全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2013, 48 (1): 87–93, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2013.00087
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收稿日期: 2012-06-11; 接受日期: 2012-08-30
基金项目: 高新技术研究发展计划(No.2011AA100202)
* 通讯作者。E-mail: b.s.zeng@vip.tom.com
农杆菌介导巨桉Eg5高效遗传转化
郭利军1, 2, 曾炳山1*, 刘英1
1中国林业科学研究院热带林业研究所, 广州 510520; 2海南省农业科学院热带果树研究所, 海口 571100
摘要 以巨桉(Eucalyptus grandis)无性系Eg5叶片为外植体, 探讨了农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染时间、共培
养pH值和共培养时间对瞬时转化效率的影响, 分析了不同筛选策略对遗传转化植株筛选效果的影响。结果表明, 外植体侵
染45分钟, 共培养pH值为5.8, 共培养3天所得到的瞬时转化效率最高; 逐步提高卡那霉素(Km)浓度筛选转基因植株有效,
筛选率达到15%, 转化率达到0.26%。经过GUS染色分析和PCR检测, 证实为转基因植株。
关键词 农杆菌, 巨桉, 遗传转化, 筛选策略
郭利军, 曾炳山, 刘英 (2013). 农杆菌介导巨桉Eg5高效遗传转化. 植物学报 48, 87–93.
Eg5是优良的巨桉(Eucalyptus grandis)无性系,
具有速生、干形通直、分枝角度小、出材率高等特点,
在我国江西南部、湖南南部、福建中部等南亚热带地
区广泛栽培, 但巨桉Eg5也存在青枯病抗性较低(祁
述雄, 2002)、抗寒能力不足等缺陷(林平, 2001; 曾炳
山等, 2010), 限制了巨桉Eg5的进一步推广。因此对
Eg5进行遗传改良具有重要的现实意义。
目前, 国内外对农杆菌(Agrobacterium tumefa-
ciens)介导巨桉进行遗传转化研究较少, 仅有农杆菌
介导巨桉无性系C101和Eg8的遗传转化报道, 而且
主要以茎段为外植体, 集中于研究抗生素敏感性和菌
液浓度对其遗传转化效率的影响(Yao and Wang,
2005)。本文以巨桉优良无性系Eg5叶片为外植体, 通
过分析农杆菌LBA4404介导Eg5转化的多个因素以
及不同筛选策略对巨桉遗传转化的影响, 最终得到转
化植株, 为巨桉的转基因育种奠定了理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
以生根培养45天左右的巨桉 (Eucalyptus grandis
W.Hill ex Maiden)无性系Eg5无菌生根苗为实验材
料。选取顶端完全展开的1–4片带叶柄的叶片为外植
体, 剪去占全叶1/3长度的叶尖部分。

1.1.2 基本培养基成分
农杆菌培养基为LB培养基, pH7.0。再生培养基为
MS+0.12 mg·L–1TDZ+0.25 mg·L–1NAA+30 g·L–1蔗
糖+6 g·L–1琼脂, pH5.8。

1.1.3 农杆菌菌株及载体质粒
所用菌株为华南农业大学提供的农杆菌菌株LBA-
4404, 内含载体质粒pBI121。该质粒携带CaMV35S
启动子、NOS终止子、NPTII基因和GUS基因。

1.1.4 农杆菌工程菌液的制备
取–75°C冻存的根癌农杆菌菌株LBA4404, 在冰上解
冻后划平板活化培养3天。挑取单菌落于4 mL液体LB
培养基中, 摇床每分钟180转过夜培养。当菌液OD600
值达到0.2后, 按照1:40(v/v)比例接入新鲜LB液体培
养基中。培养至OD600值为0.5, 2 810 ×g离心8分钟,
再用等量的液体再生培养基重悬菌体。

1.1.5 PCR扩增引物
采用引物(FP, GATTGAACAAGATGGATTGC; RP,
CCAAGCTCTTCAGCAATATC)进行NPTII基因序列
扩增, 产物长度为696 bp。
·技术方法·
88 植物学报 48(1) 2013
1.2 方法
1.2.1 基本转化条件
将修剪好的叶片外植体置于再生培养基中暗培养3
天, 于菌液浓度OD600值达0.5时进行侵染实验。

1.2.2 农杆菌LBA4404遗传转化影响因素的正交
实验设计
设定选用侵染时间(A)、共培养pH值(B)和共培养时间
(C)3个因素, 参考实验前期单因素优化实验数据。各
因素水平见表1。选用L16(44)正交实验表进行实验。

1.2.3 转化植株的筛选
采用卡那霉素(kanamycin, Km)和PRM进行筛选策略
的优化实验。前期实验已经确定了Km的筛选压为
17.5 mg·L–1和PRM的筛选压为7.14 mg·L–1。因此将
筛选分为3种处理: (A) 共培养结束后, 将叶片外植体
转接于含17.5 mg·L–1Km的再生培养基上; (B) 共培
养结束后, 将叶片外植体转接于含7.14 mg·L–1PRM
的再生培养基上; (C) 共培养结束后, 将外植体转入
只含100 mg·L–1头孢霉素(cefotaxime, Cef)的再生培
养基恢复培养7天, 然后转入含7.5 mg·L–1Km再生培
养基培养7天, 再转入含15 mg·L–1Km再生培养基培
养7天, 最后转入含17.5 mg·L–1Km的再生培养基。统
计不同筛选方案的转化率、逃逸率和筛选率。

1.2.4 GUS染色分析和PCR检测
参照Jefferson等(1987)的GUS组织化学染色法, 在
共培养结束后对叶片外植体和筛选出的拟转化再生
植株进行GUS染色。
采用改良的CTAB法提取拟转化植株的DNA, 操
作步骤参见姜清彬(2011)的方法。PCR反应条件为:
94°C预变性3分钟; 94°C变性1分钟, 50°C退火1分钟,


表1 正交实验各因素水平
Table 1 Levels of factors for orthogonal experimental de-
sign method
Factors
Level
A (min) B (pH) C (d)
1 15 5.2 1
2 30 5.4 2
3 45 5.6 3
4 60 5.8 4
72°C延伸2分钟; 循环30次; 72°C终延伸10分钟。

1.2.5 转化效果与筛选效果评价指标
转化效果的评价指标为瞬时表达率指数, 是指叶柄经
农杆菌侵染后整个叶柄被染色面积大小的程度。
瞬时表达率指数=(x1+2x2+3x3+4x4)/4(x0+x1+x2+
x3+x4)
瞬时表达率指数采用分级计数法, 各字母代表数
值见表2。分级计数法具体内容参见方中达(1979)所
述方法。
其它指标如下:
再生率=(再生外植体数量 /总外植体数量 )×
100%;
转化率=(转化外植体数量 /总外植体数量 )×
100%;
筛选率=(转化外植体数量 /再生外植体数量)×
100%;
逃逸率=(再生外植体数量–转化外植体数量)/总
外植体数量×100%。

1.2.6 统计分析
所有百分数经平方根反正弦化ASIN(SQRT(X)), 个
数经平方根转化SQRT(X)。采用SPSS18.0分析软件
进行方差分析 (ANOVA)和Duncan’s多重比较 (P=
0.05)。文中数据为未转化数据均值。
2 结果与讨论
2.1 共培养条件对瞬时表达的影响
以瞬时表达率指数作为遗传转化评价指标。从表3可



表2 巨桉Eg5叶柄侵染效果分级
Table 2 Grading of infection effect on the petiole of Euca-
lyptus grandis clone Eg5
Grade Effect of infection
on petiole (p)
Repre-
sentative
value
No. of petiole
with blue stain
S0 No blue stain 0 x0
S1 0＜P≤1/4 petiole 1 x1
S2 1/4＜P≤1/3 petiole 2 x2
S3 1/3＜P≤1/2 petiole 3 x3
S4 1/2＜P≤1 petiole 4 x4
郭利军等: 农杆菌介导巨桉 Eg5 高效遗传转化 89
表3 正交实验各因素极差分析
Table 3 Range analysis of factors for orthogonal experimental design method
Column Assessment index No. of experiment
A B C Blank column Transient expression efficiency index
1 1 1 1 1 0.11
2 3 1 3 3 0.22
3 4 1 4 4 0.18
4 2 1 2 2 0.11
5 4 3 1 2 0.22
6 3 2 1 4 0.19
7 2 4 1 3 0.17
8 4 4 3 1 0.33
9 1 4 2 4 0.04
10 3 3 2 1 0.08
11 3 4 4 2 0.43
12 1 2 3 2 0.33
13 1 3 4 3 0.14
14 4 2 2 3 0.06
15 2 3 3 4 0.25
16 2 2 4 1 0.25
X 1 0.16 0.16 0.17
X 2 0.20 0.21 0.07
X 3 0.23 0.17 0.28
X 4 0.20 0.24 0.25
R 0.07 0.08 0.21
X i(i=1–4)表示不同因素同一水平瞬时表达指数的均值, R表示瞬时表达指数的极差。
X i(i=1–4) indicates sum mean of the transient expression efficiency index of different factors at the same level; R indicates the
difference between the maximum and minimum values of X i value.


以看出, C因素的极差最大, 达到0.21, A因素和B因
素的极差分别达到0.07和0.08, 三因素的诱导效应表
现为C>B>A。其中, A因素的第3水平最好, B因素的第
4水平最好, C因素的第3水平最好。各因素的最好搭
配是A3B4C3。
为了准确判断各因素对遗传转化效果影响的程
度, 进一步对上述正交实验进行了方差分析。由表4
中Sig.值可知, C因素Sig.值为0.04, 对结果的影响达
到了显著水平, 是影响瞬时表达指数的主要因素; B
因素Sig.值为0.48, 对结果影响次之; A因素Sig.值为
0.65, 对结果影响最小。A、B两因素对结果的影响未
达到显著水平, 各因素对瞬时表达指数的影响程度为
C>B>A。方差分析结果与极差分析结果完全一致, 表
明C因素是影响遗传转化的主要因素。
为了验证A3B4C3组合的遗传转化效果, 进一步
进行了验证实验。验证结果表明瞬时表达率和瞬时表
表4 正交实验主效应方差分析
Table 4 ANOVA of subjects effects for orthogonal experi-
mental design method
Variation
source
Type III sum
of squares
df Mean
square
F Sig.
Infection
time
0.01 3 0.00 0.59 0.65
Co-culture
pH
0.02 3 0.01 0.94 0.48
Co-culture
time
0.11 3 0.04 5.42 0.04
Error 0.04 6 0.01
Total 0.78 16


达指数均较佳, 3次验证均值分别为84.83%和0.45。
2.2 抗生素对芽分化的影响
为了抑制非转化芽和得到高比例的转基因植株, 设定
90 植物学报 48(1) 2013
表5 巨桉Eg5转基因植株筛选策略
Table 5 Selection strategies of transgenic plants of Eucalyptus grandis clone Eg5
Selection scheme Total explants Regeneration
explants
Transformation
efficiency (%)
Escapement rate
(%)
Selection efficiency
(%)
A 624 2 0.00 0.32 0
B 576 0 0.00 0.00 0
C 1 138 20 0.26 1.49 15


不同的筛选方案进行转化植株的筛选, 结果见表5。
方案A, 外植体分化速度极慢, 最终褐化死亡, 得到
少量的芽, 通过进一步鉴定为假阳性植株。方案B, 外
植体褐化较为严重, 叶柄处呈现黑褐色, 未得到转化
植株。上述两方案表明, 直接添加抗生素至最大筛选
压不利于转化细胞的生长分化, 很难得到转化植株。
在方案C中采取逐步提高筛选压的方法, 允许部分非
转化细胞的生长, 最终得到20个株系, 经过鉴定其中
3个为转基因植株。说明阶梯式提高Km对于筛选转化
植株是有效的, 对于提高转化植株的再生率有促进作
用。但阶梯式提高Km浓度会导致逃逸率的升高(表5),
增加了后期转基因植株筛选的难度。
2.3 转基因植株的检测
菌株LBA4404共转化4个批次, 共计191瓶1 138片外
植体, 筛选出20个再生外植体。将其置于增殖培养基
上进行快繁, 待芽伸长至2 cm左右时剪切提取DNA,
设计引物进行PCR扩增。结果(图1)表明, 阳性对照及
验证植株1、2、3均在696 bp处显示了条带, 阴性对
照未出现条带, 证实NPTII基因已经整合到核基因组
中。为了进一步检测GUS基因是否表达, 选取再生过
程中在卡那霉素中正常生长的成团小芽和3个转基因
株系的叶片进行GUS染色检测。结果表明, 成团的小
芽(图2A)和3个拟转化株系(图2B)均显示蓝色, 尤其
在幼嫩的叶片中染色均匀, 而对照未出现蓝色。
以上结果说明GUS基因已经转化到巨桉无性系
Eg5中 , 而且能够正常表达。但转化率略低 , 仅为
0.26%, 需要进一步优化条件。
2.4 讨论
本研究将瞬时表达率指数作为评价转化效果的一项
指标, 并且通过对巨桉转基因植株不同的筛选策略进
行比较, 得到了有效的转化筛选方法。初步建立了农
杆菌LBA4404介导巨桉Eg5遗传转化体系 , 并经
GUS染色和PCR检测证实得到了转基因植株。

2.4.1 影响遗传转化的因素
本研究结果表明, 相对于侵染时间和共培养pH值,
共培养时间是影响遗传转化效果的关键因素。
González等(2002)采用LBA4404对数生长后期的菌
液侵染尾巨桉(Eucalyptus grandis × E. urophylla)发
芽期的种子, 共培养时间为2天。Prakash和Gurum-
urthi(2009)也采用LBA4404对数生长后期的菌液侵
染细叶桉的子叶和下胚轴并共培养2天。Mullins等
(1997)采用OD600值为1.0菌液侵染赤桉(Eucalyptus
camaldulensis)叶片并共培养2天。可见LBA4404介



图1 巨桉Eg5转基因植株NPTII基因的PCR检测
CK+: PBI121质粒; CK–: 野生型对照; 1–3: 转化植株

Figure 1 NPTII gene PCR detection of the transgenic plants
of Eucalyptus grandis clone Eg5
CK+: Plasmid DNA; CK–: DNA from wild-type plantlets; 1–3:
Transformants resistant to Km

郭利军等: 农杆菌介导巨桉 Eg5 高效遗传转化 91


图2 巨桉Eg5转基因植株GUS染色鉴定
(A) 转化的再生芽; (B) 转化植株的叶片

Figure 2 Histochemical GUS expression in transformed tissues of Eucalyptus grandis clone Eg5
(A) Regenerated buds; (B) Leaf of transgenic plant


导桉树的遗传转化多采用对数生长后期菌液侵染, 进
行共培养2天。本研究结果表明, 采用OD600值为0.5
菌液侵染巨桉Eg5叶片并共培养3天会取得最佳的遗
传转化效果, 与上述研究所得的共培养时间略有不
同。LBA4404介导的杨树(Populus)遗传转化共培养
时间也多为2–3天(Fillatti et al., 1987; Kajita et al.,
1994; Mohri et al., 1996; 樊军锋, 2002; Thakur et
al., 2005), 火炬松(Pinus taeda)共培养时间为3–5天
(Tang, 2000, 2001)。进一步分析造成共培养时间不
同的原因可能有2点: (1) 不同树种对LBA4404敏感
性不同, 桉属和杨属树种对农杆菌较为敏感, 而裸子
植物不易进行农杆菌转化, 对农杆菌最不敏感; (2)
菌液浓度和侵染时间的不同造成最适共培养时间不
同。
在前期的偏相关分析中发现, 侵染时间也是促
进遗传转化的因素。LBA4404作为非毒力菌株已经被
广 泛 用 于 桉 树 的 遗 传 转 化 研 究 。 Prakash 和
Gurumurthi(2009)采用指数期晚期菌液侵染细叶桉
10分钟。Aggarwal等(2011)采用OD600值为0.8菌液侵
染细叶桉3个无性系0–30分钟不等。Spokevicius等
(2005) 采 用 高 浓 度 菌 液 稀 释 20 倍 侵 染 蓝 桉
(Eucalyptus globules)茎段2–10分钟。本研究采用
OD600值为0.5的LBA4404菌液侵染巨桉Eg5叶片外
植体45分钟所获得的转化效果最佳。由此可知 ,
LBA4404介导的遗传转化研究中采用的侵染浓度和
时间存在一定的差异, 可能是本研究采用对数生长中
期菌液, 导致侵染时间延长才能达到较好的侵染效
果。此外, 由Spokevicius等(2005)的研究结果可以推
测, LBA4404对蓝桉的侵染力比巨桉和细叶桉强, 所
以侵染时间较短便能达到较好的染色效果, 但是桉属
树种多采用OD600值在0.5以上的较浓菌液处理外植
体0–45分钟(Aggarwal et al., 2011; Alcantara et al.,
2011), 这与本研究结果一致。笔者前期研究发现, 叶
片外植体经过含500 mg·L–1Cef的液体再生培养基处
理后, 置于100 mg·L–1Cef培养基中便可以抑制农杆
菌的生长, 侵染45分钟不会造成后期农杆菌的过度
繁殖(郭利军等, 2012)。

2.4.2 筛选策略对遗传转化的影响
遗传转化因素的优化是提高转化效率的重要方面, 高
效的筛选策略对于转化率的提高也极为重要。本研究
表明, 共培养结束后的叶片外植体立即置于最大筛选
压培养基中进行筛选会导致外植体的褐化死亡。虽然
得到2个单芽, 主要是由于外植体没有完全浸入培养
基, 导致逃逸发生。经验证, 并未得到转基因芽。目
前桉树的转基因芽筛选方法多是将共培养结束后的
92 植物学报 48(1) 2013
外植体置于最大筛选压培养基中进行筛选, 相关研究
也得到转化芽(Ho et al., 1998; Prakash and Guru-
murthi, 2009; Aggarwal et al., 2011; Oliveira et al.,
2011)。在本研究中还发现Eg5的本底抗性为17.5
mg·L–1, 较其它桉树中40–50 mg·L–1的Km本底抗性
低, 推测未得到转化芽主要原因是由于Eg5叶片对卡
那霉素比较敏感。通过逐步提高抗生素筛选压筛选转
化植株也应用于其它植物中(Petri et al., 2008)。在本
研究中筛选效率达到15%, 转化率达0.26%, 与置于
最大筛选压筛选柳叶桉(Eucalyptus saligna)相比(转
化率为0.0075%)有明显提高(Oliveira et al., 2011)。
由于早期选择压越小, 在转化细胞的保护作用下, 非
转化细胞的逃逸率会大大提高, 所以需要早期适当提
高筛选压, 可能有助于提高筛选效率, 降低逃逸率
(Cervera et al., 1998)。

2.4.3 转基因植株GUS染色
本研究的GUS染色结果表明, 转化外植体中相对较
大的叶片染色效果较差, 相对细小的叶片染色效果较
好。姜清彬 (2011)制作了细枝木麻黄 (Casuarina
cunninghamiana)的转基因植株的石蜡切片 , 表明
GUS染色液对幼嫩的组织有较好的染色效果, 但是
染色液不能渗透到更深的组织细胞中, 尾巨桉和柳叶
桉转化GUS基因的图片也表明了这一点(González et
al., 2002; Da Silva et al., 2011; Aggarwal et al.,
2011)。分析其原因可能是幼嫩的叶片表面蜡质层很
薄, 叶片幼嫩, 相对容易染色, 染色效果好。随着转
化植株的生长, 叶片和蜡质层逐渐变厚, 影响了GUS
染色液渗透叶片的效果, 导致染色效果不佳。
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Lijun Guo1, 2, Bingshan Zeng1*, Ying Liu1
1Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, China
2Tropical Fruit Research Institute, Hainan Academy of Agricultural Sciences, Haikou 571100, China
Abstract In this study, we used Eucalyptus grandis clone Eg5 leaves as explants to study the influence of infection time,
co-culture pH values and co-culture time on transient expression efficiency. We analyzed the effects of different selection
strategies on transgenic plants. Infection time of 45 min, co-culture pH of 5.8, and co-culture time of 3 days achieved the
best transient expression efficiency. Screening transgenic plantlets by gradually improving kanamycin concentration in-
creased the selection efficiency to 15% and transformation efficiency was 0.26%. The plantlets were confirmed by GUS
staining and PCR analysis.
Key words Agrobacterium tumefaciens, Eucalyptus grandis, genetic transformation, selection strategies
Guo LJ, Zeng BS, Liu Y (2013). Agrobacterium-mediated high-efficient transformation of Eucalyptus grandis clone Eg5.
Chin Bull Bot 48, 87–93.
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* Author for correspondence. E-mail: b.s.zeng@vip.tom.com
(责任编辑: 白羽红)