全 文 ：文章编号:1007-4287(2008)05-0602-05
墓头回诱导脐血基质细胞生长促粒-单系和
红系造血祖细胞集落形成的研究
马海珍 ,赵　丽 ,刘　蓓 ,陈　轩
(兰州大学第一医院 血液科 ,甘肃 兰州 730000)
摘要:目的　研究中药墓头回对脐血基质细胞促粒-单系和红系造血祖细胞集落形成的影响。方法　收集 12 例
脐血单个核细胞(MNC), 加入不同浓度的墓头回水提物共培养 14 天 ,基质细胞层形成后 ,消化 , 计数;收集基质细胞最
多浓度的上清液(MTH-PSCS), 以不同比例与MNC共同加入集落培养基中共培养 14 天 , 计数粒-单系和红系造血祖细
胞集落数。结果　0.01μg/ml的墓头回与 MNC 共孵育 14 天后 ,基质细胞的数量(14±2.8)×105/ ml明显多于对照组
(9±2.2)×105/ml。0.01 μg/ml的MTH-PSCS 以 0 、5、10 、20 比例作用后 ,脐血粒-单系造血祖细胞集落数分别为 17±6、
121±24 、268±27 、114±31、68±11 , 10%的MTH-PSCS 作用最为明显;脐血红系造血祖细胞集落数分别为 38±12 、72±
23、81±9、159±45、90±32 ,其中以 20%的MTH-PSCS 作用最为明显。结论　中药墓头回可诱导脐血基质细胞的生长 ,
可以促进粒-单系和红系造血祖细胞集落的形成。
关键词:墓头回;基质细胞;脐血;集落
中图分类号:R446.11 文献标识码:A
The effect of ixeritis herba induced stromal cells proliferation and contributed colony formation of CFU-GMand CFU-E pro-
genitor in umbilical cord blood　MAHai-zhen , ZHAO Li , LIU Bei , et al.(Hematology Department of the Finst Hospieal of Lanzhou
University , Lanzhou 730000 , China)
Abstract:Objective　To study the effect of ixeritis herba inducing stromal cells proliferation and enhancing CFU-GM and CFU-
E progenitor colony formation in umbilical cord blood.Methods　After umbilical cord blood gathered , the blood was separated with
mononuclearcells separating medium into umbilical cord blood mononuclearcells.Different concentration of ixeritis herba aqueous ex-
tract and the mononuclearcells cohabited for 14 day , then the cells adhered to culture flask was numbered after digestion with trypsin.
After gathering supernant of ixeritis herba cohabited with mononuclearcells for 14 day , the supernant that was dilluted to 5 , 10 , 20%
respertively with contain of mononuclearcells was added to clony culture media.And 14 days late , CFU-GM and CFU-E progenitor
colonys were numbered under microscope.Results　Ixeritis herba of 0.01μg/ml notedly increased the stromal cells number up to(14
±2.8)×105/ ml , compared to the control group number of(9±2.2)×105/ml , as others concentration of ixeritis herba not.Cohabit-
ed with MTH-PSCS ,which was supernant got from Ixeritis herba of 0.01μg/ml cohabited with nononuclearcells , at the concentration of
5 , 10 , 20% for successive 7 days , CFU-GM progenitor colony number was up to 121±24 , 268±27 , 114±31 , 68±11 , whereas the
control group is 17±6 , and the CFU-E was up to 72±23 , 81±9 , 159±45 , 90±32 but the control group is 38±12 , respectively.
MTH-PSCS with concentration of 10 % increased CFU-G group number mostly as 20 % to CFU-E.MTH-PSCS with concentration of
10 % increased CFU-GM group number mostly as 20 % to CFU-E.Conclusion　Ixeritis herba can induce stromal cells proliferation
and enhance CFU-GM and CFU-E progenitor colony formation in umbilical cord blood.
Key words:ixeritis herba;stromal cells;umbilical cord blood;Colony
(Chin J Lab Diagn , 2008 , 12:0602)
　　造血微环境是造血干/祖细胞定殖 、分化 、发育
和成熟的场所 ,基质细胞是造血微环境的主要成份 。
基质细胞通过与造血干/祖细胞直接接触 、分泌多种
造血生长因子和细胞外基质参与正常的造血调
控[ 1] 。人脐血中的造血干细胞较外周血和骨髓中的
更原始 ,具有来源广泛 ,采集方便 ,植活高和长期造
血重建的特点 ,且移植后移植物抗宿主病轻而移植
物抗白血病效应并不降低 ,已成为新的造血干细胞
来源[ 2 ,3] 。所以对于脐血基质细胞的诱导生成也成
为脐血在促造血研究方面的一个研究方向 。对于血
液病的中药治疗包括复方和单味药物的治疗已有大
量的报道 ,中药由于具有多种化学成分 ,因此具有广
泛的调节作用。有人发现墓头回体外试验对急性粒
细胞白血病及慢粒急性变有直接杀伤作用[ 4] ,但对
于墓头回在造血方面的研究很少 ,本课题探讨了中
药墓头回对于脐血基质细胞的生成及其促造血的影
—602— Chin J Lab Diagn ,May , 2008 ,Vol 12 ,No.5
响。
1　材料与方法
1.1　实验材料
1.1.1　主要仪器设备　倒置显微镜 OPTON IM 35
由日本 OPTON 公司提供;CO2 培养箱 Heraeus
BB16uv/BB5060uv 由 ThermoForma 公司提供;Beck-
man 8A014台式水平离心机由美国 Beckman 公司提
供;超净工作台 YS-875均由吴江市净化设备总厂提
供。
1.1.2　主要试剂　淋巴细胞分离液(1.077 g/ml),
由上海华精生物高科技有限公司提供;胎牛血清
(FCS),由杭州四季青公司提供;低糖的 DMEM 的培
养基 ,由 GIBCO公司提供 。人粒单系集落甲基纤维
素基础培养基 、人全甲基纤维素基础培养基 ,由北京
安普生化科技有限公司提供。
1.1.3　脐血　由兰州大学第一医院产科提供。
1.2　实验方法
1.2.1　墓头回及其提取方法　墓头回采自甘肃省
庆阳地区 ,用药部位为全草 ,经兰州大学中草药教研
室鉴定为败酱科属植物糙叶败酱。取墓头回经 10
倍量水浸泡提取 3次 ,合并提取液 ,浓缩 ,干燥 。配
置为 0.1 g/ml储备液 ,微孔滤膜过滤 ,备用 。
1.2.2　脐血的采集　供者要求身体健康 、发育良好
的非高龄产妇。无遗传病史 、无血液系统疾病 、无寄
生虫及地方病 、HIV 、肝炎 、梅毒等检测等均为阴性;
足月妊娠 、经产道分娩的胎盘组织 、娩出后立即结扎
脐带 ,严格消毒后用 16号针头穿刺脐静脉 ,通过重
力将尽可能多的脐血收集于含有肝素抗凝的采血袋
(200 ml)中 , 收集后 12h 内分离单个核 细胞
(MNC)[ 5] 。
1.2.3　脐血单个核细胞(MNC)的分离　脐血用1∶1
的PBS 稀释后 ,按体积比 1∶1 加入密度为 1.077 g/
ml的淋巴细胞分离液 , 2 500 r/min离心 25 min。离
心后的混合液体可见明显的分层 ,其中液体中央有
一层白膜层 ,将这层细胞用吸管吸出 ,放入试管中 ,
即为脐血单个核细胞层。加 PBS 于单个核细胞中 ,
然后用PBS 洗涤两次 ,离心 。将洗涤出的细胞镜下
观察计数 ,以1×106 个/ml加入含有 20%胎牛血清
的DMEM 培养基中 ,置 37 ℃,饱和湿度 ,5%的 CO2
培养箱中培养[ 6] 。
1.2.4　墓头回水提物对脐血基质细胞的影响　将1
×106/ml 单个核细胞接种于 6 孔培养板中 ,加入
0.001 、0.01和 0.1μg/ml的墓头回水提物 ,置 37℃,
饱和湿度 ,5%的 CO2的培养箱中孵育 14天 ,在显微
镜下观察 ,基质细胞层形成时终止培养 。倒去培养
液 ,加入 0.25%的胰蛋白酶消化基质细胞 ,直接计
数基质细胞 ,选取最好作用浓度 。
1.2.5　墓头回基质细胞上清液(MTH-PSCS)的制备
　在计数基质细胞的同时 ,收集最好作用浓度墓头
回与人脐血基质细胞共孵育后的上清液 ,密封 ,
-20℃保存待用 。
1.2.6　造血祖细胞集落分析　将1×106个/ml单个
核细胞 ,人粒-单系集落甲基纤维素基础培养基 ,和
最好作用浓度的MTH-PSCS ,按 0%、5%、10%、20%
比例(5 ml培养体系分别加入 0 ml 、0.25 ml 、0.5 ml、
1.0 ml)混合后接种于 6孔的培养板中 ,置 37℃,饱
和湿度 , 5%的 CO2的培养箱中孵育 7天 ,在倒置显
微镜下观察 ,大于 50个细胞的细胞团为一个集落 ,
计数粒-单系集落数 ,选取最好作用比例 。将 1×106
个/ml单个核细胞 、人全甲基纤维素基础培养基 ,和
不同浓度的MTH-PSCS ,按一定的比例混合后接种于
的 6孔培养板中 ,置37℃,饱和湿度 ,5%的 CO2 的培
养箱中孵育 14天 ,在倒置显微镜下观察 ,计数红系
集落数:>50 个细胞称为爆式红系集落形成单位
(burst forming unit-erythroid ,BFU-E)[ 7] 。
1.3　数据处理
用SPSS 10.0 软件进行统计学分析 ,实验数据
采用均数 ±标准差表示 ,多组间采用 Dunnett-t 检
验 。
2　结果
2.1　墓头回水提物对人脐血基质细胞形成的影响
0.01μg/ml的墓头回与人脐血基质细胞共孵育
14天后 ,基质细胞的数量明显多于对照组 ,差别具
有统计学意义(P <0.01);0.1和 0.001 μg/ml的墓
头回与人脐血基质细胞共孵育 14天后 ,基质细胞的
数量与对照组没有明显差别 ,但 0.001μg/ml的墓头
回作用后 ,基质细胞的数量明显多于 0.1 μg/ml的
墓头回组(表 1 、图 1)。
表 1　墓头回水提物对人脐血基质细胞形成的影响
墓头回水提物浓度
(μg/ml)
基质细胞数(×105)
X ±SD , n =12 P
0(A) 9.4±2.2
0.001(B) 11.0±4.1 0.079
0.01(C) 14.2±2.8＊ 0.000
0.1(D) 7.5±3.5 0.130
　　与对照组比较 , ＊表示 P<0.01
2.2　不同浓度 MTH-PSCS 对脐血粒-单系造血祖
细胞集落的影响
—603—中国实验诊断学　2008年 5月　第 12卷　第 5期
将 0.01 μg/ml 墓头回基质细胞上清液(MTH-
PSCS),与脐血单个核细胞共培养 7天后 ,在倒置显
微镜下观察 ,MTH-PSCS 作用后 ,脐血粒-单系造血祖
细胞集落数明显增高 ,与对照组比较 ,差别具有统计
学意义(P <0.01),其中以10%的MTH-PSCS作用最
为明显(表 2 、图 2)。
图 1　A:0μg/ml墓头回水提物对人脐血基质细胞形成的影响(x200);B:0.001 μg/ml墓头回水提物对人脐血基质
细胞形成的影响(x200);C:0.01 μg/ml墓头回水提物对人脐血基质细胞形成的影响(x200);D:0.01 μg/ml
墓头回水提物对人脐血基质细胞形成的影响(x200)
表 2　MTH-PSCS对脐血粒-单系造血祖细胞集落的影响
MTH-PSCS 粒-单系祖细胞集落数
X±SD , n=12 P
0 17±6　
5% 121±24＊ 0.000
10% 268±27＊ 0.000
20% 114±31＊ 0.000
　　与对照组比较 , ＊表示 P<0.01
2.3　不同浓度MTH-PSCS 对脐血红系造血祖细胞
集落的影响
将 0.01 μg/ml 墓头回基质细胞上清液(MTH-
PSCS),与脐血单个核细胞共培养 14天后 ,在倒置显
微镜下观察 ,MTH-PSCS 作用后 ,脐血红系造血祖细
胞集落数同样明显增高 ,与对照组比较 ,差别具有统
计学意义(P <0.01),其中以 20 %的 MTH-PSCS 作
用最为明显(表 3 、图 3)。
表 3　MTH-PSCS对脐血红系造血祖细胞集落的影响
MTH-PSCS 红系祖细胞集落数
X ±SD , n=12 P
0 38±12
5% 72±23＊ 0.000
10% 81±9＊ 0.000
20% 159±45＊ 0.000
　　与对照组比较 , ＊表示 P<0.01
3　讨论
脐血基质细胞是多能干细胞 ,是人体细胞移植 、
替代的重要来源之一。分离 、培养骨髓细胞 ,再经传
代后贴壁生长的主要是骨髓基质细胞 ,它是多种细
胞的前体细胞 ,并能成功诱导分化为成纤维细胞 、上
皮样细胞 、神经元 、神经胶质细胞 、肝细胞 、肌细胞
等[ 8 ,9] 。而悬浮生长的主要是各种血细胞 、造血干
细胞及各种死亡细胞。
—604— Chin J Lab Diagn ,May , 2008 ,Vol 12 ,No.5
图 2　A:0.01 μg/ml墓头回MTH-PSCS按 0%比例作用 7 天后脐血 CFU-GM(x200);B:0.01 μg/ml墓头回MTH-
PSCS按 5%比例作用 7天后脐血 CFU-GM(x200);C:0.01 μg/ml墓头回MTH-PSCS按10%比例作用7 天后
脐血 CFU-GM(x200);D:0.01 μg/ml墓头回MTH-PSCS按 20%比例作用 7 天后脐血 CFU-GM(x200)
图 3　A:0.01 μg/ml墓头回 MTH-PSCS 按 0%比例作用 7 天后脐血 CFU-E(x200);B:0.01 μg/ml墓头回 MTH-
PSCS按 5%比例作用 7天后脐血 CFU-E(x200);C:0.01 μg/ml墓头回MTH-PSCS按 10%比例作用 7 天后脐
血 CFU-E(x200);D:0.01 μg/ml墓头回 MTH-PSCS按 20%比例作用 7 天后脐血 CFU-E(x200)
—605—中国实验诊断学　2008年 5月　第 12卷　第 5期
　　本试验研究墓头回水提物对人脐血基质细胞形
成的影响 ,结果显示:0.01μg/ml的墓头回与人脐血
基质细胞共孵育 14 天后 , 基质细胞的数量(14 ±
2.8)×105 明显多于对照组(9±2.2)×105 ,差别具有
统计学意义(P <0.01);0.1和 0.001 μg/ml 的墓头
回与人脐血基质细胞共孵育 14天后 ,基质细胞的数
量与对照组没有明显差别 ,但 0.001μg/ml的墓头回
作用后 ,基质细胞的数量明显多于0.1μg/ml的墓头
回组 。此研究说明墓头回可以促进脐血基质细胞的
形成 ,但随着浓度的增大 ,有先升高后下降的趋势 ,
具体机制尚待进一步研究 。
造血调控是通过各种造血生长因子(hematopoi-
etic growth factor ,HGF)以及细胞间的相互作用 ,引起
造血细胞中特定基因表达的改变 ,从而控制造血细
胞的增殖与分化 ,达到调控造血的目的。根据 HGF
对造血细胞的作用阶段将其分为:①系特异性细胞
因子:大多作用于分化后期 ,包括 EPO 、TPO 、M2CSF 、
G-CSF和 IL-5;②非系特异性细胞因子:包括 IL-3 、
GM-CSF和 IL-4 ,其功能主要维持处于 G0期之外所
有造血干细胞的生存 、增殖;③G0期作用细胞因子:
包括 IL-1 、IL-3 、IL-6 、IL-11 、IL-12 、G-CSF 、LIF 和 SCF ,
维持早期造血干细胞的存活或促其分化扩增;④造
血抑制因子:包括 TGF-α、IFNβ 和 MIP-1α等[ 10] 。文
献报导 ,基质细胞可产生M-CSF 、GM-CSF 、G-CSF 、IL-
1 、IL-4 、IL-6 、IL-7 、IL-11 、SCF 、血小板衍生生长因子
和bFGF等多种细胞因子 ,它们对于维持造血具有
重要作用[ 11] 。
本试验通过检测基质层细胞上清刺激粒-单系
祖细胞集落生成的作用 , 研究结果表明 ,对照组
CFU-GM为 17±6 , 而在 5 、10 、20%的试验组 , CFU-
GM分别为 121±24 、268±27 、114±31 、68±11 ,与对
照组比较具有显著性差异(P <0.01),10%的实验
组GM-CFU高达 268±27 ,作用最明显 ,说明墓头回
可能通过促进脐血基质细胞分泌 GM-CSF 从而促粒
-单系造血祖细胞集落的生长 。除了粒-单系外 ,对
于红系 ,研究结果表明 ,对照组 BFU-E为 38±12 ,而
在5 、10 、20%的试验组 , BFU-E 分别为 72±23 、81±
9 、159±45 、90±32 ,与对照组比较具有显著性差异
(P <0.01), 20 %的实验组 BFU-E高达 159±45 ,作
用最明显 ,说明墓头回可能通过促进脐血基质细胞
分泌 EPO从而促红系血祖细胞集落的生长 。本研
究还发现基质细胞分泌不同刺激因子的浓度不同 ,
10 %的实验组对 CFU-GM 的作用最为显著 ,而在
20%的实验组 BFU-E 作用最为明显。这说明基质
细胞分泌不同刺激因子的能力不同。墓头回不仅促
进脐血基质细胞的数目的增多 ,同时也促进其功能
即分泌细胞因子来促进造血祖细胞集落的生成 。墓
头回是否还可促进脐血基质细胞分泌其他细胞因
子 ,尚待进一步探讨。
此研究对于墓头回临床治疗白血病 、血小板减
少性紫癜提供依据 ,也为墓头回治疗再生障碍性贫
血奠定了理论基础 ,同时提示在临床使用时要选择
合适的浓度也是治疗的关键所在 。
作者简介:马海珍 , 45 岁 , 女 , 副主任医师 , 主要从事骨髓造
血机制研究。
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(收稿日期:2007-12-20)
—606— Chin J Lab Diagn ,May , 2008 ,Vol 12 ,No.5