepercentagofCD34+cellsinUCB
wasmarkedlyhigherthanthatofcontrolgroup(PHGFscouldsignificantlyr isehexpansionfolda dthecolonyproductionofCFU—MixofthawedUCB
hematopoieticcells(PfreezingrecoverableabilityofUCBhematopoietiecells．AndAPScombinedwithHGFscouldpromotethe
invitroexpansionofhematopoieticcellsafterthawed．
Keywords：angelicapolysaccharides(APS)；umbilicalcordblood(UCB)；hematopoieticcells，
cryopreservation
广泛地开展脐血造血干细胞移植必需建立脐血
库，因而需长期低温保存脐血造血细胞，这使得脐血
造血细胞必然要经历进入深低温状态和复苏两个过
程，因此将不可避免地引起细胞理化性质的变化，这
可能影响脐血造血细胞的生物特性，尤其是增殖能
力[1]。既往研究证明当归多糖(angelicapo ysac—
eharides，APS)是当归中促进造血的有效成分，
APS在体内外均能刺激造血干／祖细胞(HSPC)的
增殖和分化[2]。在有外源性造血生长因子(HGFs)
存在的条件下，APS可促进脐血单个核细胞
(MNC)总数、CFU—GM、CFU—E集落数量增多，且
可使脐血单个核细胞形成大量基质细胞贴壁口]。本
实验深入研究在冷冻复苏后的脐血MNC中加入
APS是否能促进冷冻损伤的造血细胞的复苏、增
殖，提高造血细胞冷冻损伤的可恢复性，以期为
APS在造血细胞冷冻保护中的应用提供实验依据。
l材料
1．1实验标本：所有实验标本脐血来源于重庆医科
大学附属第二医院妇产科。脐血收集适应证参考
Thierry等介绍的标准[4]。
1．2药品与试剂：APS，重庆医科大学化学教研室
分离、提取、纯化(质量分数>90％)。淋巴细胞分离
液，上海华精生物高科技有限公司产品。明胶、L一谷
氨酰胺、甲基纤维素、二甲基亚砜(DMSo)、MTT，
美国Sigma公司产品。RPMI一1640培养基，美国
Gibco公司产品。马血清、胎牛血清(FBS)，美国
Hyclone公司产品。2一巯基乙醇，上海化学试剂采购
供应站进口分装。重组人粒一巨噬细胞集落刺激因子
(rhGM—CSF)，日本麒麟株式会社产品。重组人白细
胞介素一3(rhlL一3)、重组人粒细胞集落刺激因子
(rhG—CSF)、干细胞生长因子(SCF)，中国军事医学
科学院基础研究所提供。红细胞生成素(EPO)
Amgen公司产品。FITC标记的小鼠抗人CD34抗
体、FITC标记的小鼠IgG2a(阴性对照)，美国BD
公司产品。
2方法
2．1 脐血MNC的分离：所有脐血标本均在采集
6h内分离。分离方法为明胶法，即采集脐血后用
PBS(1：1)稀释，与37℃3％明胶溶液等比混合，
室温下静置30rain，吸取血浆层，以2000r／min离
心10rain，弃上清液后用PBS重悬。按1：1的比
例加到淋巴细胞分离液表面，然后以2000r／min
离心25rain。离心后轻轻吸取中间白膜层，再用
RPMI一1640培养液洗涤2次，重新悬浮即得到脐血
MNC悬液。
2．2脐血MNC的冷冻保存：冻存时临时配制冷冻
保护液(其中DMSO及FBS终体积分数分别为
5％和20％)。将等体积的MNC悬液和冷冻保护液
分别装入两支试管中，置冰水杯中预冷。待温度平衡
后，将冷冻保护液缓慢加入细胞悬液中。体系配制后
装入低温冷冻管中，在4℃冰箱中平衡30rain，依
次转入一20℃冰箱，液氮冻存罐中的气相空间过
夜，最后投入液氮(一196℃)中保存。
2．3 脐血MNC的融冻与复苏：将冻存30d的
MNC从液氮中取出，迅速置于40℃水浴中复温至
全部融化(3rain内完成)，用含10％FBS的
RPMI一1640培养液[含不同质量浓度的APS(终
质量浓度分别为50、100、200、400ttg／mL)]缓慢稀
释10倍，1500r／rain离心10rain，弃上清液，用
RPMI一1640培养液洗涤2次待用。
2．4实验分组：将脐血标本用明胶分离法分离出脐
血MNC(见2．1项)，按2．2项冷冻保存脐血MNC
30d。
2．4．1将冷冻30d的脐血MNC复苏后随机分成
5组：APS50、100、200、400#g／mL组和对照组。在
含10％FBS的RPMI一1640培养液中分别加入不
同质量浓度的APS，对照组加入等量的RPMI-1640
培养液，置于37℃、5oACO：、饱和湿度的培养箱中
培养24h，测定并比较各组MNC数，台盼蓝拒染
率，增殖能力(MTT法)，脐血混合集落形成单位
万方数据
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(CFU—Mix)集落产率(体外半固体培养法)和
CD34+细胞率(流式细胞术)。从而观察APS促进
冷冻损伤的造血细胞恢复的能力。
2．4．2将冷冻复苏后的脐血MNC随机分成5组：
APS50pg／mL+HGFs组、APS100弘g／mL+
HGFs组、APS200pg／mL+HGFs组、APS400
pg／mL+HGFs组和对照组(HGFs组)；HGFs包
括：SCF、IL一3、GM-CSF、G—CSF、EPO，同时在每组
分别加入不同质量浓度的APS，对照组仅加入
HGFs，不加APS。在含30％FBS的RPMI一1640培
养液中，置于37℃、5％C0：、饱和湿度条件的培养
箱中培养14d，测定并比较各组MNC数、CFU—
Mix集落产率(体外半固体培养法)和CD34+细胞
率(流式细胞术)。从而了解APS联合HGF对脐血
造血细胞的扩增能力。
2．5脐血MNC计数：用常规方法进行脐血MNC
计数。
2．6台盼蓝拒染实验：先取9滴MNC悬液移入小
离心管中，再加入1滴0．4％台盼蓝溶液，混匀，在
3rain内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。
镜下观察死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染。计算台
盼蓝拒染率(活细胞率)[台盼蓝拒染率=活细胞
总数／(活细胞总数+死细胞总数)×100％]。
2．7 MTT比色试验：复苏后的脐血MNC用含
10％FBS的RPMI一1640培养液(含不同质量浓度
的APS)配成细胞悬液，同时设立对照组，以每孔
2．8 CFU—Mix体外培养与计数：按常规方法略有
改进。甲基纤维素体系中依次加入2一ME1×10叫
mol／L、3％L一谷氨酰胺、马血清、EPO、IL一3、GM—
CSF、2×106个脐血MNC、0．9％甲基纤维素，总体
积2mL，充分混匀后，接种于96孔板，每孔0．2
mL，置于37℃、5％CO：、饱和湿度的培养箱中培养
14d后，于倒置显微镜下计数每孔CFU—Mix集
落数。
2．9流式细胞术检测脐血CD34+细胞百分率：将
分离的脐血MNC悬液分成两管，一管加FITC标
记的CD34抗体，另一管加入FITC标记的小鼠
IgG2a(设为对照)，用流式细胞仪定量检测CD34+
细胞百分率。
2．10脐血造血细胞体外扩增：培养体系为含有
30％FBS的RPMl一1640培养液；HGFs的终质量
浓度分别为SCF：100ng／mL，IL一3：2ng／mL，
GM—CSF：40ng／mL，G—CSF：20ng／mL，EPO：2
U／ml；各APS组加入不同质量浓度的APS(50、
100、200、400／zg／mL)。设立对照组不加APS，只加
HGFs。MNC浓度为2×106／mL，置于24孔培养板
中，每孔1mL，复种3孔，于37℃、5％CO。、饱和湿
度的培养箱中培养14d，每周半量换液，进行细胞
计数和流式细胞仪检测。
2．11统计学方法：所获数据经SAS8．2统计软件
进行方差分析和t检验。
3 结果
1×103～1×10‘个细胞接种于96孔培养板中，每孔3．1 APS对冻存复苏的脐血MNC数量、活细胞
体积200弘L，每组复种3孔。将培养板放入37℃、率和增殖能力的影响：检测冻存复苏后脐血MNC
5％CO孙饱和湿度的培养箱中培养24h，先离心弃 的数量、活细胞率和增殖能力，结果显示：APS100、
培养液后加入无血清的培养液，每孔加入MTT溶 200pg／mL组的脐血MNC数量、台盼蓝拒染率和
液(5mg／mL)20肛L，37℃继续孵育4h，终止培 A值与对照组比较，差异有统计学意义(尸<0．05)，
养，1 000r／min离心5rain，后弃去孔内培养液，每 但作用无明显量效关系(表1)。
孔加入150弘LDMSO，震荡10rain。选择490am 3．2 APS对冻存复苏的脐血CFU-Mix集落产率
波长，在酶标仪上测定各孔吸光度(A)值。 和CD34+细胞率的影响：检测冻存复苏的脐血
裹1 APS对冻存复苏的脐血MNC数■、活细胞率、增殖能力、CFU—Mix集落产率、CD34+细胞率的影响(；士s，矗=9)
Table1 Eff∞tofAPSonnumber，viability，andreproductiveact ity，platingefficiencyofCFU-Mix，
andpencentageofCD34+cellofUCBMNCafterc yopreservatedG+s，库一9)
与对照组比较。。P<0．05
。P<0·05wcomrolgroup
万方数据
中年喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月· 687·
CFU—Mix集落产率和CD34+细胞率，结果显示APS
100／-g／mL组的脐血CD34+细胞率明显高于对照组
(P<0．05)；APS100、200Pg／mL组的脐血CFU—
Mix集落产率明显高于对照组(P<0．05)，见表1。
3．3 APS联合HGFs对冷冻复苏的脐血造血细胞
体外扩增的影响：对冷冻复苏后的脐血造血细胞在
体外扩增，14d后计数MNC数、CFU—Mix数和
CD34+细胞率。结果显示：APS100／19／mL+HGFs
组和APS200pg／mL+HGFs组MNC数和CFU—
Mix数在扩增后明显高于对照组(尸<0．05)；APS
400／比g／mL+HGFs组CFU—Mix数明显低于对照
组(P<0．05)iAPS各组和对照组相比CD34+细胞
率差异无显著性(P>0．05)，见表2。
裹2 APS对冷冻复苏的脐血造血细胞体外扩增的影响
(i±$，拜一5)
Table2 EffectsofAPsonin俯rDexpansion
ofUCBhematopoleticcellsafter
cryopreservated(；士$，辟=5)
组剧 MNC敦(×108)CFU—Mix／孔CD34+!tlll$／，《
与对照组比较：。P<0．05
。P<0．05tBcontrolgroup
4讨论
长期的临床实践证明，脐血造血干细胞是治疗
白血病、恶性肿瘤、重型地中海贫血等多种疾病的有
效方法，提高脐血干细胞冻存后的回收率和克隆形
成能力具有重要的临床意义。近年来低温保存技术
已取得很大的进展，如使用程序降温仪控制冻存温
度，改良冷冻保护剂，或在冻存液中加入膜稳定剂和
生物抗氧化剂，均能显著改善细胞回收率[5’6]。尽管
如此，复苏后24h内仍有相当比例的冻存细胞死
亡。研究发现，细胞冷冻过程中在外界因素的作用
下，如氧化应激反应、渗透性损伤、Na+，K+一ATP酶
抑制导致离子内环境紊乱等，均可导致细胞的损伤。
低温保存细胞是否成功首先看复苏后细胞的数
量和存活率，在保证数量和存活率的基础上再进一
步探讨如何更好地使冻存细胞在复苏后能执行其正
常功能。冻存复苏后的脐血MNC，立即加入不同质
量浓度的APS共同培养24h后检测脐血MNC的
数量，旨在了解APS能否促进冷冻复苏的脐血
MNC数量的恢复。实验结果显示一定质量浓度的
APS能使冻存复苏后的脐血MNC数量明显增加。
可能的原因有：①在细胞冻存和复苏过程中最容易
受损的是细胞膜，细胞膜对于低温有高度的敏感性，
是细胞受到低温损伤的主要部位。在降温过程中由
于细胞外溶质的浓缩，细胞处于一个高渗透压状态，
细 膜存在一定的损害甚至完全破裂，其通透性较
正常时略高。细胞在复苏过程中，要经过与冷冻过程
相反的变化，细胞从高渗状态回到正常渗透压时导
致细胞外水分内流，使细胞膨胀乃至破裂。商澎等[7]
从新鲜当归中分离纯化得到当归多糖亚组分
AP一0、AP一1、AP一2、AP一3，并分别测定了各组分中
的总糖、糖醛酸、蛋白质的量及其单糖组分和糖苷键
的构成，证明APS主要由葡萄糖、阿拉伯糖、少量糖
醛组成。在复苏过程冲洗的培养液中加入一定浓度
的葡萄糖，可以减少渗透性休克，将细胞放人一种接
近等渗、含有非渗透性溶质(如蔗糖)的溶液中，使
低温保护剂扩散出细胞的同时，能够保持细胞不发
生肿胀。故在本研究中，在细胞冲洗和培养中均加入
不同质量浓度的APS，可能在细胞表面形成一层保
护层，稳定细胞膜从而保护了细胞。②既往的研究已
经证实：APS可促进人红系、粒单系及混合系造血
祖细胞的增殖分化，故推测APS使冷冻复苏后脐血
MNC数量增加的原因可能也与APS促进了脐血
MNC的增殖有关。台盼蓝拒染实验结果显示APS
在增加脐血MNC数量的同时，也保证了细胞的存
活率。MTT实验结果再一次证明适宜浓度的APS
能增强冷冻复苏MNC的活性和增殖能力。
CFU—Mix是由一个多潜能干／祖细胞发育成熟
的多系细胞集落，具有造血干细胞的部分功能，但比
最原始的造血干细胞趋向成熟。单位种植细胞数量
形成的CFU—Mix集落数可间接反映细胞群中早期
HSPC数量及其生物学活性，体外半固体培养方法
为检出HSPC提供了方便，同时为观察HSPC自我
更新和多向分化能力提供了可能性。本研究采用体
外CFU—Mix集落半固体培养，检测在冷冻复苏后，
立即加入APS共同培养的脐血造血细胞中HSPC
的数量及生物学活性。结果证明了适宜质量浓度的
APS不仅能够增加脐血MNC数和活细胞率，而且
还能增加或恢复脐血MNC中造血干／祖细胞的数
量或活性。在此基础上通过流式细胞术研究APS是
否作用在CD34+细胞阶段，实验结果表明APS在
使冷冻复苏的脐血MNC数量和活性得到提高和恢
复的同时，也使CD34+细胞数得到提高。对于脐血
移植中HSPC的回输有两种观点[8]：一种是复苏后
不经任何处理，直接快速地输给患者，主要是担心处
万方数据
·1688· 中草喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月
理过程会增加HSPC的丢失，从而影响患者的造血
恢复；另一种是要求洗去冷冻保护剂后回输，认为冷
冻保护剂对人体可能有一定程度的副作用。本研究
提示；洗去冷冻保护剂和在体外与APS共培养的过
程，不但不会造成造血细胞数量的减少，还能提高
CD34+细胞的量。故认为回输时洗去冷冻保护剂并
在体外和适宜质量浓度的APS共同培养，可能更有
利于造血的恢复。
体外扩增是克服脐血干细胞数量不足，限制其
应用的主要途径[9’10。，联合多种HGFs选择适宜的
培养条件及扩增时间，可以在有效地扩增其数量的
同时保证其质量。APS能否和HGFs发挥协同作
用，增强脐血造血细胞冷冻后的扩增潜能，值得进一
步探讨。本实验以冷冻复苏的脐血MNC作为培养
的起始细胞，加入不同质量浓度的APS联合HGFs
组合(SCF+IL-3+GM—CSF+G—CSF+EPO)进
行体外扩增。实验结果说明适宜质量浓度的APS能
与HGFs组合发挥协同作用，促进冷冻复苏后的脐
血造血细胞的体外扩增。但CD34+细胞率增加不明
显。Gilmore等口1]认为，用SCF联合lL一3、IL一6、
GM—CSF等扩增脐血CD34+细胞，主要导致造血干
细胞发生分化，而不是增殖；APS在实验中可能和
以上细胞因子发生了协同作用，促进CD34+细胞发
生的分化效应强于增殖效应，从而导致CD34+细胞
率变化不显著；也可能是CD34+细胞的扩增和
MNC的扩增不同步，造成了CD34+细胞在MNC
的比例发生了不同步的变化，从而各个组CD34+细
胞率变化不明显。
综上所述，APS能促进冷冻脐血造血细胞的复
苏、增殖，提高脐血造血细胞冷冻损伤的可恢复性。
且能与HGFs协同，提高冷冻复苏的脐血造血细胞
的体外扩增潜力。但其作用机制有待进一步研究。
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龙葵碱对人肝癌HepG2细胞Ⅳ一乙酰基转移酶活性的影响
高世勇1”，季宇彬1’2
(1．哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心药物研究所博士后科研工作站，黑龙江哈尔滨150076}
2．国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，黑龙江哈尔滨 150076)
摘要：目的探讨龙葵碱对HepG2细胞Ⅳ一乙酰基转移酶(NAT)活性的影响。方法采用HPLC方法，以2一氨
基芴(2．AF)为底物，以2-AF被NAT乙酰化为2一乙酰氨基芴(2一AAF)的量来反应NAT的活性。结果龙葵
碱能显著降低HepG2完整细胞NAT的活性；龙葵碱能够降低HepG2细胞质内NAT的活性，作用具有剂量依赖
性。结论 龙葵碱通过抑制HepG2细胞NAT的活性发挥细胞毒作用。
关键词：龙葵碱；HepG2细胞IN-乙酰基转移酶(NAT)
中图分类号：R286．91 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)11—1688一04
收稿日期：2008—05—14
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30400591)-黑龙江省自然科学基金资助项目(D2004—13)，哈尔滨市青年基金资助项目
(2004AFQXJ035)
作者简介：高世勇(1975一)．男，博士．副研究员，研究方向为肿瘤药理学．Tell(0451)84800297E—mail：syga02002@163．com
万方数据
当归多糖对脐血造血细胞冷冻损伤的可恢复性研究
作者： 杨慧， 吴宏， YANG Hui， WU Hong
作者单位： 重庆医科大学,干细胞与组织工程研究室,组织胚胎学教研室,重庆,400016
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(11)
被引用次数： 2次

参考文献(11条)
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引证文献(2条)
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