全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2014, 49 (5): 587–594, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2014.00587
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收稿日期: 2013-08-01; 接受日期: 2013-12-11
基金项目: 国家自然科学基金(No.31270368)、国家重点基础研究发展计划(No.2010CB126006)和陕西省农业攻关项目(No.2011K02-09)
† 共同第一作者
* 通讯作者。E-mail: jnyu@snnu.edu.cn
农杆菌介导的棉花子叶瞬时表达系统的建立
刘雪梅†, 王蕾†, 文添龙, 何鹏, 俞嘉宁*
陕西师范大学生命科学学院, 西安 710119
摘要 植物瞬时表达系统在研究功能基因的亚细胞定位、蛋白质互作、启动子活性等方面具有重要作用。选取棉花
(Gossypium hirsutum)子叶为材料, 以β-葡糖醛酸酶基因(GUS)、增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)为报告基因, 对棉花子叶
生长时间、农杆菌浓度、注射量、共培养时间等因素进行了分析, 建立了农杆菌介导的棉花子叶瞬时表达系统。结果表明,
对萌发6天的棉花子叶注射50 µLOD600为0.5的含目的基因的农杆菌LBA4404或GV3101, 共培养2–3天后, 外源基因表达
效率最高。利用此方法从棉花萌发到观测结果, 仅需8–13天, 且操作简单易行, 可快速检测棉花来源的启动子活性、亚细
胞定位、蛋白质互作等。该方法在棉花基因功能研究方面有很好的应用价值。
关键词 棉花, 基因功能研究, 报告基因, 瞬时表达
刘雪梅, 王蕾, 文添龙, 何鹏, 俞嘉宁 (2014). 农杆菌介导的棉花子叶瞬时表达系统的建立. 植物学报 49, 587–594.
棉花(Gossypium hirsutum)是世界纺织业的主要
原材料, 有很高的经济价值和应用价值。近年来, 棉
花的基因组测序已经完成, 其中有44.9 Mb的基因已
被注释(Paterson et al., 2012)。随着注释基因的不断
增多, 需要寻找一种快速有效的方法对基因功能进行
分析。使用瞬时表达系统操作简单, 无需特殊仪器设
备, 外源基因的表达效率高且安全, 不易产生基因漂
移 (邱初等 , 2009; Grefen et al., 2010; 蓝岚等 ,
2013)。同时此方法可有效避免基因沉默等, 在基因
功能分析及亚细胞定位方面应用广泛(Grebenok et
al., 1997; Li et al., 2011)。
目前, 农杆菌介导的植物瞬时表达系统已在许多
植物中建立并应用, 如大豆(Glycine max)、拟南芥
(Arabidopsis thaliana)(Koroleva et al., 2005)、红花
(Flos carthami)(Belide et al., 2011; 杨晶等, 2011)、
油菜(Brassica campestris)(谭小力等, 2012)以及玉
米 (Zea mays)、水稻 (Oryza sativa)等 (李浩戈等 ,
2012)。近年来, 棉花中瞬时表达系统主要利用愈伤
组织经酶解处理后形成的原生质体来完成。该方法能
快速检测棉花功能基因的瞬时表达、亚细胞定位等,
但操作繁琐, 需要基因枪进行外源基因的转化, 实验

成本高(李杰等, 2003; Shibasaki et al., 2012)。本实
验以棉花子叶为材料, 利用农杆菌注射法建立了瞬时
表达系统, 确定了子叶的最佳生长时期、注射菌量以
及共培养时间等。在此基础上 , 构建了35S-eGFP
(pG3)表达载体, 对棉花子叶进行了转化。实验结果
表明, 该方法不仅适用于带GUS标签的基因, 也适合
带eGFP标签的基因功能研究。上述方法的建立有助
于棉花功能基因的亚细胞定位、蛋白质互作以及启动
子活性等研究。
1 材料与方法
1.1 实验材料
棉种柯字312(Gossypium hirsutum cv. ‘Coker 312’)系
河北农业大学马峙英教授馈赠。pGEM-T Easy载体购
自Promega公司。农杆菌 (Agrobacterium tumefa-
cien)LBA4404菌株由北京大学朱玉贤教授惠赠。含
pCAMBIA2301的GV3101菌种由江苏大学生命科学学
院谭小力教授惠赠。含eGFP的pUCegfpC质粒为西北
农林科技大学王倩老师惠赠。农杆菌GV3101菌株、大
肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株为本实验室保存。
·技术方法·
588 植物学报 49(5) 2014
1.2 实验方法
1.2.1 植物培养
选取饱满的种子, 在37°C水浴中浸泡14小时, 播种
于盛有培养土(蛭石:营养土=1:3, v/v)的小钵中, 覆膜
后于28°C、光暗周期为16小时/8小时的室内培养。待
发芽后去膜, 生长数天后用于实验。

1.2.2 子叶注射及共培养
吸取200 μL含pCAMBIA2301的GV3101菌液添至10
mL含50 mg·L–1卡那霉素(Kan)、50 mg·L–1利福平
(Rif)和20 mg·L–1庆大霉素(Gent)的LB液体培养基中,
于28°C、每分钟180转振荡培养至所需OD600值时,
10 000 ×g离心1分钟。收菌, 除去上清, 用含100
μmol·L–1乙酰丁香酮与10 mmol·L–1硫酸镁的MS侵染
液悬浮菌体, 得到转化液。
挑选生长状态良好且生长一致的棉花子叶, 用蒸
馏水清洁叶片背面, 蘸75%乙醇擦拭, 再用蒸馏水清
洗残留乙醇。选用背面叶脉部位, 用去掉针头的注射
器注射转化液, 注射完毕后用蘸有蒸馏水的棉签清洁
叶片背面。将注射后的棉株放入25°C、光暗周期为16
小时/8小时的培养箱中培养。

1.2.3 GUS染色及活性检测
将共培养一定天数的子叶用蒸馏水清洗后置于GUS
染色液中 (每 100 mLGUS染液中含有 2.1 mmol
NaH2PO4, 2.9 mmol Na2HPO4, 0.5 mmol EDTA,
pH7.0; 0.1 mmol KFe(CN)4, 0.1 mmol KFe(CN)3,
0.1 mLTritonX-100, 0.1 g X-Gluc), 于37°C每分钟
180转振荡染色24小时 , 然后置于真空泵中 , 0.08
MPa抽真空30分钟, 继续振荡染色48分钟, 除去染
色液。将子叶置于无水乙醇中脱色8小时, 观察并拍
照。
用MUG法(Viana et al., 2011)提取不同处理后且
共培养一定天数的棉花子叶总蛋白。吸取上清100
µL, 加入到400 µL经37°C预热的GUS提取缓冲液(每
100 mLGUS提取缓冲液中含有50 mL 0.1 mol·L–1 pH
7.0的磷酸缓冲液, 1 mL 10% SDS, 2 mL 0.5 mol·L–1
pH 8.0的EDTA, 100 µLTriton X-100, 100 µLβ-巯基
乙醇), 再加入500 µL MUG底物(8.8 mg MUG, 溶于
10 mLGUS酶提取液中), 37°C温浴。立即取出200 µL
加入到800 µL反应终止液(0.2 mol·L–1Na2CO3)中混
匀, 此标记为1号管, 在室温下避光保存。此为反应0
时的样品, 荧光测定时以此为空白, 并开始计时。将
反应管放入37°C水浴中进行酶反应, 60分钟后, 取
200 µL反应液, 加入到800 µL反应终止液中混匀, 此
标记为2号管, 为反应60分钟时的样品。用多功能微
孔测量仪(美国EnSpire)在激发波长365 nm、发射波
长455 nm、狭缝10 nm时测定不同时间点的荧光强度
值。根据4-甲基伞形酮(4-MU)制作的标准曲线得出
GUS活性(Y=(C2号管–C1号管)/C总蛋白/时间(h))。

1.2.4 35S-eGFP融合表达载体的构建
以pUCegfpC质粒为模板 , 上、下游引物分别为
eGFP1_F(5′-TCTGAATTCATGGTGAGCAAGGGC
GAG-3′)和eGFP2_R(5′-TTCTCTAGATTACTTGTA-
CAGCTCGTCC-3′)。用高保真酶PrimeSTAR(Ta-
KaRa)扩增获得eGFP基因序列(5′端和3′端分别含
EcoRI和XbaI酶切位点), 连入pGEM-T Easy载体。测
序验证后将该质粒命名为 pG1。将质粒 pG1与
pKannibal分别用EcoRI/XbaI酶切, 回收相应片段连
接并测序后得到pG2质粒。将pG2用NotI酶切, 回收
35S-eGFP片段, 连接到pART27载体中, 转化大肠
杆菌DH5α, 经蓝白斑筛选获得阳性克隆, 测序正确
后命名为pG3。采用冻融法将pG3转入农杆菌LBA-
4404和GV3101中 , 并分别命名为LBA-pG3和GV-
pG3。

1.2.5 农杆菌转化及eGFP荧光检测
将农杆菌LBA-pG3和GV-pG3培养至OD600为0.5, 收
集3 mL菌液加入900 mL MS培养基和100 mL乙酰丁
香酮悬浮后使用。
挑选生长6天的棉花幼苗, 在其子叶背面注射含
LBA-pG3或GV-pG3的农杆菌转化液。棉花子叶共培
养1–11天后, 采集叶片, 置于倒置荧光显微镜(莱卡
DMIL LED)下, 在490 nm蓝色激发光下观察eGFP的
表达。

1.2.6 半定量PCR检测
采集共培养3天的棉花子叶, 用打孔器在注射位置取
材, 保证材料直径均为1.3 cm。用试剂盒(Plant RNA
Kit, OMEGA Bio-tek)提取总RNA。取1 μg RNA用逆
刘雪梅等: 农杆菌介导的棉花子叶瞬时表达系统的建立 589
转录试剂盒(Prime ScriptTM RT Reagent Kit Perfect
Real Time)逆转成cDNA。以cDNA为模板, 棉花Actin
为内参基因 ( 上、下游引物分别为 Actin_F, 5′-
AGCTATGAGTTGCCTGATGG-3′; Actin_R, 5′-AT-
TGTAAGTGGTCTCGTGAATA-3′), 以 eGFP_F(5′-
AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3′) 和 eGFP_R1(5′-
TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3′)分别作为上、下
游引物进行PCR扩增。PCR反应体系(总体积为25
µL): 12.5 µL 2×Taq PCR Mix, 1 µL cDNA, 上、下游
引物(10 μmol·L–1)各2 µL, 7.5 µLddH2O。PCR反应程
序为: 95°C预变性5分钟; 95°C变性1分钟, 60°C复性
1分钟, 72°C延伸1.5分钟, 30个循环; 72°C终延伸10
分钟。反应产物于4°C保存。

1.2.7 免疫组织化学检测eGFP蛋白
采集共培养3天的棉花子叶, 用打孔器取直径为1.3
cm的组织圆片, 经甲醇脱色、崩溃酶(Sigma)裂解细
胞壁以及0.08 MPa抽真空30分钟, 增加叶片渗透性
后, 加入eGFP抗体, 37°C孵育3小时, 漂洗后加入显
色剂DAB, 30分钟后用蒸馏水洗涤以停止反应。具体
步骤参见文献(Sauer et al., 2006)所述。
2 结果与讨论
2.1 棉花子叶瞬时表达系统的建立
不同生长时期的子叶对农杆菌的侵染和外源基因的
表达有重要的影响。本实验采用萌发后生长2、6、10、
14和 18天的子叶为材料 , 用含 pCAMBIA2301的
GV3101菌液(50 µL农杆菌, OD600=0.5)(简称含GUS
基因的农杆菌)注射棉花子叶的背面叶脉部位, 共培
养2天后, 取整片子叶进行GUS染色。结果(图1A)显
示, 随着子叶生长期的延长, GUS染色逐步明显, 至
第6天达到高峰, 之后GUS染色呈现降低趋势, 至18
天时几乎不显色。其中, 注射部位及其周围(0.2–1.0
cm)为GUS显色部位。同步采集注射后共培养2天的
子叶, 用MUG法定量分析GUS酶活性, 结果与上述
定性分析结果具一致性(图1B)。实验表明生长6天的
子叶最适合转化。
有文献报道农杆菌浓度对叶片侵染的结果有直
接影响(张福丽等, 2012)。本实验选取OD600为0.3、
0.4、0.5和0.6的含GUS基因的农杆菌50 µL分别对萌


图1 不同生长天数的棉花子叶GUS染色结果(A)及定量分析
结果(B)
A1、A2、A3、A4和A5分别为生长2、6、10、14和18天的子叶
经注射农杆菌、共培养2天后的GUS染色结果。平均值
±SD(n>5); t检验值** P<0.01; * P<0.05; 黑色圆圈中显示农杆
菌注射位点

Figure 1 GUS staining (A) and quantitative analysis (B) of
cotton cotyledon with different growth days
A1, A2, A3, A4, and A5 indicate GUS staining of cotyledons
grow up to 2, 6, 10, 14, and 18 days, respectively, and
co-cultured 2 days after injecting Agrobacterium. Values are
means±SD (n>5); Asterisks indicate significant differences
calculated with t test (**P<0.01; * P<0.05); Black circle shows
the injection site


发后生长6天的子叶进行注射, 共培养2天后, 进行
GUS染色(具体操作同上)。结果(图2A)显示, 随着注
射菌液浓度的增加, GUS染色的色斑变得明显, 至注
射浓度OD600为0.5时达到最佳状态, 之后GUS染色
呈现下降趋势。同步采集注射后共培养2天的子叶,
提取总蛋白, 定量分析其中GUS蛋白含量, 结果与上
述定性分析结果一致 (图2B)。实验表明注射浓度
OD600为0.5时染色最明显, 此时的转化效率最高。
为了确定菌液最佳注射量, 用OD600为0.5的含
GUS基因的农杆菌注射液, 对培养6天的棉花子叶进
行注射, 注射量分别为20、30、50、100和150 µL。
共培养2天后, 进行GUS染色(具体操作同上)。结果
(图3A)显示, 随着注射量的逐步增加, 子叶的显色部
位有明显变化, 至注射量为50 µL时染色效果最好,
注射量为100和150 µL时GUS染色效果下降。同步采
集注射后共培养2天的子叶, 定量分析其中的GUS蛋
白含量, 结果与上述定性分析结果一致(图3B)。实验
590 植物学报 49(5) 2014

图2 棉花子叶注射不同OD600值的农杆菌GUS染色(A)及定量
分析结果(B)
A1、A2、A3和A4分别为子叶经注射OD600为0.3、0.4、0.5和
0.6的农杆菌、共培养2天后GUS染色结果。平均值±SD(n>5); t
检验值 * P<0.05; 黑色圆圈中显示农杆菌注射位点

Figure 2 GUS staining (A) and quantitative analysis (B) of
cotyledons injected different OD600 Agrobacterium
A1, A2, A3, and A4 indicate GUS staining of cotyledons
injected Agrobacterium with OD600=0.3, 0.4, 0.5, and 0.6,
respectively and co-cultured 2 days. Values are means±SD
(n>5); Asterisks indicate significant differences calculated with t
test (* P<0.05); Black circle shows the injection site


图3 棉花子叶注射不同菌量的农杆菌GUS染色(A)及定量分
析结果(B)
A1、A2、A3、A4和A5分别为注射20、30、50、100和150 µL
农杆菌的子叶共培养2天后GUS染色结果。平均值±SD(n>5); t
检验值 * P<0.05; 黑色圆圈中显示农杆菌注射位点

Figure 3 GUS staining (A) and quantitative analysis (B) of
cotyledons injected different volumes Agrobacterium
A1, A2, A3, A4, and A5 indicate GUS staining of cotyledons
injected 20, 30, 50, 100, and 150 µL Agrobacterium, respect-
tively and co-cultured 2 days. Values are means±SD (n>5);
Asterisks indicate significant differences calculated with t test
(* P<0.05); Black circle shows the injection site

图4 不同共培养天数的棉花子叶GUS染色结果(A)及定量分
析结果(B)
A1、A2、A3和A4分别为注射农杆菌的子叶共培养1、2、3和4
天后GUS染色结果。平均值±SD(n>5); t检验值 * P<0.05; 黑色
圆圈中显示农杆菌注射位点

Figure 4 GUS staining (A) and quantitative results (B) of
cotyledons with different co-culture days
A1, A2, A3, and A4 indicates GUS staining of cotyledons
injected Agrobacterium and co-cultured 1, 2, 3, and 4 days,
respectively. Values are means±SD (n>5); Asterisks indicate
significant differences calculated with t test (* P<0.05); Black
circle shows the injection site


表明OD600为0.5的农杆菌注射量为50 µL染色效果最
好, 此时的转化效率最高。
本实验还探讨了不同共培养时间对侵染结果的
影响。用50 µLOD600为0.5含GUS基因的农杆菌注射
液对培养6天的子叶进行注射, 分别共培养1、2、3和
4天后, 进行GUS染色(具体操作同上)。结果(图4A)
显示, 随着共培养时间的延长, GUS染色逐渐明显。
其中在共培养2天时, GUS染色效果最好, 随后染色
效果降低。同步采集注射后共培养2天的子叶, 定量
分析其中的GUS蛋白含量, 结果与上述定性分析结
果一致(图4B)。实验表明共培养2天GUS染色效果最
好, 此时的转化效率最高。
2.2 棉花子叶瞬时表达eGFP的荧光检测
采集注射农杆菌LBA-pG3和GV-pG3后共培养1–11
天的棉花子叶, 置于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光
蛋白的表达。结果(图5)显示, 随着共培养时间的延长,
绿色荧光强度呈逐渐增强的趋势, 至3–5天后荧光强
度下降。其中注射LBA-pG3的处理组中, 在共培养
刘雪梅等: 农杆菌介导的棉花子叶瞬时表达系统的建立 591


图5 棉花子叶瞬时表达eGFP的荧光强度观测
(A), (F) 分别为注射空载LBA4404和GV3101的阴性对照; (B)–(E) LBA4404介导的eGFP基因在共培养1、3、5和11天的表达情况;
(G)–(J) 农杆菌GV3101介导的eGFP基因在共培养1、3、5和11天的表达情况。Bar=25 μm

Figure 5 Green fluorescence observation of eGFP in transient expression system of cotton cotyledons
(A), (F) The negative control of LBA4404 and GV3101, respectively; (B)–(E) The expression of eGFP mediated by LBA4404 and
co-cultured for 1, 3, 5, and 11 days, respectively; (G)–(J) The expression of eGFP mediated by GV3101 and co-cultured for 1, 3,
5, and 11 days, respectively. Bar=25 μm


2天时有微量表达, 至3天时观察到的绿色荧光强度
最强, 且显著优于同期注射GV-pG3的处理组。实验
结果表明eGFP的表达在3天时效果最佳, 且棉花子
叶瞬时表达系统选择注射农杆菌LBA4404介导的外
源基因表达效果比GV3101更好。
2.3 棉花子叶瞬时表达eGFP的定量分析
为了进一步确定上述实验中所观察到的绿色荧光是
eGFP表达的结果, 本实验选取注射后共培养3天的
子叶用半定量PCR法进行RNA水平的检测及免疫组
化分析。以cDNA为模板, Actin基因为内参, 对eGFP
基因表达进行半定量PCR检测(图6A)。以质粒为阳性
对照, 注射不含目的基因的空载农杆菌LBA4404为
阴性对照, 结果显示, 在cDNA模板量相同的条件下,
阴性对照中扩增不到目的条带, 而注射LBA-pG3能
扩增出eGFP条带。表明注射农杆菌LBA4404介导的
eGFP能在棉花子叶中表达, 且在共培养3天时表达
效果较好。为了进一步确定eGFP蛋白的表达情况,
本实验还进行了棉花叶片免疫组织化学检测, 以显示
eGFP蛋白的位置及含量。取共培养3天的棉花子叶,
经处理增加叶片渗透性后, 加入eGFP抗体孵育, 用
SABC染色试剂盒进行检测, 结果如图6B–D所示。图
6中深色圆点为细胞核, 小圆点及染色部分为表达的
eGFP蛋白。与对照组(图6B)相比, 生长6天的棉花子
叶注射50 μLOD600为0.5的LBA-pG3后, 培养3天, 确
有eGFP蛋白的表达。其中, 农杆菌注射部位1.3 cm
区域内的eGFP蛋白的表达量(图6D)大于注射部位
1.3 cm区域外eGFP蛋白的表达量(图6C)。上述结果
表明棉花瞬时转化系统可以成功表达外源基因。
2.4 讨论
外源基因导入宿主细胞后有两种表达模式, 一是整合
到宿主细胞基因组中稳定表达; 二是以质粒形式导入
宿主细胞后瞬时表达。由于后者快速且方便已被广泛
应用到基因工程中(Shibasaki et al., 2012)。植物瞬时
表达系统不会产生基因沉默、基因漂移等, 可有效避
免基因污染, 是检测外源基因表达情况的理想方法。
棉花外源基因的稳定表达是个复杂的长期过程(Cha-
kravarthy et al., 2014 ), 建立一个快速、经济、安全
的瞬时表达系统对研究棉花基因功能有重要意义。
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图6 棉花子叶瞬时表达eGFP的半定量PCR检测(A)及免疫组
化分析结果(B–D)
(A) 1, 2, 3为空白对照, pG3质粒扩增eGFP结果, 注射空载体
LBA4404的阴性对照; 4, 5为注射含eGFP的LBA-pG3农杆菌子
叶, 均为共培养3天后eGFP的半定量扩增结果; (B) 注射空载
体LBA4404的阴性对照; (C) 注射含eGFP的LBA-pG3农杆菌
的子叶共培养3天后, 注射部位1.3 cm区域外取材的免疫组化
结果; (D) 注射含eGFP的LBA-pG3农杆菌的子叶共培养3天后,
注射部位1.3 cm区域内取材的免疫组化结果

Figure 6 Results of semi-quantitative PCR (A) and immu-
nohistochemistry (B–D) of eGFP in cotton cotyledons
transient expression system
(A) Line 1, 2, and 3 indicates blank control, the amplification
of eGFP fragment from pG3 plasmid, negative control of
LBA4404 without eGFP gene, respectively; Line 4 and 5
indicates the semi-quantitative amplification results of coty-
ledons injected with Agrobacterium LBA-pG3 which contain
eGFP gene and co-cultured for 3 days; (B) Negative control
of LBA4404 without eGFP gene; (C) Immunohistochemistry
results of cotyledons injected with Agrobacterium LBA-pG3
which contain eGFP gene and co-cultured for 3 days,
cotyledon disks from outside the 1.3 cm area of the injection
site; (D) Immunohistochemistry results of cotyledons injected
with Agrobacterium LBA-pG3 which contain eGFP gene and
co-cultured for 3 days, cotyledon disks from the 1.3 cm area
of the injection site


瞬时表达系统中应用最广的是农杆菌介导法, 该
方法的转化效率受多种因素的影响, 菌株和载体的组
合类型、农杆菌生长状态和菌液浓度、共培养时间及
培养条件等都会影响转化效率(张福丽等, 2012)。不
同的农杆菌对不同的植物转化效率不同, 有的农杆菌
对有些植物侵染性不足而对另一些植物则是“剧毒
性”的(Gelvin, 2003); 而同种农杆菌对同一植物的不
同组织部位转化效率也有差异。如胡杨 (Populus
euphratica)叶片的遗传转化率为80%, 而茎的转化率
仅为20%。通常植物的幼嫩叶片、茎尖和胚性愈伤组
织等生长旺盛, 分生能力强的组织、器官和细胞是转
基因受体的最佳材料(杨丽萍等, 2013)。本实验用
GV3101和LBA4404作为农杆菌菌株、以棉花子叶为
转基因受体进行转化, 取得了较好的瞬时表达效果。
相比之下, LBA4404介导的转化外源基因的瞬时表达
效果更好。本实验也用棉花真叶进行了转化实验, 但
检测不到外源基因的表达(资料未显示)。其原因可能
是子叶叶片肥厚且叶肉细胞疏松, 易于进行注射。
Sunilkumar和Rathore(2001)的研究结果也表明棉花
子叶表皮细胞更适合T-DNA的转化。而棉花真叶角质
层较厚, 农杆菌难以进入叶肉细胞, 导致T-DNA转化
受阻。此外得到真叶叶片需要更长的培养时间。
农杆菌生产状态和浓度也会影响转化效率。农杆
菌生长状态不良或浓度过低会影响T-DNA的转化 ,
有可能得不到转化植株; 而浓度过高农杆菌过度繁
殖, 夺取植物体营养, 有可能使植物致死。大量实验
证实适宜转化的农杆菌浓度范围为0.2–1.0(Niedz
and Evens, 2010), 不同的植物会有不同要求。本实
验采用OD600为0.5的农杆菌, 转化效率最高。众所周
知, 植物受伤后会分泌一系列酚类、糖类和氨基酸类
等趋化性物质, 吸引农杆菌集中于植物受伤部位。这
些分泌物主要是乙酰丁香酮(acetosyringone, AS),
其作为酚类可诱导农杆菌Vir区基因的活化与表达,
进而促进T-DNA的加工和转移。因此人工添加酚类补
充物, 可扩大农杆菌宿主范围, 继而提高转化效率
(Sunilkumar and Rathore, 2001)。实验中对eGFP转
化棉花子叶后进行了1–11天共培养的跟踪观察, 发
现子叶在共培养1–2天时仅有微弱表达, 第3天大量
表达, 持续到共培养8天时表达量开始下降, 直到第
11天仅有微弱表达。农杆菌介导的转化在早期外源基
因的表达是被抑制的, 由于一些植物防御活动和应激
反应可抑制农杆菌活性, 经一定的潜伏期后外源基因
才开始表达(姚冉等, 2011)。因此共培养时间要适宜,
过短会使基因来不及表达; 过长则会使农杆菌数目过
多, 同样可能引起植物坏死, 所以要选择适宜的共培
养时间, 一般为2–4天(Mannan et al., 2009)。但也有
研究显示共培养4周可得到较好效果 (Hac et al.,
2011)。本实验涉及2个共培养时间, 这可能是由于外
源基因的差异, 在前期以GUS为报告基因的实验中,
共培养2天可以达到最佳效果。而以LBA4404介导
刘雪梅等: 农杆菌介导的棉花子叶瞬时表达系统的建立 593
eGFP表达, 共培养3天效果最好。此外, 在以GUS为
报 告 基 因 的 瞬 时 表 达 系 统 建 立 过 程 中 优 选
pCAMBIA2301载体 , 其T-DNA区含有带内含子的
GUS基因, 由于内含子只能在真核细胞基因转录后
加工成熟过程中被切除, 因此pCAMBIA2301上携带
的GUS基因只能在植物细胞中表达, 排除了GUS基
因在细胞间隙表达的假阳性。
本实验建立了以GUS或eGFP为报告基因的棉花
子叶瞬时表达系统, 为棉花功能基因分析提供了一个
快速、安全、可靠的方法。有研究表明, 农杆菌介导
法转化外源基因, 虽然可快速检测蛋白质表达, 但可
造成转化植株生长停滞, 可能是由于瞬时表达的质粒
通常是多拷贝基因, 导入宿主细胞后会干扰细胞代谢
(Sanyal et al., 2003)。但由此造成的植物生长停滞是
否会对基因功能分析有不利影响, 尚需进一步研究。
参考文献
蓝岚, 吴帅, 申丽威, 王志坤, 孟凡立, 宋波, 拓云, 刘珊珊
(2013). 根癌农杆菌介导大豆转Bt-cryIA抗虫基因. 中国油
料作物学报 35, 29–35.
李浩戈, 金迪, 马慧, 徐海, 徐正进 (2012). 农杆菌介导主要
农作物遗传转化的研究进展. 辽宁农业科学 4, 38–42.
李杰, 任宏伟, 黄洁虹, 俞梅敏, 茹炳根 (2003). 外源报告基
因EGFP在盐藻中实现瞬时表达. 中国生物化学与分子生物
学报 19, 338–342.
邱初, 陶刚, 李奇科, 邱又彬, 刘作易 (2009). 农杆菌渗入法
介导的基因瞬时表达技术及应用. 分子植物育种 7, 1032–
1039.
谭小力, 诸葛锐军, 李冠英, 卢长明, 王政, 张志燕 (2012).
农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达. 生物学杂志 29(6), 93–
96.
杨晶, 郭咏昕, 任素平, 周婷婷, 李海燕, 李校堃 (2011). 利
用红花瞬时表达aFGF-GFP融合基因的研究. 中国中药学
杂志 36, 281–284.
杨丽萍, 金太成, 徐洪伟, 李华, 周晓馥 (2013). 植物中瞬时
表达外源基因的新型侵染技术. 遗传 35, 111–117.
姚冉, 石美丽, 潘沈元, 沈桂芳, 张志芳 (2011). 农杆菌介导
的植物遗传转化研究进展. 生物技术进展 1, 260–265.
张福丽, 陈龙, 李成伟 (2012). 农杆菌介导的植物转基因影
响因素. 生物技术通报 7, 14–19.
Belide S, Hac L, Singh SP, Green AG, Wood CC (2011).
Agrobacterium mediated transformation of safflower and
the efficient recovery of transgenic plants via grafting.
Plant Methods 7, 12.
Chakravarthy VSK, Reddy TP, Reddy VD, Rao KV (2014).
Current status of genetic engineering in cotton
(Gossypium hirsutum L.): an assessment. Crit Rev
Biotechnol 34, 144–160.
Gelvin SB (2003). Agrobacterium-mediated plant trans-
formation: the biology behind the “Gene-Jockeying” tool.
Microbiol Mol Biol Rev 67, 16–37.
Grebenok RJ, Pierson E, Lambert GM, Gong FC, Afonso
CL, Haldeman-Cahill R, Carrington JC, Galbraith DW
(1997). Green fluorescent protein fusions for efficient
characterization of nuclear targeting. Plant J 11, 573–586.
Grefen C, Donald N, Hashimoto K, Kudla J, Schumacher
K, Blatt MR (2010). A ubiquitin-10 promoter-based vector
set for fluorescent protein tagging facilitates temporal
stability and native protein distribution in transient and
stable expression studies. Plant J 64, 355–365.
Koroleva OA, Tomlinson ML, Leader D, Shaw P, Doonan
JH (2005). High-throughput protein localization in
Arabidopsis using Agrobacterium-mediated transient
expression of GFP-ORF fusions. Plant J 41, 162–174.
Li D, Han XX, Zuo J, Xie LL, He RH, Gao J, Chang L, Yuan
LP, Cao ML (2011). Construction of rice site-specific
chloroplast transformation vector and transient expression
of eGFP gene in Dunaliella salina. J Biomed Nanotechnol
7, 801–806.
Mannan A, Syed T, Mirza B (2009). Factors affecting
Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of
Artemisia absinthium L. Pak J Bot 41, 3239–3246.
Niedz RP, Evens TJ (2010). Effect of Agrobacterium culture
and inoculation density on transformation efficiency of a
citrange (Citrus reticulata x Poncirus trifoliata). J
Horticulture Forestry 2(3), 30–37.
Paterson AH, Wendel JF, Gundlach H, Guo H, Jenkins J,
Jin DC, Llewellyn D, Showmaker KC, Shu SQ, Udall J,
Yoo MJ, Byers R, Chen W, Doron-Faigenboim A, Duke
MV, Gong L, Grimwood J, Grover C, Grupp K, Hu GJ,
Lee TH, Li JP, Lin LF, Liu T, Marler BS, Page JT,
Roberts AW, Romanel E, Sanders WS, Szadkowski E,
Tan X, Tang HB, Xu CM, Wang JP, Wang ZN, Zhang D,
Zhang L, Ashrafi H, Bedon F, Bowers JE, Brubaker
CL, Chee PW, Das S, Gingle AR, Haigler CH, Harker D,
Hoffmann LV, Hovav R, Jones DC, Lemke C, Mansoor
S, Rahman MU, Rainville LN, Rambani A, Reddy UK,
Rong JK, Saranga Y, Scheffler BE, Scheffler JA, Stelly
DM, Triplett BA, van Deynze A, Vaslin MFS, Wagh-
594 植物学报 49(5) 2014
mare VN, Walford SA, Wright RJ, Zaki EA, Zhang TZ,
Dennis ES, Mayer KFX, Peterson DG, Rokhsar DS,
Wang XY, Schmutz J (2012). Repeated polyploidization
of Gossypium genomes and the evolution of spinnable
cotton fibres. Nature 492, 423–427.
Sanyal I, Sigh AK, Amla DV (2003). Agrobacterium tume-
faciens-mediated transformation of chickpea (Cicer arie-
tinum L.) using mature embryonic axes and cotyledonary
nodes. Indian J Biotechnol 2, 524–532.
Sauer M, Paciorek T, Benková E, Friml J (2006). Immu-
nocytochemical techniques for whole-mount in situ protein
localization in plants. Nat Protoc 1, 98–103.
Shibasaki S, Fujita A, Usui C, Watanabe S, Kitano S,
Sano H, Iwasaki T (2012). Effect of transient expression
of fluorescent protein probes in synovial and myoblast cell
lines. Springer Plus 1, 36.
Sunilkumar G, Rathore KS (2001). Transgenic cotton:
factors influencing Agrobacterium-mediated transforma-
tion and regeneration. Mol Breeding 8, 37–52.
Viana AA, Fragoso RR, Guimaráes LM, Pontes N, Olive-
ira-Neto OB, Artico S, Nardeli SM, Alves-Ferreira M,
Batista JA, Silva MC, Grossi-de-Sa MF (2011). Isolation
and functional characterization of a cotton ubiquitination-
related promoter and 5′ UTR that drives high levels of
expression in root and flower tissues. BMC Biotechnol 11,
115.

The Establishment of Agrobacterium-mediated Transient Expression
System in Cotton Cotyledons
Xuemei Liu†, Lei Wang†, Tianlong Wen, Peng He, Jianing Yu*
College of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China
Abstract The plant transient expression system plays an important role in analysis of subcellular localization, interaction
and promoter activity of protein. Here, we established a transient expression system in cotton cotyledons based on
Agrobacterium-mediated transformation with GUS and eGFP as reporter genes. We investigated the optimal conditions
for the system, including cotyledon growth time, Agrobacterium concentration, injection volume and co-culture time. The
highest efficiency of exogenous gene expression was 50 µL Agrobacterium LBA4404 or GV3101 with OD600=0.5 and
co-culture for 2–3 days in cotton cotyledons germinated for 6 days. The transient expression system is convenient and
only needs 8 to 13 days to detect exogenous protein expression from germination to results. The system may have a good
application for analysis of gene function in cotton.
Key words cotton, functional research of gene, reporter gene, transient expression
Liu XM, Wang L, Wen TL, He P, Yu JN (2014). The establishment of Agrobacterium-mediated transient expression
system in cotton cotyledons. Chin Bull Bot 49, 587–594.
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† These authors contributed equally to this paper
* Author for correspondence. E-mail: jnyu@snnu.edu.cn
(责任编辑: 白羽红)