全 文 :!10
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2012
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[2009]958
)
ST.U
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(1987—),
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!" 6 #. ) ¼/ì (ABTS) µIÎÞ³ÀÁìÕß# , +d pH ¢£µ 48 45, +dà©¢£µ 55 50℃,2 ZÞ³8 pH40~50 %& , ੹ 50℃ á , ìªRlÕV( 。 ¦úûéüµÞ³ ,Km=6450μmol/L;¦ABTSµÞ³,Km=222 μmol/L。Cu2+Ì)ì*Ô+´1,Fe2+、Ca2+、Ba2+,°±-ñìª+Õ。 bcd : óì ; ðñ ; ¢áÎ ; ìÕß
efghi
:Q554
6jklm
:A
6n;i
:1672-3678(2012)02-0034-06
PurificationandpropertiesoflaccasefromGanodermaEIM40
HEGuobin,CAIShaoli,KEChongrong,HUANGPing,ZHANGMingliang,HUANGJianzhong
(KeylabofIndustrialMicrobiologyoftheMinistryofEducation,EngineeringResearchCenterofFujian
ModernFermentationTechnology,ColegeofLifeScience,FujianNormalUniversity,Fuzhou350108,China)
Abstract:AfterthecrudelaccasefromGanodermasp.EIM40waspurifiedusinglyophilization,fraction
alammoniumsulfateprecipitation,HiTrapphenyl(FF)hydrophobicchromatographyandQSepharose
FastFlowIonexchangechromatography,afinalyieldof53% andaspecificactivityof146foldwere
achieved.SDSPAGEanalysisbysilverstainingrevealedasinglebandwithmolecularweightof
653×104.TheoptimalreactionconditionsofthelaccasetowardGuaiacolandABTSassubstratein
clude55℃ and50℃ ofreactiontemperatureandpH48andpH45.Whenthetemperaturewasbelow
50℃ andthepHwasintherangeof40to50,thelaccaseexhibitedexcelentstabilityinthetwosub
strates.TheKmforoxidizingguaiacolandABTSwere6450and222μmol/L,respectively.Laccase
couldbeenhancedbyCu2+andinhibitedbyFe2+,Ca2+,andBa2+.
Keywords:laccase;Ganoderma;purification;enzymologicalproperties
|}
(laccase)
Oóí²7ºtäF} , tN "¡J6³ÂK (Basidiomycetes) Óé&t7Ê8 K [1]。 }_>Ñ47X´Ov , päFºmt ówqwóFgX , k±zO 、
{ÐO 、 fª ^ 、 D=> 、 /XÃÄÅiúû Pµ$_> Ñ7q`,- [2-3]。 Û, , A0|}8K789tNVkà0K t7¸¹ 、 -.xyw-.ñ7¾¦ 、 |}pL 7wö¡¯6i|}7~Fiv8 9Pñ [4]。 7xÃ70|}KtWº , óc½A Vk Trametessp[5], ÜUAz{Kt7xÃ÷ z 。 kz{%&Om5K , IlE75móÑ 4 , 7T`JlEºmfw>?X , _>iD7 q`øª [6-7]。
A~M37 1 tz{0/7|}ÎG~ F , 189j}v , 6#AÎOR789 wOq`[g>øª7a 。 1 op%rs 11 tu z{ (GanodermaspEIM 40) Kt , oý 9æOW/X§ß8O³89VÆ[g 。 12 vwJ -.p (g/L): Ü 20、 n/®Ü 10、 Ø Ù 10、KH2PO45、de, 20;pHn。 13 :a%æç 2,2 ùþ + (3 (p s1¶· 6 v@ ) + Ø (ABTS), ~ ,Sigma ÇÈ 。 ¸(5t (2 ¢ äpt ) wjWì{ &Ü0~ 。 `°? , øÜ ChristAIPHA2 4LDPLUS ÇÈ ; HiTrapphenyl(FF)、 ¹i~ºº]Ö 、AKTA nr 2 ,GE ÇÈ ; ©ªD¦FGº , Ó£ÜØ»> ÎÇÈ 。 14 j£klß |}e¬`¸(5tËw ABTS Ë , a ñ¯ [8-10]。1min UäF 1μmol¸ (5t< 1min dF 1μmolABTS(ABTSnop\]IaÐ 3 b) sFN7}u& 1` }Y (U)。 15 -Ìmß [11] ÉÊíu¬`v;U¼ G250 Ë , 6Ö ä²ÊÉÊ%¾¿ 。 16 SDSPAGE n [11] ½¬`u~ 12% ~«w 5% 7\} « , 6 TrisGly &01ú 。 »¼¾¿ÉÊ Marker k SDSPAGE V7½A¾÷¶A½A~Âu% 3 , @|}7½A~Âu 。 17 j£gYì¨ 171 °}/7ghw\} z{ EIM 40 Ktk 30℃、120r/min、 â/u 50mL(250mL ´ç ) xy= 7d, Æ (4℃、 10000r/min,12min), |±²/ 。 S-./êJ `°¿V ( /À]³ 1cm),-20℃ ¥ 30min, -80℃ ¥ 6h 6± ,` °=> 20h 6± , 6 30% (NH4)2SO4E。 172 (NH4)2SO47~ü S 171 =>*7J 4℃ ª 4h 6± , Æ|±²/ , г (NH4)2SO4¶Ñu~ & 75%,4℃ ²RÁ» , Æ|Á» ,` í 08 mol/L(NH4)2SO47×@/(20mmol/L,pH 56) E 。 173 HiTrapphenyl(FF) ÂD 、 K `í 08mol/L(NH4)2SO47×@/(20 mmol/L,pH56) B$ 1mL 7 HiTrapphenyl(FF)  D Ë , ± u & 1mL。 ` × @ / (20mmol/L,pH 56) Î G ¡ ª , ¡ ª Ò & 08mL/min, Ö` 048~08mol/L 7 (NH4)2SO4 /ÎGU]¡ª 10min, *` 0~048mol/L 7 (NH4)2SO4/ÎGU]¡ª。`¸(5tX }v , g1>}7¤ 。 ÂD` 20mmol/L、pH56 7×@/J 4℃ K 24h ( KE½A~Âu& 15×103), ] 12h # öO:/ ,` Ba2+ ¡ SO2+4 ¯Ã%&。` PEG6000 \}¶À®@ , h` 。 174 QSepharoseFastFlow ªö u14mL 7 QSepharoseFastFlow ªö Z , â³ XK16/20 ËÂV , Ëà 7cm。 `×@ / (20mmol/L、pH56) B
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(20mmol/L,pH56)
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184
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(Zn2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+、
Mn2+、Ba2+、K+)
iv
(EDTA、Tris、SDS),
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,` 50mmol/L
EDTA
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EDTA
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,` 30%
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(NH4)2SO4E,æ8~7º,óX÷È´
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、75%
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578%,(NH4)2SO47
|¶&
385%。
212 HiTrapphenyl(FF)
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048~08mol/L(NH4)2SO47×@/
(20mmol/L,pH56)
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0~048mol/L
(NH4)2SO47×@/(20mmol/L,pH56)¡
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HiTrapphenyl(FF)
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Fig.1 HiTrapphenyl(FF)hydrophobic
chromatographyoflaccase
M—
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;1—
`°\}}
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2、3—
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^
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2
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SDSPAGE
nf:
Fig.2 SDSPAGEpaternofpurifiedlaccase
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2
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1
7
SDSPAGE
v;U¼
R250
^MÞé8?O7x?
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213 QSepharoseFastFlow
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、(NH4)2SO4U]
、HiTrapphenyl(FF)
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QSepharoseFastFlow
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Fig.3 QSepharoseFastFlowionexchange
chromatographyoflaccase
22
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221
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SDSPAGE
ìÂDwªö*
,
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EIM 40
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Table1 PurificationresultsoflaccasefromGanodermasp.EIM40
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4000 5664 54912 1031 1000 10
`°
1070 3274 17277 1895 578 18
75%(NH4)2SO4 200 2181 13765 1584 385 15
HiTrapphenyl(FF) 280 677 00627 10793 120 105
QSepharoseFastFlow 378 299 00198 15115 53 146
M—
Öä²ÉÊ
;1—
`°\}}
;2、3—
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SDSPAGE
nf:
Fig.4 SDSPAGEpaternofpurifiedlaccase
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Fig.5 OptimalpHandpHstabilityoflaccase
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Fig.6 Optimaltemperatureandthermal
stabilityoflaccase
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7
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°±
(
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)
Fig.7 LineweaverBurkplotsoflaccase(guaiacol)
f
8
j£
LineweaverBurk
°±
(ABTS)
Fig.8 LineweaverBurkplotsoflaccase(ABTS)
o3
7、
3
8
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Km=6450μmol/L,F ABTSX7 Km =222
μmol/L。
225
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mÍÂ
(5mmo/L)
wv
(1mmo/L)
A|}v7GHú
2
s8
。
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,Zn2+、Mn2+、Mg2+
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,K+、EDTA、SDS、Tris
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,
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Fe2+、Ca2+、Ba2+
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g[}7v
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2
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Table2 Efectsofmetalionsandsurfactants
onlaccaseactivity
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v
½A}
e
/%
ÍÂi
v
½A}
e
/%
Añ
100 Mn2+ 98±11
Zn2+ 98±10 Ba2+ 37±03
Mg2+ 99±15 K+ 63±07
Fe2+ 31±50 EDTA 74±16
Cu2+ 114±25 Tris 73±07
Ca2+ 36±10 SDS 63±02
3
y
)
¬``°\}
、(NH4)2SO4、HiTrapphenyl
(FF)
ÂDw
QSepharoseFastFlow
廚
Az{
EIM 40
-./ÎG~F
,
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|}
,
F&
146,
|¶&
53%。SDS
PAGE
Ñ7MÞ&Ox?
,
½A~Âu³&
653×104。
6¸(5tw
ABTS
&FXÎG
}v89
,
+À
pH
~&
48
w
45,
+˻
]~&
55
w
50℃,2
mXk
pH40~50
9
:U
,
ª]mJ
50℃
ç
,
}7²v1÷D
。
6¸
(5t&Xç
Km=6450μmol/L,6 ABTS&
Xç
Km=222μmol/L。Cu
2+
A}Æg%`
,
Fe2+、Ca2+、Ba2+
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L6j
:
[1]
Èå
,
NÎ
,
ËÌÍ
,
P
.
8K|}v
、
~Â/Xijq`
89ÎÏ
[J].
/XÕá¸x
,2011,9(2):4855.
[2] ShraddhaS,ShekherR,SehgalS,etal.Laccase:microbial
sources,production,purification,andpotentialbiotechnological
applications[J].EnzymRes,2011,doi:10.4061/2011/217861.
[3] DesaiSS,NityanandC.Microbiallaccasesandtheirapplication:
areview[J].AsianJBiotechnol,2011,3(2):98124.
83
/
X
Ð
O
²
³
!
10
"
[4] DwivediUN,SinghP,PandeyVP,etal.Structurefunctionrela
tionshipamongbacterial,fungalandplantlaccases[J].JMol
CatalB:Enzym,2011,68:117128.
[5] IbrahimV,MendozaL,MamoG,etal.BluelaccasefromGalerina
sp.:propertiesandpotentialforkraftlignindemethylation[J].
ProcBiochem,2011,46:379384.
[6] ZilyA,daSilvaCoelhoMoreiraJ,BrachtA,etal.Influenceof
NaClandNa2SO4onthekineticsanddyedecolorizationabilityof
crudelaccasefromGanodermalucidum[J].IntBiodeteriorBio
degrad,2011,65(2):340344.
[7] daSilvaCoelhoJ,deSouzaCG,deOliveiraAL,etal.Compara
tiveremovalofbentazonbyGanodermaluciduminliquidandsol
idstatecultures[J].CurMicrobiol,2010,60(5):350355.
[8]
q
,
Î%f
,
÷«c
,
P
.
8K|}7}ñËIø
[J].
/XÐO²³
,2009,7(4):18.
[9]
i=G
,
iÎ
,
ËÕÏ
,
P
.
z{:à.t|}7F
w}v
[J].
ÂÊFO
,2007,24(7):649652.
[10]
mU
.
6
ABTS
&X|}e7ñË
[J].
ÐÙ
,
2007,24(1):4345.
[11]
GÝÑ
,
9f
.
ÉÊÕáÞß
[M].
ë
:
§ß@b
,
2000:38122.
[12] YanKeliang,ZhangWen,YuHongbo,etal.Newpolysaccharide
compoundingofpolysaccharidesderivedfromsubmergedculture
GanodermalucidumandLyciumbarbarum[J].FoodTechnolBio
technol,2010,48(1):94101.
[13]
ÒÓã
.
z{
TR6
|}7~Fiv89
[J].
q`
IB/Xx
,2008,14(1):99103.
[14]
iÔÕ
,
i=G
.
z{.t
G1502
|}7~Fi}
v89
[J].
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