全 文 ：重组基因表达对大肠杆菌生理的影响
郑志永，关怡新，林东强，姚善泾!
（浙江大学 化学工程与生物工程学系，杭州 !"##$%）
摘 要：重组基因在表达外源蛋白质时常常会耗用大量的宿主细胞资源，从而对宿主造成代谢负荷，代谢负荷使得
宿主的生化和生理产生很大的变化，甚至损害宿主正常的代谢功能。而过重的代谢负荷会影响目标蛋白的表达量
和表达质量。综述了产生代谢负荷的原因，宿主细胞对代谢负荷的应激反应、以及减轻代谢负荷的策略。
关键词：基因表达；代谢负荷；发酵策略；大肠杆菌
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自 $#世纪 %#年代以来，重组 =0)技术得到了
迅速的发展，许多具有医学价值的基因相继得到分
离和表征，并在不同的宿主细胞中高效表达。这些
宿主细胞包括微生物细胞、植物细胞和动物细胞。
当表达的目标蛋白需要糖基化、磷酸化等修饰，否则
难以形成正确的二硫键配对和空间构象而表现其生
物学活性时，真核宿主细胞得到较多的应用。但由
于大肠杆菌的遗传学和分子生物学背景较为清楚，
开发了许多不同筛选标记的质粒和突变宿主菌，大
肠杆菌仍是目前最常用的宿主。在高密度培养重组
大肠杆菌生产高产量的重组蛋白过程中，细菌的生
理代谢状态和内在资源分配会发生很大的改
变［"，$］，这种变化会影响到重组蛋白的合成速率［!］，
蛋白质的稳定性［+］、正确折叠［,］，从而也会影响到下
游的分离纯化过程。研究外源基因高表达对宿主细
胞的代谢负荷及其应激反应，在此基础上使用理性
的策略使之有利于外源基因的高表达及高密度发
酵，是一项很有应用前景的研究课题。本文拟对近
年来有关重组基因表达对大肠杆菌宿主细胞产生的
生理影响及应对措施加以简要综述，以期为国内的
! 收稿日期：$##+*#!*"$
基金项目：国家自然科学基金（0@U$#$%(#(,）
作者简介：郑志永（"W%!*），男，博士生，从事生物化工方向的研究。
联系人：姚善泾，RCK：’( X ,%" X ’%W,"W’$；Y?:：’( X ,%" X ’%W,"#",；/*G?3K：4?5OBZ J2CU PBQ，CLQU J6
第 $卷第 $期
$##+年 ,月
生 物 加 工 过 程
I236COC [5QE6?K 5H M35DE5JCOO /6736CCE367
\?4 $##+
·"!·
万方数据
相关研究提供一定的参考。
! 代谢负荷产生的原因及影响因素
在早期的遗传工程实验中，人们倾向于认为，一
旦所引入的基因表达量能达到一个可接受的水平，
实验就认为是成功的。然而，这种观点忽略了导入
外源 !"#之后引起了宿主细胞的生理变化。最近，
越来越多的科学工作者认识到外源 !"#在宿主的
细胞的导入和表达常常使宿主细胞的代谢发生改
变，并损害宿主正常的代谢功能。$%&’［(］首先考察
了这种由于外源基因引入宿主而对细胞产生的代谢
负荷（)*+,-%./& -012*3，)*+,-%./& .%,2，41%+*/3 -015
2*3）。它是指细胞为维持和表达外源 !"#、6"#及
重组蛋白的合成而需要占用宿主细胞资源（如能量，
结构单元等）而增加的生理负荷。
代谢负荷的产生的原因是多方面的。质粒的维
持需要一定的能量，质粒越大所需的能量就越多［7］。
代谢负荷的大小还与质粒的拷贝数有关［8］，随着拷
贝数的增加，宿主细胞用于维持质粒 !"#所需的能
量就越多，比生长速率和每个质粒的表达量也随之
下降。蛋白质的合成是一个高能耗的过程，延伸的
肽链每增加一个氨基酸需消耗 9 个 #:; 和 < 个
=:;。重组蛋白的表达可能会耗尽宿主细胞中的氨
基酰5+6"#、能量分子、构造单元以及蛋白质合成因
子等，从而影响到宿主细胞自身代谢网络的平衡。
代谢负荷的轻重与重组蛋白的诱导强度密切相关，
随着诱导强度的增加，重组蛋白的比合成速率上升，
势必会使表达过程占用更多的宿主细胞资源，细胞
中的代谢流和蛋白合成单元涌入重组蛋白的合成过
程中，一旦宿主细胞无法通过应激反应调整细胞的
正常的代谢功能和补充必要的细胞组件，代谢负荷
就会削弱重组菌进一步表达的能力甚至导致重组细
胞的死亡。代谢负荷的大小除了受质粒的大小及拷
贝数的影响之外，还与宿主细胞的生理状态及细胞
的培养环境有关［>］。当供氧不足或营养物质受到限
制时，代谢负荷对细胞生长的影响更加显著。
另外，抗生素抗性基因的表达也会对宿主细胞
产生代谢负荷。在质粒构建过程中为了筛选方便，
不可避免地引入了一些抗生素抗性基因，抗性基因
的表达也需消耗许多宿主细胞的资源，但是不同的
抗性基因表达所引起的代谢负荷的大小是不同的，
四环素抗性基因的表达水平要小于氨苄青霉素、氯
霉素等抗性基因的表达水平，因此携带四环素抗性
基因的质粒引起的代谢负荷较小，对宿主细胞生理
的影响也较小。
" 代谢负荷对细胞生理和细胞形态的影响
重组蛋白的表达而引起的代谢负荷会使宿主细
胞的生理功能发生一系列的变化，其中最明显的现
象就是降低了细菌的比生长速率，以维持质粒载体
基因的表达活性，包括 6"#的转录与外源蛋白的合
成，这些都会对宿主细胞的生长产生副作用。同时
在客观上也加剧质粒分离的不稳定性。
重组大肠杆菌发酵过程中乙酸的产生主要有两
个原因，即设备的供氧能力不足使得重组菌的呼吸
受到限制，和葡萄糖的摄入速率大于重组菌有氧呼
吸的能力。这两种情况都会导致底物通过乙酰磷酸
途径转化为乙酸。而过重的代谢负荷会降低重组菌
的最大摄氧能力［9?］，将直接加剧前两种情况的出
现，因此在表达过程中也更容易积累乙酸，既不利于
重组大肠杆菌的生长，又会影响到重组蛋白的高效
表达。
大肠杆菌在过量表达外源基因的过程中，一些
特定的氨基酰5+6"# 可能会受到限制，就会增加翻
译过程中错误氨基酸插入肽链的概率。另外，由于
蛋白质翻译过程的准确率依赖于校验机制中 =:;
的获取，而外源基因的过量表达常常会使能量物质
的供给受到限制，这会影响到翻译的准确率。如大
肠杆菌过量表达鼠表皮生长因子过程中［99］，肽链的
氨基酸错误率是正常条件下的 9?倍，严重降低了目
标蛋白的表达质量和应用价值。
过重的代谢负荷会使一部分重组大肠杆菌丧失
分裂能力［7］。如果重组菌在表达外源蛋白的过程
中，染色体 !"#受到的损伤不能有效修复时，就会
影响到细菌的分裂能力。尽管这部分细菌仍保持着
相当的代谢和呼吸活力，但无法继续分裂繁殖，也无
法在琼脂平板上形成菌落，这种生理状态可能是介
于正常菌与死菌之间的过渡态，又称存活但不能培
养状态（@/,-.* -0+ 3%3&0.+01,-.* A+,+0A），在一些高强度
表达系统中，这种生理状态的重组菌可以通过代谢
指示剂等检测到。
重组蛋白的过量表达有时还会影响到细胞膜的
通透性。=*%1B/%0等［9C］在周质区表达外源蛋白过程
中，发现周质区的外源蛋白能释放到培养基中，而这
·9D· 生物加工过程 第 C卷第 C期
万方数据
并不是细胞裂解的结果，而是过重的代谢负荷增加
了细胞壁外膜的通透性造成的。如果理性地利用这
种诱导分泌现象，那么就有可能通过控制代谢负荷
的大小，使表达的分泌型重组蛋白能及时地从周质
区释放到细胞外，这对于分泌型重组蛋白的生产具
有重要应用价值。
此外，重组蛋白自身的活性和物理性质也有可
能会干扰宿主细胞的生理功能，如重组大肠杆菌表
达多变鱼腥藻（!"#$#%"# &#’(#$()(*）的磷酸烯醇式丙
酮酸羧化酶时［!"］，合成的酶能迅速催化大肠杆菌细
胞中的磷酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸，削弱了磷
酸烯醇式丙酮酸向其它途径的转化。在分泌表达重
组蛋白的体系中，外源蛋白从细胞质转运到周质区
或细胞外，可能会阻塞转运的通道［!#］，从而影响宿
主细胞自身蛋白的正确定位，对宿主细胞造成生理
性的损害，甚至产生致死作用。
代谢负荷也会对宿主细胞的形态产生影响［!$］。
将质 粒 %&’’!$ 转 入 棕 色 固 氮 菌（ !+,-,$#.-%’
&("%)#"/((）后，转化子的细胞大小仅为未转化细胞的
!() * +()。重组蛋白在宿主细胞中过量表达常常
导致形成高分子量的包含体。含有包含体的大肠杆
菌细胞长度常常会比未转化的大肠杆菌长。过量表
达外源蛋白的重组菌有时会形成延伸的细胞链，如
重组大肠杆菌表达 ,# -./连接酶时形成 " * #个细
菌的细胞链，而未转化的细胞则以个体方式存在。
由于受代谢负荷的影响，有些宿主细胞的生理受到
影响而合成并分泌大量的粘液物质，胞外形成的粘
液使重组棕色固氮菌在固体培养基上形成较大的菌
落，而在液体培养时形成菌团。
! 宿主细胞对代谢负荷的应激反应
由于重组基因的表达需消耗宿主大量的能源物
质，宿主细胞中需要能量较多的代谢过程首当其冲
地受到影响。为适应这种额外的代谢负荷，宿主细
胞在生理代谢过程中产生一系列的应激反应以维持
细胞的正常功能和生存。
重组基因的表达促使宿主细胞产生热激反
应［!0］。对于温度诱导的表达系统来说，必须提高温
度以诱导表达外源蛋白，这个过程显然会促使细菌
产生热激反应。而对于其它表达系统来说，异常折
叠蛋白、分泌蛋白前体以及 12,&分子本身都能诱导
大肠杆菌细胞产生热激反应。热激反应的产生也可
以归因于热激因子!"+的稳定性，而外源基因表达产
生的重组蛋白增强了!"+的稳定性，从而诱导表达
-345、673、&8%9 和 &8796 等热激蛋白，增加了胞内
蛋白水解酶的活力，此外热激反应还与周质区的
-:;2等蛋白水解酶相关。因此，热激反应一般对重
组蛋白的表达是不利的。
重组基因表达能诱导宿主细胞产生严紧反应和
一般的饥饿反应［!<］。这两种反应都是细胞的生长
处在饥饿或其它不利环境时诱导产生的，是细胞的
一种自适应性机制。重组大肠杆菌在表达外源基因
时需要消耗大量的能量物质、氨基酸以及其它构成
单元，空载的 =>./激活 >:?/合成严紧反应信号分
子 %%&%%，从而诱导大肠杆菌的严紧反应。严紧反
应对于细胞处理不利环境时是必须的，抑制这些反
应会降低细胞生长的速率并加速细胞的死亡。
’@’反应是细胞 -./受到损伤或复制系统受
到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的应急效
应。在许多重组表达系统中已发现 ’@’ 反应的诱
导信号［!A］，并且其诱导信号的强弱与重组表达系统
的诱导强度有关。诱导表达外源蛋白时产生的代谢
负荷可能会干扰 -./的复制，当细菌试图修复受到
损害的染色体 -./时产生了 ’@’反应的诱导信号，
合成与修复 -./ 有关的关键酶以求得继续生存。
但是，如果表达外源蛋白产生的代谢负荷过重，在转
录水平和翻译水平上与细胞正常蛋白合成的竞争过
于激烈时，细菌无法启动正常的应激反应，-./ 遭
受持续地破坏，那么细菌就可能无法恢复过来而走
向死亡。
" 减轻代谢负荷的策略
#B! 降低质粒拷贝数
为了减轻重组基因表达对宿主细胞产生的代谢
负荷，最简单的办法是使用低拷贝数的质粒表达载
体。一般来说，高拷贝数的质粒有利于外源基因的
过量表达，但由此带来过重的代谢负荷对某些表达
系统却是不利的，外源蛋白在宿主细胞中持续高水
平的表达会对宿主细胞产生生理性的损害甚至产生
致死作用。虽然这种过重的代谢负荷可以通过采用
可调节的强启动子和两段发酵的策略得到缓解，即
在第一阶段启动子处于关闭状态，而在第二阶段打
开启动子。这种策略使得重组菌在第一阶段的代谢
负荷得到减轻而迅速生长并保持了质粒的稳定性，
+((#年 $月 郑志永等：重组基因表达对大肠杆菌生理的影响 ·!$·
万方数据
而第二阶段开始快速表达外源蛋白。这种策略已经
在生产重组蛋白的表达系统中得到了广泛的应用。
然而近年来人们发现使用低拷贝数质粒表达系统在
一些代谢工程应用中并不逊色于高拷贝数的质
粒［!"］。代谢工程应用中常常需要增加某一代谢途
径中关键酶的表达水平以增加该代谢途径的流量，
这种情况下基因产物的比活力不是最重要的，而中
间代谢产物的过量积累可能会导致其它重要细胞成
分的合成受到削弱，细胞的生理就会受到影响，反而
不利于目标代谢产物的合成，因此必须在目标产物
的过量合成与维持细胞的生存之间找到一个平衡
点。低拷贝数的质粒由于其质粒稳定性高，代谢负
荷低的特点在这一应用方面有其独特的优点。
#$% 避免抗性基因
若将外源 &’(直接整合入染色体 &’(，那么质
粒的稳定性就不再是问题了，宿主的细胞资源也就
不必浪费地用于合成不需要的抗生素抗性标记等基
因产物了，而表达系统中的抗生素抗性基因的表达
也是代谢负荷的重要组成部分［)］。这种策略应用于
那些最终将释放到自然环境中的基因工程菌显得尤
为重要。
#$) 减轻热激反应
由于重组基因的过量表达能促使宿主细胞产生
热激反应，因此减轻细胞热激反应的方法也将有利
于降低胞内蛋白水解酶的活力，从而对目标外源蛋
白的过量表达起到正面作用。降低培养温度和使用
!"#$ 或 %&’ 突变菌都能有效降低宿主细胞热激反应
中的蛋白酶的活力，从而增加了目标蛋白的稳定性
和最终产率。*+,-.+/和 0+123+4［%5］通过不同的补料
和诱导策略以避免重组菌的热激反应，降低了蛋白
水解酶的活力，从而提高了目标蛋白的产量。重组
基因的表达促使外源蛋白的合成与维持宿主正常功
能的胞内蛋白合成相互竞争，因此，降低外源蛋白的
比合成速率不仅能有利于减轻热激反应的程度，而
且能有利于宿主细胞活力的维持和目标蛋白的正确
折叠，从而延长合成外源蛋白的时间，最终可能得到
更高的产率。
#$# 温和诱导
高强度的诱导虽然能在初始表达过程中获得较
高的目标蛋白比合成速率，但是由此产生代谢负荷
也较重，不利于重组蛋白的持续表达，因此若要表达
那些对宿主细胞毒性不大的重组蛋白时，温和的诱
导可能是更好的选择，这可以通过使用不同的诱导
剂［%!，%%］或优化诱导剂的添加方式［%)］等方法来实
现。在以 %() 为启动子的表达系统中，利用半乳糖
和乳糖代替 6789作为诱导剂，同时作为碳源和能量
物质，能有效地减轻重组蛋白表达过程中对宿主细
胞的代谢负荷，延长了目标蛋白表达的持续时间，最
终得到目标蛋白的表达量可能会优于 6789 诱导。
由于乳糖等转运进入细胞后必须转化为异乳糖后才
能起到诱导剂的作用，同时乳糖分解作为碳源和能
量物质进入代谢途径，因此利用乳糖等作为诱导剂
其诱导过程更为复杂。但是乳糖具有的无毒、价格
低廉的特征及它对重组蛋白表达温和的诱导强度，
使得利用乳糖诱导的研究对于重组基因工程药物的
工业化生产具有重要的意义。目前，国内在这一方
面的研究也取得了一定的进展［%# : %;］。
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·!;· 生物加工过程 第 %卷第 %期
万方数据
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