全 文 :!10
"!
2
#
2012
$
3
%
/
X
Ð
O
²
³
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.10No.2
Mar.2012
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2012.02.008
NOPH
:2011-10-09
JQR!
:
Ó-
®0FØÙÚÛ
(¯
-
$Ø
[2009]958
)
ST.U
:
ÄÜf
(1987—),
,
°£í
,
¤¥89/
,
89ñò
:
~Â/X
;
S±
(
ùúí
),
§¨
,Email:hjz@fjnu.edu.cn
hi
EIM 40
j£gY쨣@`
¶/·
,¸
¹º
,
»¼½
,
¾
,
¿³À
,
ÁÂ
(
ÃÁÄÅW1 5Æ0112 ÃÁÇÈÉÊË[\XYFG.«
XZ$5>]^_XYFG.«
,
ÃE
350108)
7
a
:
=1긨ë
、(NH4)2SO4ì、HiTrapphenyl(FF)ííîQSepharoseFastFlowáâïîÌð
ñ
EIM 40
ÅÆOÀÁ¢áÎ
,
ò¶Îóì
,
Îôjµ
146,
õÔµ
53%。SDS PAGE
ö÷ªÇȵ÷
ÑØø
,
ùÌ¢âßÛµ
653×104。
¦úûéü
2,2
ýþ ¼
(3
-õ ÿ
!"
6
#.
)
¼/ì
(ABTS)
µIÎÞ³ÀÁì$Õß#$
,
+d
pH
¢£µ
48
45,
+dà©¢£µ
55
50℃,2
ZÞ³8
pH40~50
%&
,
੹
50℃
á
,
ìªRlÕV(
。
¦úûéüµÞ³
,Km=6450μmol/L;¦ABTSµÞ³,Km=222
μmol/L。Cu2+Ì)ì*Ô+´1,Fe2+、Ca2+、Ba2+,°±-ñìª+Õ。
bcd
:
óì
;
ðñ
;
¢áÎ
;
ì$Õß
efghi
:Q554
6jklm
:A
6n;i
:1672-3678(2012)02-0034-06
PurificationandpropertiesoflaccasefromGanodermaEIM40
HEGuobin,CAIShaoli,KEChongrong,HUANGPing,ZHANGMingliang,HUANGJianzhong
(KeylabofIndustrialMicrobiologyoftheMinistryofEducation,EngineeringResearchCenterofFujian
ModernFermentationTechnology,ColegeofLifeScience,FujianNormalUniversity,Fuzhou350108,China)
Abstract:AfterthecrudelaccasefromGanodermasp.EIM40waspurifiedusinglyophilization,fraction
alammoniumsulfateprecipitation,HiTrapphenyl(FF)hydrophobicchromatographyandQSepharose
FastFlowIonexchangechromatography,afinalyieldof53% andaspecificactivityof146foldwere
achieved.SDSPAGEanalysisbysilverstainingrevealedasinglebandwithmolecularweightof
653×104.TheoptimalreactionconditionsofthelaccasetowardGuaiacolandABTSassubstratein
clude55℃ and50℃ ofreactiontemperatureandpH48andpH45.Whenthetemperaturewasbelow
50℃ andthepHwasintherangeof40to50,thelaccaseexhibitedexcelentstabilityinthetwosub
strates.TheKmforoxidizingguaiacolandABTSwere6450and222μmol/L,respectively.Laccase
couldbeenhancedbyCu2+andinhibitedbyFe2+,Ca2+,andBa2+.
Keywords:laccase;Ganoderma;purification;enzymologicalproperties
|}
(laccase)
$Oóí²7ºtäF}
,
tN
"¡J6³ÂK
(Basidiomycetes)
Óé&t7Ê8
K
[1]。
}_>Ñ47X´Ov
,
päFºmt
ówqwóFgX
,
k±zO
、
{ÐO
、
fª
^
、
D=>
、
/XÃÄÅiúû Pµ$_>
Ñ7q`,-
[2-3]。
Û,
,
A0|}8K789tNVkà0K
t7¸¹
、
-.xyw-.ñ7¾¦
、
|}pL
7wö¡¯6i|}7~Fiv8
9Pñ
[4]。
7xÃ70|}KtWº
,
óc½A
Vk
Trametessp[5],
ÜUAz{Kt7xÃ÷
z
。
kz{%&Om5K
,
IlE75móÑ
4
,
7T`JlEºmfw>?X
,
_>iD7
q`øª
[6-7]。
A~M37
1
tz{0/7|}ÎG~
F
,
189j}v
,
6#AÎOR789
wOq`[g>øª7a
。
1
op%rs
11
tu
z{
(GanodermaspEIM 40)
Kt
,
oý
9æOW/X§ß8O³89VÆ[g
。
12
vwJ
-.p
(g/L):
Ü
20、
n/®Ü
10、
Ø
Ù
10、KH2PO45、de, 20;pHn。
13
:a%æç
2,2
ùþ +
(3
(p s1¶·
6
v@
)
+
Ø
(ABTS),
~
,Sigma
ÇÈ
。
¸(5t
(2
¢
äpt
)
wjWì{ &Ü0~
。
`°?
,
øÜ
ChristAIPHA2 4LDPLUS
ÇÈ
;
HiTrapphenyl(FF)、
¹i~ºº]Ö
、AKTA
nr
2
,GE
ÇÈ
;
©ªD¦FGº
,
Ó£ÜØ»>
ÎÇÈ
。
14
j£klß
|}e¬`¸(5tËw
ABTS
Ë
,
a
ñ¯
[8-10]。1min
UäF
1μmol¸ (5t<
1min
dF
1μmolABTS(ABTSnop\]IaÐ
3
b)
sFN7}u&
1`
}Y
(U)。
15
-Ìmß
[11]
ÉÊíu¬`v;U¼
G250
Ë
,
6Ö
ä²ÊÉÊ%¾¿
。
16 SDSPAGE
n
[11]
½¬`u~
12%
~«w
5%
7\}
«
,
6
TrisGly
&01ú
。
»¼¾¿ÉÊ
Marker
k
SDSPAGE
V7½A¾÷¶A½A~Âu%
3
,
@|}7½A~Âu
。
17
j£gYì¨
171
°}/7ghw\}
z{
EIM 40
Ktk
30℃、120r/min、
â/u
50mL(250mL
´ç
)
xy=
7d,
Æ
(4℃、
10000r/min,12min),
|±²/
。
S-./êJ
`°¿V
(
/À]³
1cm),-20℃
¥
30min,
-80℃
¥
6h
6±
,`
°=>
20h
6±
,
6
30%
(NH4)2SO4E。
172 (NH4)2SO47~ü
S
171
=>*7J
4℃
ª
4h
6±
,
Æ|±²/
,
г
(NH4)2SO4¶Ñu~
&
75%,4℃
²RÁ»
,
Æ|Á»
,`
í
08
mol/L(NH4)2SO47×@/(20mmol/L,pH
56)
E
。
173 HiTrapphenyl(FF)
ÂD
、
K
`í
08mol/L(NH4)2SO47×@/(20
mmol/L,pH56)
B$
1mL
7
HiTrapphenyl(FF)
Â
D Ë
,
± u &
1mL。
` × @ /
(20mmol/L,pH 56)
Î G ¡ ª
,
¡ ª Ò &
08mL/min,
Ö`
048~08mol/L
7
(NH4)2SO4
/ÎGU]¡ª
10min,
*`
0~048mol/L
7
(NH4)2SO4/ÎGU]¡ª。`¸(5tX
}v
,
g1>}7¤
。
ÂD`
20mmol/L、pH56
7×@/J
4℃
K
24h
(
KE½A~Âu&
15×103),
]
12h
#
öO:/
,` Ba2+
¡
SO2+4 ¯Ã%&。`
PEG6000
\}¶À®@
,
h`
。
174 QSepharoseFastFlow
廚
u14mL
7
QSepharoseFastFlow
廚
Z
,
â³
XK16/20
ËÂV
,
Ëà
7cm。
`×@
/
(20mmol/L、pH56)
B$
5~10`
Ë@
,
±
u&
20mL。
`í
05mol/LNaCl
7×@
/
(20mmol/L,pH56)
ÎGU]¡ª
,
¡ªÒ&
06mL/min。
`¸(5tX }v
,
g1>
}7¤
。
18
j££@`ß
181
|}+À
pH
i
pH
²v
¬`
pH37~60
73+@
NaOH
01/Ág
¸(5tXw¯°}/
,` pH35~59
7×@
01/
(01mol/L)
Ág
ABTS
Xw¯°}/
;
~
k
50
w
40℃
=}e
,
6}e+à
&
100%
Ö½A}e
,
ª]
3
:\Bª
。
S}/
~Ð3
pH37~60
73+@
NaOH
01/w
pH35~59
7×@01/V
,
J
30℃
=ª
2h,
~k
50℃
=}e
,
6ë=>}/7}e
&
100%
Ö¯Ã}e
,
ª]
3
:\Bª
。
182
|}+À½qª]i²v
k+À
pH
xy=
,
~k
35~70℃
=}
53
!
2
# ÄÜfP
:
z{
EIM 40
|}7~Fi}v
e
,
6}+à
&
100%
Ö½A}e
,
ª]
3
:\Bª
。
S}/~k
35~70℃
7D¦V
ª
1h
*
,
¼Ò¶ª
,
k+˻]i
pH
=
}e
,
6
4℃
}/}e&
100%
Ö¯Ã
}e
,
ª]
3
:\Bª
。
183
bÓ
(Km)ª7
k}7+À
pH
wª]xy=
,
~`WQ
\]7¸(5tX
(02~18mmol/L)
w
ABTS
X
(0005~10mmol/L)
}e
。
»¼
Lin
eweaverBurk
%3Ë@}AX7
Kmª。
184
ÍÂiväÐ*}7
SÍÂ
(Zn2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+、
Mn2+、Ba2+、K+)
iv
(EDTA、Tris、SDS),
~г3|}
(
}/첪*
,` 50mmol/L
EDTA
=>
30min,
*A}/ÎG¯°q
EDTA
Ñ\]¯3
1mmol/L)
7½qúV
,
qÍÂ
Ñ\ ] &
5mmol/L,
v Ñ \ ] &
1mmol/L,
k+˻]
、
+À
pH
=}e
。
6ë
äÐÍÂiv}/7}e&
100%
Ö½A}e
,
ª]
3
:\Bª
。
&[øZÄ
Â7GH
,
Z[
Ca2+、Ba2+、K+
P7ÄÂ&
Cl-,
jÃ&
SO2-4 。
2
yz%{)
21
j£gYì¨
211
°}/7\}
oJKK=0/º,óX
[12],
qM°}/÷
%Å
,
óFÞ«Û
,
wx`
30% ~80%
7
(NH4)2SO4
/¯W3\}7Û7
。
`°*
,` 30%
7
(NH4)2SO4E,æ8~7º,óX÷È´
E
,
ám>ÙJÉÊ7E
,
I6¯3\}
7Û7
。
S
400mL
°}/ì`°\}
、75%
(NH4)2SO4+Ñ\}¶20mL,\}[20。
`°\}7|¶&
578%,(NH4)2SO47
|¶&
385%。
212 HiTrapphenyl(FF)
ÂD
05mL
±ÂDË
,
!O?(`
í
048~08mol/L(NH4)2SO47×@/
(20mmol/L,pH56)
U]¡ª@O7
、
_>}
v 7 S
,
! + ? ( ` í
0~048mol/L
(NH4)2SO47×@/(20mmol/L,pH56)¡
ª
,
M3O`>}v7S
。
g1>}¤
1À®\}
,
MÞú3
1
s8
。
o3
1
I6º@
:
S
1
>|}v
,
S
2
E|}v
。SDSPAGE
¡
eú3
2
s8
。
f
1
j£
HiTrapphenyl(FF)
o¾pxf:
Fig.1 HiTrapphenyl(FF)hydrophobic
chromatographyoflaccase
M—
Öä²ÉÊ
;1—
`°\}}
;
2、3—
F}v;U¼
R250
^
f
2
ì¨j£
SDSPAGE
nf:
Fig.2 SDSPAGEpaternofpurifiedlaccase
o3
2
Iã
:
S
1
7
SDSPAGE
v;U¼
R250
^MÞé8?O7x?
,
6f~µÞ?D
。
213 QSepharoseFastFlow
廚
ÂD*7ìKª
,
20mL
±ÂªöË
,`
í
05mol/LNaCl
7×@
/
(20mmol/L,pH56)
ÎGU]¡ª
,
ÅMO`>
}v7S
,
g1>}¤1À®\}
,
MÞú
3
3
s8
,
3
3
V?¦§S>}
。
214
FMÞ
z{
EIM 40
|}~FMÞú
1
s8
。
o
1
Iã
:
|}ì`°
、(NH4)2SO4U]
、HiTrapphenyl(FF)
ÂDw
QSepharose
FastFlow
廚~F*
,
F&
146,
|¶&
53%。
63
/
X
Ð
O
²
³
!
10
"
f3
j£
QSepharoseFastFlow
YZîqpxf:
Fig.3 QSepharoseFastFlowionexchange
chromatographyoflaccase
22
j££@`
221
|}7
SDSPAGE
ìÂDwªö*
,
A|}ÎG
SDS
PAGE
½
,
MÞú3
4
s8
。
o3
4
Iã
:SDSPAGE
Ñ7MÞ&Ox
?
,
6f~]?à
,
¼¾¿ÉÊ7½A¾
÷¶A½A~Âu%3
,
M|}7½A~Â
u&
653×104。
222
|}7+À
pH
i
pH
²v
~6¸(5tw
ABTS
&X
,
|}7
+À
pH
i
pH
²v
,
MÞú3
5
s8
。
1
hi
EIM 40
j£gYì¨yz
Table1 PurificationresultsoflaccasefromGanodermasp.EIM40
FRÆ
å@
/
mL
åe
/
U
m(
åÉÊ
)/
mg
ñe
/
(U·mg-1)
|¶
/
%
F
°}/
4000 5664 54912 1031 1000 10
`°
1070 3274 17277 1895 578 18
75%(NH4)2SO4 200 2181 13765 1584 385 15
HiTrapphenyl(FF) 280 677 00627 10793 120 105
QSepharoseFastFlow 378 299 00198 15115 53 146
M—
Öä²ÉÊ
;1—
`°\}}
;2、3—
F}Ñ
f
4
ì¨j£
SDSPAGE
nf:
Fig.4 SDSPAGEpaternofpurifiedlaccase
o3
5
Iã
:
6¸(5t&X
,
|}7+À
pH
&
48,
k
pH40~50
79:U}e!W
æ
;30℃
ª
2h
7¼é8
,
k
pH40~50
U
,
ÇÃ}e¯3
90%
6±
,pH37~53
79:U
,
ÇÃ}e¯3
80%
6±
,
]@÷D7²v
。
6
ABTS
&X
,
|}7+À
pH
&
45;30℃
ª
2h
*7¼é8
,
k
pH40~50
U
,
ÇÃ}e
¯3
80%
6±
,
]@÷D7²v
,pH
nJ
41
<æJ
51
ç
,
}È?µª
。
f
5
j£3r
pH
pH
sß`
Fig.5 OptimalpHandpHstabilityoflaccase
223
|}7+Àª]iª]²v
~6¸(5tw
ABTS
&X
,
|}7
+Àª]iª]²v
,
MÞú3
6
s8
。
o3
6
Iã
:
6¸(5t&X
,
+˻]&
55℃,
k
40~65℃
U½A}eæJ
90%;
kWQ
ª]=ª
1h
7¼é8
,
ª]mJ
50℃,¯
Ã}
¯
95%
6±
,
ª]mJ
60℃
çü
60%
6±}
,
xÃ78~z{|}½ñ
[13-14],
ª]²v?
D
。
àJ
55℃
ç}eÉÊ=l
,70℃
ç.>
}
。
LM
,
kª]mJ
50℃
çIÐ?à²v
。
6
ABTS
&X
,
+˻]&
50℃,
k
50~60℃
U½
73
!
2
# ÄÜfP
:
z{
EIM 40
|}7~Fi}v
f6
j£3rqsß`
Fig.6 Optimaltemperatureandthermal
stabilityoflaccase
A}e.FWæ
;
kWQª]ª
1h
¼é8
,
ª]mJ
50℃
ç
,¯
Ã}¯
80%
6±
,
àJ
50℃
ç}eÉÊ=l
,60℃
ç.>}
。
LM
,
k
ª]mJ
50℃
çIÐ?à²v
。
224
bÓ
(Km)ª
6¸(5tw
ABTS
&X
,
k
50℃、pH45
xy=WQX\]=7½qÒ¶
,
»¼
Lin
eweaverBurk
Ë%3
,
MÞú3
7
w3
8
s8
。
f
7
j£
LineweaverBurk
°±
(
tuv
)
Fig.7 LineweaverBurkplotsoflaccase(guaiacol)
f
8
j£
LineweaverBurk
°±
(ABTS)
Fig.8 LineweaverBurkplotsoflaccase(ABTS)
o3
7、
3
8
IM|}F¸(5tX7
Km=6450μmol/L,F ABTSX7 Km =222
μmol/L。
225
ÍÂivA}7GH
mÍÂ
(5mmo/L)
wv
(1mmo/L)
A|}v7GHú
2
s8
。
o
2
Iã
:Cu2+
A}>g%`
,Zn2+、Mn2+、Mg2+
A
}e7GHWæ
,K+、EDTA、SDS、Tris
A}_>
WQ³]7_g%`
,
jV
Fe2+、Ca2+、Ba2+
+û_
g[}7v
。
2
QdYZ
wk`j£k`
Table2 Efectsofmetalionsandsurfactants
onlaccaseactivity
ÍÂi
v
½A}
e
/%
ÍÂi
v
½A}
e
/%
Añ
100 Mn2+ 98±11
Zn2+ 98±10 Ba2+ 37±03
Mg2+ 99±15 K+ 63±07
Fe2+ 31±50 EDTA 74±16
Cu2+ 114±25 Tris 73±07
Ca2+ 36±10 SDS 63±02
3
y
)
¬``°\}
、(NH4)2SO4、HiTrapphenyl
(FF)
ÂDw
QSepharoseFastFlow
廚
Az{
EIM 40
-./ÎG~F
,
ÅMF
|}
,
F&
146,
|¶&
53%。SDS
PAGE
Ñ7MÞ&Ox?
,
½A~Âu³&
653×104。
6¸(5tw
ABTS
&FXÎG
}v89
,
+À
pH
~&
48
w
45,
+˻
]~&
55
w
50℃,2
mXk
pH40~50
9
:U
,
ª]mJ
50℃
ç
,
}7²v1÷D
。
6¸
(5t&Xç
Km=6450μmol/L,6 ABTS&
Xç
Km=222μmol/L。Cu
2+
A}Æg%`
,
Fe2+、Ca2+、Ba2+
I+û_g}7v
。
L6j
:
[1]
Èå
,
NÎ
,
ËÌÍ
,
P
.
8K|}v
、
~Â/Xijq`
89ÎÏ
[J].
/XÕá¸x
,2011,9(2):4855.
[2] ShraddhaS,ShekherR,SehgalS,etal.Laccase:microbial
sources,production,purification,andpotentialbiotechnological
applications[J].EnzymRes,2011,doi:10.4061/2011/217861.
[3] DesaiSS,NityanandC.Microbiallaccasesandtheirapplication:
areview[J].AsianJBiotechnol,2011,3(2):98124.
83
/
X
Ð
O
²
³
!
10
"
[4] DwivediUN,SinghP,PandeyVP,etal.Structurefunctionrela
tionshipamongbacterial,fungalandplantlaccases[J].JMol
CatalB:Enzym,2011,68:117128.
[5] IbrahimV,MendozaL,MamoG,etal.BluelaccasefromGalerina
sp.:propertiesandpotentialforkraftlignindemethylation[J].
ProcBiochem,2011,46:379384.
[6] ZilyA,daSilvaCoelhoMoreiraJ,BrachtA,etal.Influenceof
NaClandNa2SO4onthekineticsanddyedecolorizationabilityof
crudelaccasefromGanodermalucidum[J].IntBiodeteriorBio
degrad,2011,65(2):340344.
[7] daSilvaCoelhoJ,deSouzaCG,deOliveiraAL,etal.Compara
tiveremovalofbentazonbyGanodermaluciduminliquidandsol
idstatecultures[J].CurMicrobiol,2010,60(5):350355.
[8]
q
,
Î%f
,
÷«c
,
P
.
8K|}7}ñËIø
[J].
/XÐO²³
,2009,7(4):18.
[9]
i=G
,
iÎ
,
ËÕÏ
,
P
.
z{:à.t|}7F
w}v
[J].
ÂÊFO
,2007,24(7):649652.
[10]
mU
.
6
ABTS
&X|}e7ñË
[J].
ÐÙ
,
2007,24(1):4345.
[11]
GÝÑ
,
9f
.
ÉÊÕáÞß
[M].
ë
:
§ß@b
,
2000:38122.
[12] YanKeliang,ZhangWen,YuHongbo,etal.Newpolysaccharide
compoundingofpolysaccharidesderivedfromsubmergedculture
GanodermalucidumandLyciumbarbarum[J].FoodTechnolBio
technol,2010,48(1):94101.
[13]
ÒÓã
.
z{
TR6
|}7~Fiv89
[J].
q`
IB/Xx
,2008,14(1):99103.
[14]
iÔÕ
,
i=G
.
z{.t
G1502
|}7~Fi}
v89
[J].
{Ô
,2008,29(5):
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
287291.
34(567
CN102335434A
Kx`fyz{1|}`~A1ÜØÙrs
K-f/Xb`à~Âf Ö/XÕáµ$
,
_×i]övØòvýÖ¤ìX
ijghñË
。
K-for(+4F7à]ýÖ¤%&
,HER 2
]öv
Fab¨
(%&Øò~Â
,
ýÖ¤ìX±Vx>
HER 2
]öv7
Fab¨
(k97ìX
。
s
M7ýÖ¤u]&³
100nm,HER 2
]öv
Fab¨
(j½A~Âu½®J7
1/3
23
。
ìX_>iD7Dv
,
pEfÂDvOÙ6ìX7Evþÿ
,¸
²
HER 2
]öv
7
Fab¨
(7Øò¨Å%`
,
î]OÙ6ìXk
HER-2
¯cv7OÙ6«Ú7trØò
,
lm
ìX`uwÛx%`
,
[àôõµ¶
。
CN102329767A
¾e¨%
èûõ¿trs
K-fÇB[J2ÜYÆD7/XlE=>Õáµ$7OmIÆDVHF ¸¹³YÝlE
KÞ7ñË
。
òгY
、
pp
、
WuÍ/
、
*/L
C
/7Bõ=>çUгÆDÎG³YÝl
EKÞ7õ HF
10~12`
%
,
*òгY
、
pp
、
WuÍ/w*/L
C
/7L*çUx
³õHF7ÆD
。
k
10~15℃、100r/min
7FGÅV
6~8d
*
,
ÎG3Idx
,
k3I:æ
J
6
:*HIM3ൣZÜYÆDV³YÝ7lEKÞ
。
(
{Am
)
93
!
2
# ÄÜfP
:
z{
EIM 40
|}7~Fi}v