全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2014, 49 (3): 229–245, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2014.00229
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收稿日期: 2014-01-22; 接受日期: 2014-03-06
基金项目: 国家重大科学研究计划(No.2012CB910504)、国家博士后科学基金(第48批)和中国博士后科学基金(第4批, No.201104407)
* 通讯作者。E-mail: daishaojun@hotmail.com; twang@ibcas.ac.cn
被子植物生殖细胞与精细胞的分离方法
鲁云龙1, 魏丽勤2, 戴绍军1*, 王台2*
1东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心, 东北油田盐碱植被与重建教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
2中国科学院植物研究所植物分子生理学重点实验室, 北京 100093
摘要 开花植物精细胞的发育经历一个独特的后减数分裂过程, 在此过程中每个花粉母细胞减数分裂的产物——小孢子经
不对称有丝分裂产生1个大的营养细胞和1个小的生殖细胞, 随后生殖细胞经过正常的有丝分裂产生2个精细胞。近几年, 随
着高通量组学技术的不断完善, 利用组学技术比较分析生殖细胞和精细胞的分子特征、揭示决定精细胞命运与功能以及受
精识别的重要分子已成为植物生殖生物学备受关注的课题。开展此项研究的关键是建立能获得大量高纯度的生殖细胞与精
细胞分离纯化技术。该文综述了被子植物生殖细胞和精细胞分离方法的主要研究进展, 分析了关键方法的特点和要点以及
不同方法之间的差异和共性, 以期为相关领域的研究人员提供借鉴。
关键词 生殖细胞, 精细胞, 渗透冲击, 密度梯度离心, 分离纯化
鲁云龙, 魏丽勤, 戴绍军, 王台 (2014). 被子植物生殖细胞与精细胞的分离方法. 植物学报 49, 229–245.
花粉(雄配子体)的发育涉及精细的调控机制, 位
于花药内的小孢子母细胞经过减数分裂形成四分体,
随后包裹四分体的胼胝质壁解体, 释放出小孢子, 小
孢子经1次不对称的有丝分裂, 形成1个较大的营养
细胞(vegetative cell, VC)和1个存在于营养细胞内
的、较小的生殖细胞(generative cell, GC)。随后, 营
养细胞不再进行细胞分裂(Twell et al., 1998; Twell,
2011), 而生殖细胞继续进行1次有丝分裂并形成2个
精细胞(sperm cells, SCs)。在授粉和受精过程中, 营
养细胞产生的花粉管通过极性生长将这2个精细胞运
送到胚囊, 后者分别与卵细胞和中央细胞融合完成双
受精, 从而实现遗传信息的传递(McCormick, 1993)。
根据生殖细胞有丝分裂发生的时间和地点不同, 可将
开花植物的花粉分成两大类。一类生殖细胞的分裂发
生在开花前, 成熟花粉包含1个营养细胞和2个精细
胞, 通常被称为三胞花粉, 水稻(Oryza sativa)、玉米
(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)均属此类。
另一类生殖细胞分裂发生在极性生长的花粉管中, 因
此, 此类成熟花粉仅包含1个营养细胞和1个生殖细
胞, 通常被称为二胞花粉, 如百合属(Lilium)植物、烟
草(Nicotiana tabacum)、番茄(Lycopersicon escul-
entum)。
这些细胞发育过程涉及植物生殖生物学的重要
科学问题。例如: 小孢子是如何通过1次不对称的有
丝分裂形成了2个功能和命运完全不同的细胞(营养
细胞和生殖细胞)？不对称的有丝分裂过程是如何被
严密调控的？在双受精过程中2个看起来相似的精细
胞又是如何被选择的？近几年, 随着高通量组学技术
的发展与完善, 为利用组学技术研究生殖细胞和精细
胞的功能基因组特征提供了新的机遇。目前主要的障
碍是难以获取大量、高纯度的GCs和SCs。另外, 分
离精细胞是开展离体受精的前提。本文分析了被子植
物GCs和SCs分离和纯化技术的研究进展, 以期为相
关研究人员提供参考和借鉴。
1 生殖细胞与精细胞的分离
1.1 生殖细胞与精细胞的释放
无论是GCs还是SCs, 都存在于花粉营养细胞内, 浸
润在营养细胞的细胞质中, 因此分离纯化GCs和SCs
的前提是将它们从营养细胞中释放出来(Chaboud
and Perez, 1992)。分离的主要手段是利用不同的物
理或生化方法使营养细胞破裂, 这是分离GCs和SCs
的关键一步。破裂的效果直接影响后续GCs和SCs的
·特邀综述·
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产率和纯度。破裂不充分, 释放出的GCs或SCs相对
较少, 产量和产率低; 破裂过度或者破裂方法选择不
当会产生过多的、不易除去的杂质, 难以获得高纯度
的GCs或SCs。目前广泛应用的破裂营养细胞的方法
主要有机械研磨、渗透冲击和酶解等。不同的方法
各有特点, 多种方法也可能对同一物种花粉均适用
(Yang and Zhou, 1989)。根据植物花粉的特性, 选择
适当的破裂方法, 是有效释放GCs和SCs的关键(吴
新莉和周嫦, 1991)。

1.1.1 机械破裂法
机械破裂是指借助外界机械的力量破裂营养细胞, 从
而使营养细胞中的内含物释放到特定的缓冲溶液中。
Tanaka(1988)最早应用瓦式捣碎机(Waring blender)
破裂麝香百合(Lilium longiflorum)未成熟花粉的原生
质体并分离得到GCs。Southworth和Knox(1989)利用
贝尔克组织匀浆器(Bellco tissue homogenizer)破裂
非洲菊(Gerbera jamesonii)花粉, 成功分离出SCs。
使用裂解液和玻璃研磨杵, 同样可以破裂营养细胞,
释放GCs或SCs。这是目前应用最广泛的机械破裂方
法, 已在菠菜(Spinacia oleracea)、拟南芥等物种中
成功应用(Southworth and Knox, 1989; Theunis and
Van Went, 1989; Theunis et al., 1992; Borges et al.,
2008)。
机械破裂法具有操作简便、不依赖花粉发育时期
及生理状态的优点(周嫦和杨弘远, 1989), 适用于较
难通过渗透压冲击法(详见下文)实现破裂的花粉(此
类花粉或其花粉管对渗透势变化不敏感, 或者使其破
裂的渗透势同样也会导致GCs或SCs发生破裂)。但
是, 机械破裂法有2个明显的缺点: (1) 由于器械不同
以及不同操作人员操作力度的差异, 分离效果难以重
复; (2) 机械破裂法是一种“硬”破裂方法, 会产生大
量的细胞碎片和杂质, 甚至损坏GCs或SCs, 在后续
的纯化过程中难以获得高纯度的GCs或SCs(周嫦和
杨弘远, 1989)。

1.1.2 渗透压冲击法(一步法、二步法、低酶法)
渗透压冲击法的原理如下: 当置于低渗的溶液环境
中, 花粉迅速吸水涨破, 释放出GCs或SCs等花粉内
含物。渗透压冲击法最早应用于白花丹(Plumbago
zeylanica)SCs的分离。早期的研究采用一步法, 即将
收集的花粉直接置于低渗溶液(20%蔗糖)中进行渗透
压冲击(Russell, 1986)。但是, 有些物种的花粉直接
置于低渗溶液中很难涨破, 如蚕豆(Vicia faba)、欧洲
油菜(Brassica napus)、兰州百合(Lilium davidii var.
unicolor)的花粉。鉴于此, 后期发展出二步法, 即先
使花粉在萌发培养基中萌动或产生较短的花粉管(长
度小于花粉粒直径)(图1A), 然后将其转移至低渗溶
液中, 由于花粉管顶端对渗透压的变化更为敏感, 在
低渗溶液中易涨破(Zhou, 1988; Taylor et al., 1991;
Zhao et al., 2013)。低酶法则是利用含少量(一般为
0.1%)纤维素酶与果胶酶的低渗溶液孵育花粉而使其
涨破的方法。这是由于花粉萌发孔处内壁部分被降解,
在低渗条件下更易涨破而释放出内含物(吴新莉和周
嫦, 1991; 莫永胜和杨弘远, 1992)。
利用渗透压冲击法释放GCs和SCs时, 低渗溶液
的渗透势是影响花粉破裂效果的决定因素。花粉萌发
时吸水产生膨压, 由萌发孔处突出形成花粉管。吸水
和产生花粉管是两个相关联的过程: 在一定的膨压
下合成相应的花粉管物质才能形成花粉管; 当体外溶
液的渗透压过低、花粉短时间内吸水过多而产生的膨
压过大时, 花粉将从萌发孔处破裂。一些研究结果显
示, 低渗溶液的酸碱度和花粉的发育状态影响渗透压
冲击法破裂花粉的效果。如利用偏酸性的低渗溶液处
理黑麦草(Lolium perenne)和玉米花粉才能获得理想
的破裂效果(van der Maas et al., 1993; Engel et al.,
2003); 对棉花(Gossypium hirsutum)、烟草、玉帘
(Zephyranthes candida) 、 风 雨 花 (Zephyranthes
grandiflora)、石蒜(Lycoris radiata)、凤仙花(Impati-
ens balsamina)的花粉而言, 渗透压冲击能有效破裂
开花当天的成熟花粉, 却难以破裂开花前一天的花粉
(莫永胜和杨弘远, 1991; 吴新莉和周嫦, 1991)。
与机械破裂法(“硬”破裂)相比, 渗透压冲击法
是一种相对温和的“软”破裂方法。渗透压冲击过程
可以通过显微镜实时观察, 花粉破裂的效果也可实时
监控。在多数情况下, 渗透压冲击破裂的花粉粒依然
会保留完整的空壳, 可以通过适宜孔径的滤网去除破
裂和未破裂的花粉(图1A), 产生的杂质也相对较少,
便于后续的分离纯化(Russell, 1986; 周嫦和吴新莉,
1990; Zhao et al., 2013)。因此, 渗透压冲击法是应
用最广泛的释放GCs和SCs的方法(表1)。使用此方法
需要注意的是由于释放的GCs或SCs直接处在低渗
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图1 利用萌发的二胞花粉(A)及其花粉管(B)分离纯化生殖细胞与精细胞示意图

Figure 1 Cartoons showing the methods used to isolate and purify generative cells (GCs) and sperm cells (SCs) from
just germinated pollen grains (A) and pollen tubes (B) of bicellular pollen grains


环境下, 较长时间的放置可能不利于GCs或SCs的存
活(莫永胜和杨弘远, 1991; Zhao et al., 2013), 因此
对细胞活性的监控和实验环节的快速是重要的。
吴新莉和周嫦(1991)借助渗透压冲击法(一步法、
二步法、低酶法)成功分离了玉帘、风雨花、石蒜、
朱顶红(Hippeastrum vittatum)、鸢尾(Iris tectorium)、
唐菖蒲(Gladiolus gandavensis)、黄花菜(Hemero-
callis minor)、韭(Allium tuberosum)、棉花、烟草、
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凤仙花共6科11种植物的GCs。根据花粉破裂的情况,
可将这些物种的花粉分为3类。第1类是棉花花粉, 其
在蔗糖溶液中容易破裂, 采用一步法即可获得高达
85%的破裂率; 第2类是烟草、玉帘、风雨花、石蒜
和凤仙花的花粉, 其在蔗糖溶液中不易破裂, 且会大
量萌发, 采用一步法破裂效果较差, 用二步法可显著
提高破裂率(如烟草花粉用一步法的破裂率仅为37%,
用二步法的破裂率可达78.8%); 第3类是鸢尾、黄花
菜、唐菖蒲、朱顶红和韭的花粉, 这类花粉在蔗糖溶
液中破裂少又难以萌发, 用一步法或二步法破裂效果
均较差, 用低酶法可大幅提高破裂率(如利用低酶法
处理鸢尾花粉可使85%–90%花粉破裂)。

1.1.3 酶解法
花粉壁由果胶-纤维素内层和孢粉素外层构成。花粉
萌发后, 花粉管壁通常也由内壁和外壁组成, 内壁主
要是胼胝质(β1→3葡聚糖)成分, 外壁含有大量果胶
质、纤维素和半纤维素, 而花粉管顶端区域不含胼胝
质成分(Taylor and Hepler, 1997; Cheung and Wu,
2008; Rounds and Bezanilla, 2013)。酶解法是根据
花粉(管)壁的成分, 有针对性地在缓冲液中加入纤维
素酶、果胶酶、离析酶等, 制备成酶解液(酶解不同物
种的花粉壁可能需要不同的酶组合和不同的酶浓度),
在适宜酶解的条件下, 通过酶解反应降解花粉(管)壁,
从而使营养细胞破裂、释放出花粉(管)内含物。由于
花粉壁外层由孢粉素构成, 对环境有较强的抗性, 酶
解法难以在短时间内酶解未萌发花粉的孢粉素壁。但
花粉管不含有孢粉素且花粉管顶端又不含胼胝质组
分, 故此法能有效酶解花粉管壁顶端的组分, 进而释
放出GCs或SCs (Shivanna et al., 1988; 吴新莉和周
嫦, 1991; Xu et al., 2002)。与机械破裂法相比, 酶解
法不会破裂花粉壁产生碎片, 仅通过酶解花粉管顶端
区域释放出部分内含物, 包括GCs或SCs, 因而产生
的细胞碎片较少, 有利于后续的纯化。对于那些利用
渗透压冲击法难以破裂、而利用机械破裂法又会产生
大量杂质的花粉, 酶解法可作为优先选择的方法(莫
永胜和杨弘远, 1992)。

1.1.4 原生质体释放法
上述方法均是直接针对花粉或花粉管操作。原生质体
释放法则需先制备出花粉原生质体, 再通过破裂原生
质体, 释放出GCs或SCs。由于有花粉外壁的保护,
直接用机械破裂法处理麝香百合成熟花粉不能释放
出数量可观并且完整的GCs, 于是Tanaka(1988)利
用未成熟麝香百合花粉制备花粉原生质体, 再用机械
破裂法处理原生质体获得了大量、完整的GCs。周嫦
和吴新莉(1990)分离风雨花的GCs时, 也采用了类似
方法。此后, 吴新莉和周嫦(1991)又利用包括原生质
体释放法在内的多种方法分离了鸢尾、唐菖蒲、黄花
菜、韭、朱顶红和风雨花共6种植物的GCs。Ueda和
Tanaka(1994)利用适宜孔径针头的注射器处理百合
花粉原生质体悬液, 成功分离了百合花粉的GCs和营
养细胞核(vegetative nucleus, VNs)。但是该方法与
渗透压冲击法相比, 操作步骤繁琐且分离效果不理
想, 其应用受到局限。

1.1.5 精细胞在离体条件下的发生及分离
上述方法主要是针对二胞花粉GCs及三胞花粉SCs
的释放。而一些研究需要比较GCs和SCs分子细胞学
特征, 一个适用此研究的策略是以二胞花粉为材料,
先分离出GCs(图1A); 随后利用离体培养条件使二胞
花粉萌发, 产生极性生长的花粉管以及在花粉管中形
成SCs, 通过破裂花粉管实现SCs的分离(图1B)。一
般而言, 在离体培养10个小时甚至更长时间的花粉
管中, 生殖细胞才可能顺利完成有丝分裂产生SCs,
因此建立一个保障花粉管长时间培养的实验体系是
重要的前提条件(Zhao et al., 2013)。在烟草花粉体外
萌发过程中, Read等(1993)发现在培养基中加入适
量的氮源(如氨基酸、铵盐)有助于精细胞的形成, 而
加入不纯的PEG (polyethylene glycol)则会抑制精细
胞的形成。目前已成功建立烟草和百合SCs在离体培
养的花粉管中发生发育的花粉管离体培养体系, 利用
此体系可成功分离这两种花粉的SCs(陈钟颖等 ,
1995; Xu et al., 2002; Zhao et al., 2013)。对尚未建
立起花粉管离体培养体系的二胞花粉, 一般采用半体
内方法分离SCs。具体操作步骤是先对植株进行授粉,
使大量的花粉在柱头上萌发, 当花粉管在花柱内生长
至生殖细胞完成分裂产生SCs后, 将花柱切下, 置于
缓冲体系中培养一段时间, 使花粉管长出花柱横切
面, 再利用渗透压冲击法或酶解法破裂花粉管, 分离
出SCs。半体内法已成功应用于杜鹃(Rhododendron
macgregoriae)、唐菖蒲、鸢尾、朱顶红、玉帘、黄
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花菜、蓝猪耳(Torenia fournieri)、烟草等植物的SCs
分离(Shivanna et al., 1988; 莫永胜和杨弘远, 1992;
Tian and Russell, 1997; 孙蒙祥等, 1999; Vági et
al., 2004)。
1.2 生殖细胞与精细胞的纯化
花粉(管)破裂释放出GCs或SCs的同时, 也会产生大
量杂质, 这些杂质包括细胞质组分、细胞碎片以及线
粒体、质体等细胞器, 有些细胞质组分还会粘连在一
起形成较大的团块。因此, 后续的纯化是获得高纯度
GCs和SCs所必需的。常用的纯化程序是先用一定孔
径的过滤装置去除较大的细胞碎片以及花粉粒等杂
质, 然后再通过密度梯度离心、流式细胞仪分选或显
微操作进行分离纯化。无论用哪种纯化方法, 首要条
件是建立合适的缓冲体系, 在离体条件下尽可能长时
间的保持GCs与SCs的生活力。

1.2.1 基于密度梯度离心的纯化
密度梯度离心是最常用的细胞和细胞器分离纯化方
法之一。该方法具有操作便捷、产量高、纯化效果显
著等优点, 已用于多个物种GCs和SCs的分离纯化
(表1)。其中应用较多的是不连续的密度梯度离心。
Percoll因其生物相容性好、无细胞毒性、渗透势低等
优点, 成为首选介质之一。通常使用2个Percoll梯度
(以100%Percoll所占Percoll溶液的体积百分数表示,
Percoll溶液中通常以蔗糖作为渗透压调节剂)。将含
有GCs或SCs的溶液铺在最上一层, 在适当离心力下
离心, 比GCs或SCs密度大的杂质会沉降到离心管底
部, 比GCs或SCs密度小的杂质则会沉降到最上层溶
液与上层Percoll溶液之间, GCs或SCs则最终停留在
两层Percoll溶液之间的界面, 从而实现细胞的纯化
(Russell, 1986; Zhang et al., 1995; Zhao et al.,
2013)(图1)。例如可以利用密度梯度离心法有效去除
禾本科植物成熟花粉中含有的大量淀粉粒(Dupuis et
al., 1987)。
由于不同物种花粉的GCs或SCs的性质不同, 通
常存在密度上的差异。因此针对不同物种的GCs或
SCs, 确定适宜密度的Percoll溶液是通过密度梯度离
心纯化的关键。判断适宜密度的Percoll溶液的标准是
2个Percoll梯度之间的界面可以收集到数量尽可能多
且纯度较高的GCs或SCs。
1.2.2 基于流式细胞仪的纯化
流式细胞仪可以分析、分选某些具有一定物理和化学
性质的颗粒。GCs或SCs具有一定的物理化学性质(如
形状、大小、内部结构), 这些特性赋予它们与细胞碎
片、细胞器等杂质在流式细胞仪中物理行为的差异,
在一定程度上可以被分选。但是由于细胞碎片、细胞
器等杂质的高度复杂性, 目前利用流式细胞仪分选高
纯度的、无特异性荧光标记的GCs或SCs尚未见成功
案例。因此, 利用荧光染料标记GCs或SCs, 随后利
用流式细胞仪分选标记的细胞是目前常用的方法。
Engel等(2003)以Hoechst染料标记玉米精细胞DNA,
随后利用流式细胞仪实现了SCs的分离纯化。Borges
等(2008, 2012)和Calarco等(2012)利用精细胞特异
表达启动子与GFP(green fluorescent protein)融合构
建转化拟南芥, 获得了GFP标记精细胞的花粉, 通过
机械破裂结合流式细胞仪分选成功获得了GFP标记
的精细胞。
利用流式细胞仪从花粉破裂释放的含GCs或
SCs的溶液中成功分选出GCs或SCs的决定因素是溶
液的颗粒复杂程度。在用流式细胞仪分选之前, 采取
密度梯度离心的方法对GCs或SCs进行初步的纯化
可以减少进样时溶液中杂质颗粒的数量, 提高利用流
式细胞仪分选高纯度GCs或SCs的成功几率(Engel
et al., 2003)。利用流式细胞仪分选的另一个挑战是分
选参数的设定。如Engel等(2003)分选玉米SCs时采
用Exclusion分选模式, 每30分钟可分选200 000个细
胞。Borges等 (2012)分选拟南芥SCs时采用PBS
(phosphate buffer solution)作为鞘液, 鞘液压力为
400 kPa(约60 psi), 每小时可分选2 000 000个SCs,
140 mW、488 nm激光用于散射光检测和GFP激发,
38 mW、 561 nm激光用于RFP(red fluorescent
protein)激发, 前向角散射(forward scatter, FSC)分
选临界直径平均为2.5 μm的颗粒(直径小于2.5 μm的
颗粒被认为是杂质, 不被分选), 液滴形成的振荡频
率为96 000 Hz。以上过程中鞘液流速、分选模式等
参数共同影响细胞分选效果。

1.2.3 基于显微操作的纯化
借助显微镜的观察, 在GCs或SCs释放到缓冲液的前
提下, 利用合适的微量吸液管(micropipette)把GCs
或SCs从溶液中吸取出来, 从而达到与杂质分离的效
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果。在利用此法纯化GCs和SCs时, 渗透压冲击法常
用于释放GCs或SCs(Tian et al., 1998; 陈素红等,
2004; Zhang et al., 2010; Deng et al., 2012)。该方
法操作简便(挑选出细胞后只需离心收集即可), 能获
得高纯度细胞; 但缺点是纯化效率非常低。如Qiu等
(2004)用显微操作分离烟草SCs时, 30分钟只能挑选
出约100个细胞。因此, 与基于密度梯度离心、流式
细胞仪分选的规模化分离纯化相比, 此方法只适用于
细胞需求量较少的实验。

1.2.4 分离的生殖细胞与精细胞的形态特征
用前述方法已从烟草、蚕豆、玉帘等13个物种花粉中
(均为二胞花粉)分离纯化GCs; 从玉米、拟南芥、水
稻等21个物种花粉中(10种二胞花粉, 11种三胞花粉)
分离纯化SCs。这些研究提供了GCs和SCs在体内(in
vivo)与体外(in vitro)条件下的形态特征。结果显示从
花粉中释放到缓冲液后, GCs的细胞形态经历了一个
由纺锤形到圆形或椭圆形的变化过程(Zhou et al.,
1986; Zhou, 1988; 周嫦和吴新莉, 1990; Theunis et
al., 1992)。在分离过程中, SCs的细胞形态也存在类
似的变化, 刚释放到缓冲液的1对SCs呈纺锤形并带
有尾状延伸物或呈单纯的纺锤形, 几分钟后逐渐变为
椭圆形或圆形(Dupuis et al., 1987; Matthys-Rochon
et al., 1987; Theunis and Van Went, 1989)。这一现
象被认为与微管细胞骨架的变化有关。如风雨花花粉
粒或花粉管中GCs, 微管骨架主要呈纺锤形, 延长轴
呈纵向分布, 这可能是支撑GCs呈纺锤形的重要原
因; 而释放到缓冲液中的GCs呈现椭圆形和球形2种
细胞形态, 前者的微管以平行束状和网状共有的过渡
形式存在, 后者的微管束则以网状分布为主(Zhou et
al., 1990)。同时, 分离方法、缓冲液的蔗糖浓度、花
粉发育时期等因素也会影响分离细胞的形态(吴新莉
和周嫦 , 1991)。如分离的绣球百合 (Haemanthus
katherinae)GCs, 随着缓冲液中蔗糖浓度由高到低变
化(48%, 24%, 18%, 12%, 9%, 6%, 0%), 其细胞形
态也随之表现为由纺锤形到椭圆形或球形的改变。在
无蔗糖条件下会发生破裂(Zhou et al., 1986), 在缓
冲液中加入微管稳定剂EGTA(ethylenebis (oxyeth-
ylenenitrilo) tetraacetic acid)和MgSO4可以使多数细
胞保持纺锤形或椭圆形。其原因可能是微管稳定剂阻
止了微管解聚 , 有助于细胞维持原有形态 (周嫦 ,
1987)。
2 细胞分离效果的评价及影响因素
无论采用何种方法, 最终目的是获得大量纯度高、形
态完好且有活性的GCs或SCs, 因此需要从纯度、活
性和产率3方面对纯化的细胞进行评价。
2.1 细胞纯度及影响纯度的主要因素
在进行纯度评估时 , 常用4,6-二脒基 -2-苯基吲哚
(4,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色和醋酸洋
红(acetocarmine)染色(Ueda and Tanaka, 1994; Xu
et al., 2002; Zhao et al., 2013)。其中用后者染色可
以同时观察到红色细胞核和颜色相对较浅的细胞膜
轮廓, 借此来确定分离产物是细胞而非杂质颗粒。此
外, 杂质数量可以在显微镜下进行观察判断, 以微分
干涉差显微镜效果较好(Engel et al., 2003)。利用已
知的精细胞和营养细胞(核)特异性表达的基因, 通过
RT-PCR分析可以提供判断精细胞纯度以及是否存在
营养细胞组分污染的证据(Engel et al., 2003; Bor-
ges et al., 2008; Russell et al., 2012)。常用的标记基
因包括玉米花粉营养细胞优势表达基因Zmc13(En-
gel et al., 2003)、水稻营养细胞优势表达基因Orys1
(Russell et al., 2012)、拟南芥营养细胞优势表达基因
AtVEX1 (Borges et al., 2008)以及水稻和拟南芥精细
胞特异性表达基因GCS1和HAP2(Borges et al.,
2008; Russell et al., 2012)。
纯化的目标细胞中可能含有的杂质主要有2种:
一种是其它类型的细胞或细胞核, 如利用二胞花粉通
过离体萌发分离的SCs可能混有GCs或VNs; 另一种
是在破裂营养细胞时, 释放出的营养细胞内含物以及
细胞碎片。
在常温条件下利用二胞花粉分离GCs或利用三
胞花粉分离SCs, 所获得的目标细胞通常不会混有其
它种类细胞或细胞核的污染。原因有2个: 其一是二
胞花粉营养细胞中只有1个GC和1个VN, 三胞花粉中
则含有2个SCs和1个VN, 起始材料中本身就没有其
它种类细胞; 其二, 在常温条件下, 由于多步分离操
作的影响和对外界缓冲条件的敏感性, VNs在分离过
程中很快破裂, 因此在所分离的目标细胞中通常观察
不到VNs(Zhao et al., 2013)。然而, 在4oC下从二胞
鲁云龙等: 被子植物生殖细胞与精细胞的分离方法 239
花粉分离GCs或从三胞花粉分离SCs则可能有VNs的
污染(Dupuis et al., 1987)。其主要原因是在4oC条件
下细胞核能保持完整性。
利用二胞花粉作为起始材料分离纯化SCs的实
验涉及培养条件下的花粉萌发与花粉管培养、GCs在
花粉管的有丝分裂和SCs的分化发育以及从花粉管
中分离SCs(Zhao et al., 2013)。利用该技术途径纯化
的SCs通常会存在GCs污染, 其原因在于: (1) SCs发
育完成之前花粉管意外停止生长; (2) 进行分离操作
时部分花粉管中的GCs尚未完成有丝分裂。解决此问
题的方案是可以通过优化体外培养条件使花粉萌发
与花粉管的极性生长最大程度同步化, 同时延长培养
时间保证尽可能多(90%以上)的GCs完成有丝分裂,
在释放SCs前尽可能去除含有GCs的花粉管(如用适
宜孔径的尼龙网过滤, 因为中止生长的花粉管通常相
对较短)(Zhao et al., 2013)。
除了非目标细胞或营养核的污染外, 细胞碎片和
细胞器也是主要的杂质, 在镜检时可以清楚地看到这
类杂质。通常情况下, 多次的离心和上述分离纯化方
法可以有效地去除这些杂质。影响纯度的因素非常复
杂, 主要有3个方面。(1) 破裂的程度。控制细胞的破
裂程度是保障后续纯化成功的关键, 破裂过度会产生
大量杂质, 即使后续的纯化方法非常有效也很难彻底
去除 (主要针对机械破裂法而言 )(周嫦和杨弘远 ,
1989)。(2) 过滤网孔径的选择。花粉粒的直径比GCs
或SCs大, 细胞碎片的直径通常比GCs或SCs小, 选
择合适的滤网可以将它们分开(Zhou, 1988), 实现有
效的初步分离。(3) Percoll溶液的密度选择(基于不连
续密度梯度离心的方法)。选择2种密度不同且适宜的
Percoll溶液, GCs或SCs会停留在这2层溶液之间的
界面, 而密度小于或大于GCs或SCs的杂质会分别停
留在上层Percoll与顶层溶液的界面和离心管的最底
部, 从而实现GCs或SCs与杂质的有效分离 (Dupuis
et al., 1987)。
2.2 细胞活性及影响活性的主要因素
实验中常用荧光素二乙酸酯(fluorescein diacetate,
FDA)染色和Evans blue染色检测纯化的GCs或SCs
的细胞活性。FDA是一种非极性无荧光分子, 可以自
由穿过质膜, 进入细胞后在胞内酯酶的作用下被酶解
释放出荧光素。荧光素是一种难以穿过质膜的极性物
质, 积累在活细胞内, 在蓝色激发光下发出绿色荧
光, 而死细胞的质膜丧失了半透性特性, 胞内不能积
累荧光素, 在荧光显微镜下没有绿色荧光(Heslopha-
Harrison and Heslopha-Harrison, 1970)。FDA染色
法因具有快速、操作便捷、易于观察等优点而被广泛
应用于GCs和SCs的活性检测(Zhou et al., 1986; 莫
永胜和杨弘远, 1991; Borges et al., 2008; Abiko et
al., 2013; Anderson et al., 2013)。Evans blue染色也
是一种基于质膜半透性检测细胞活性的方法, 该染料
不能透过活细胞的质膜, 不能使活细胞着色, 但可以
通过死细胞的质膜进入死细胞中 , 使死细胞着色
(Gaff and Okongo-Ogola, 1971)。相对于FDA染色
法, Evans blue染色法效果不明显, 不容易区分染料
的蓝色与背景的蓝色(Huang et al., 1986), 因此仅有
少数的应用案例 (Russell, 1986; Southworth and
Knox, 1989)。
以往的研究揭示了影响纯化GCs或SCs活性的
主要因素有3个。(1) 花粉本身的状态。在自然状态下
GCs或SCs是包裹于花粉营养细胞内的细胞, 花粉自
身的状态与活性直接影响到所分离的GCs和SCs的
活性。(2) 温度。因不同物种花粉自身特性的差异, 在
分离纯化时所选择的温度因物种而异(表1), 但4°C条
件下可能更利于长时间维持细胞的活性 (Matthys-
Rochon et al., 1987; 莫永胜和杨弘远, 1991)。(3) 缓
冲液。缓冲液是GCs或SCs从营养细胞释放后直接接
触的环境, 是细胞存活状态的决定因素之一。早期研
究采用的缓冲液是单纯的蔗糖溶液(Russell, 1986;
Zhou, 1988), 主要是提供维持细胞完整性的适当的
渗透势。有尝试利用含有多种无机盐离子的液体培养
基BKS(Brewbaker and Kwack, 1963)作为分离玉米
SCs的缓冲系统, 并获得成功(Dupuis et al., 1987)。
此后 , BKS缓冲液以及基于BKS的改良缓冲液
Roberts medium(Roberts et al., 1983)和K3 medium
(Nielsen and Olesen, 1988)得到广泛应用(Theunis
and Van Went, 1989; 莫永胜和杨弘远, 1991)。在此
基础上, 向缓冲液中添加牛血清白蛋白(bovine se-
rum albumin, BSA)、聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinyl-
pyrrolidone, PVP)、葡聚糖硫酸钾(potassium dextran
sulphate, PDS)等保护剂, 结果显示可以更加有效地
维持细胞的活性(Southworth and Knox, 1989; 莫永
胜和杨弘远, 1991)。值得一提的是, Zhang等(1992,
240 植物学报 49(3) 2014
1995)先后对玉米SCs分离方法进行了系统研究, 在
以下几个方面进行了尝试和探索。(1) 不同浓度的无
机离子(Ca2+, K+, Mg2+)和硼元素; (2) 包括2-吗啉乙
磺酸(2-Morpholinoethanesulfonic acid, MES)、3-(N-
吗啉基)丙磺酸(3-(N-Morpholino) Propa-nesulfonic
acid, MOPS)、Tris(Tris (hydroxymethyl) aminometh-
ane)在内的10种缓冲剂; (3) 5种pH值(5, 6, 6.7, 7, 8);
(4) 包括蔗糖、甘露醇在内的6种渗透压调节剂及保护
剂半胱氨酸、BSA、二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)
等条件对细胞活性(用FDA信号的强度估算)、存活时
间(用一段时间后有生活力的细胞占总细胞数的百分
比估算)及分离效果(主要是产量)的影响。结果表明,
分离液中使用0.55 mol·L–1半乳糖比其它渗透压调节
剂更有助于提高SCs产量; 在0.55 mol·L–1半乳糖基
础上添加2 mmol·L–1MES可以显著改善SCs的存活
时间; pH6.7是最适于SCs存活的pH值; 半胱氨酸可
以导致细胞活性迅速下降并使细胞破裂; DTT可以增
加细胞产量却导致细胞活性下降; 0.1%BSA可以增加
细胞产量和活性; 蔗糖、BSA、MES的组合能够显著
增加细胞的存活时间和活性。缓冲液中低浓度(0.01
mmol·L–1, 0.1 mmol·L–1)的无机离子对细胞的存活基
本没有影响(除0.1 mmol·L–1Mg2+处理48小时会使保
存的细胞总数减少22%); 高浓度(1 mmol·L–1)的Ca2+
和Mg2+可使大部分细胞在48小时内失去完整性, 而
高浓度的K+或H3BO3对细胞活性影响极小或没有影
响。消除缓冲液中的游离Ca2+有助于提高细胞存活时
间和活性, 细胞质游离Ca2+的增加或耗尽都会使细胞
活性快速下降, 说明细胞质中一定浓度的游离钙离子
是维持细胞活性所必需的。van der Maas等(1993)在
研究黑麦草SCs分离方法时, 发现胎牛血清(fetal calf
serum, FCS)与维生素C联用可增加SCs在体外的存
活时间。以上研究不仅建立了更加优化的分离方法,
而且对分离GCs或SCs有着重要的参考意义。此外,
保证GCs和SCs生活力完好是我们考虑其产量的前
提条件。
2.3 细胞产率及影响产率的因素
细胞产率是评价分离纯化方法适用性和分离纯化效
果的重要标准之一, 通常以分离到的GCs或SCs总数
/初始GCs或SCs总数×100%表示。现有的研究关于细
胞产率的描述并不统一, 有的只是给出了最终得到的
GCs或SCs浓度, 有的甚至没有对分离的GCs或SCs
的数量进行统计。现有的数据显示, 利用白花丹花粉
分离纯化SCs的产率可以达到75%(Russell, 1986),
所获得的细胞密度可达8.8×106个·mL–1。利用麝香百
合花粉原生质体分离GCs的产率约为33%(Tanaka,
1988)。利用玉米花粉制备SCs的产率约为20%
(Dupuis et al., 1987)。而从菠菜花粉分离SCs的
产率仅为5%–10%(Theunis and Van Went, 1989)
(表1)。
现有的实验结果显示, 利用不同物种的花粉甚或
不同研究者利用同一物种的花粉所获得GCs或SCs
的产率也会有很大差异。其主要原因是分离纯化过程
涉及多个环节, 一些环节对产率有重要影响。(1) GCs
或SCs的释放过程。实现较高产率的第1步是要保证
花粉破裂率高, 这在渗透压冲击法中尤为重要(在机
械破裂法中也非常重要)。但如果过分破裂花粉又可
能带来太多的杂质和碎片并影响后续的纯化过程, 因
此, 探索一个既能达到的适度破裂率、又能避免产生
大量难以除去杂质的破裂程序是保证高产率和高纯
度的关键。van der Maas等(1993)用渗透压冲击法分
离黑麦草SCs时发现, pH6.0和360 mosmol·kg–1 H2O
渗透势组合可以实现最优的破裂效果, SCs产量也达
到最大化。(2) 纯化过程。在保证尽可能除去杂质的
同时, 最大限度地保留GCs或SCs是纯化步骤的关
键。例如, 利用不连续密度梯度离心的纯化方法时,
关键是筛选到2个合适密度的Percoll梯度溶液, 以实
现离心后使尽可能多的GCs或SCs停留在2层梯度溶
液之间, 同时此密度范围又能排除绝大多数杂质。(3)
缓冲溶液的适配性。筛选适宜的缓冲液, 使GCs或
SCs在其中长时间保持生活力, 这是所有操作步骤都
依赖的重要条件。如果缓冲液不适宜, 细胞无法长时
间存活, 甚至会在短时间内破裂, 最终势必会影响产
率。对黑麦草SCs的分离研究结果表明, 在分离和保
存缓冲液中添加维生素C可以增加SCs的产率, 维生
素C与FCS联用也可增加SCs的产率, 但FCS仅需在
保存缓冲液中添加, 其在分离缓冲液中则没有增加
SCs产率的效果(van der Maas et al., 1993)。
3 精细胞二型性
精细胞的二型性是指生殖细胞经有丝分裂所产生的2
鲁云龙等: 被子植物生殖细胞与精细胞的分离方法 241
个精细胞在形状、大小、细胞器种类及数量、甚至是
细胞核内染色体组成上有一定差异的现象(Russell,
1991)。对精细胞二型性的关注始于早期的2个主要发
现 : 一个是在羽衣甘蓝 (Brassica oleracea var.
acephala)的花粉中发现最靠近营养细胞核的精细胞
富含线粒体而缺乏质体(Dumas et al., 1985); 另一个
是发现白花丹花粉中2个精细胞与营养细胞核的空间
位置关系存在差异(Russell and Cass, 1981)。基于2
个精细胞与营养细胞核的特定空间位置 , Rus-
sell(1984)将与营养细胞核相连的精细胞命名为Svn,
与营养细胞核不相连的精细胞命名为Sua。随后的研
究进一步将精细胞的二型性大体分为细胞质二型性
和细胞核二型性。细胞质二型性指2个精细胞主要在
线粒体、质体等细胞器的种类和数量上存在差异
(Russell, 1985, 1991); 细胞核二型性则指2个精细胞
核内染色体存在差异。目前精细胞的细胞质二型性仅
在白花丹、菠菜、羽衣甘蓝、油菜、甜大戟(Euphorbia
dulcis)、烟草6种植物花粉中有过报道(Russell and
Cass, 1981; Russell, 1984, 1985; Carlson and
Phillips, 1986; McConchie et al., 1987; Murgia and
Wilms, 1988; 胡适宜, 1990; Zhang et al., 1998;
Saito et al., 2000; Tian et al., 2001; Gou et al.,
2009); 而至今只在玉米花粉中发现细胞核二型性,
这是由于玉米生殖细胞中的B-染色体在有丝分裂过
程中经常出现不分离现象(Roman, 1947; Carlson
and Phillips, 1986; Faure et al., 2003)。因此, 精细
胞二型性的现象仍然需要更多的证据来确认。精细胞
二型性现象提示了一个新的科学问题: 在双受精过程
中, 1个花粉中的2个精细胞与卵细胞和中央细胞的结
合是随机的, 还是有倾向性的？Russell(1985)对白
花丹倾向性受精(preferential fertilization)的研究结果
表明, 体积较小、质体含量丰富而线粒体含量稀少的
Sua更倾向于与卵细胞融合。Faure等(2003)通过荧光
原位杂交(fluorescence in situ hybridization)对玉米
精细胞的倾向性受精研究显示, 2种精细胞都具有结
合卵细胞的能力, 但是携带B染色体的精细胞更倾向
于结合卵细胞。这些研究为倾向性受精提供了重要证
据。但到目前为止, 精细胞二型性的分子基础与生物
学意义尚不十分清楚。
利用精细胞分离技术分离纯化二型性的两类精
细胞, 是研究精细胞二型性分子基础和生物学意义的
前提。目前分离二型性精细胞最有效的方法是渗透压
冲击结合显微操作仪挑选(Zhang et al., 1998; Qiu et
al., 2004)。这种方法涉及显微操作仪挑选, 是手工依
赖性的 , 难以获得大量纯化的Svn和Sua。Gou等
(2009)以白花丹花粉为材料, 根据Svn和Sua的大小、
形状、在营养细胞中的相对位置以及与VNs的联结情
况, 用显微操作仪分离12 000个Svn和Sua, 通过构建
cDNA文库 , 结合抑制消减杂交 (suppression sub-
tractive hybridization)、定制芯片(custom microar-
rays)、real-time PCR、原位杂交(in situ hybridization)
等方法, 比较Svn和Sua的基因表达模式。研究结果表
明, 更倾向与卵细胞结合的Sua表达相对较多的转录、
翻译、蛋白质修饰相关的转录本, 这与幼胚的预期基
因表达模式相似; 倾向与中央细胞结合的Svn则更多
地表达与激素合成相关的转录本, 这又与胚乳的预期
基因表达模式相似。上述结果在一定程度上可以表明
来源于Sua和Svn的mRNAs对双受精后胚和胚乳的发
育有重要意义。
4 总结和展望
被子植物GCs和SCs的分离方法研究始于20世纪70
年代(Cass, 1973), 其目的在于对参与植物有性生殖
过程的成员进行深入详细的剖析, 以及在植物生殖工
程领域上应用, 从而使我们更加清楚地认识被子植物
的有性生殖过程(周嫦和杨弘远, 1989; 杨弘远和周
嫦, 1998; Sun and Yang, 2002; 彭雄波和孙蒙祥,
2007)。经过40多年的探索, 已建立了适用于多个物
种GCs或SCs的分离方法(表1), 并对影响所分离细
胞纯度及活性的物理化学因素有了比较全面的认识。
GCs或SCs的分离方法涉及2个主要环节, 一个是破
裂花粉(管); 另一个是分离GCs或SCs。虽然已有多
种破裂花粉(管)的方法, 但尚未发现适用于破裂不同
物种花粉的通用方法。因此需要针对所研究物种花粉
的特性, 通过实验筛选合适的花粉(管)破裂方法。通
常情况下渗透压冲击法是首选。密度梯度离心、流式
细胞仪分选和显微操作仪挑选等是分离GCs或SCs
的主要方法, 前两种方法适用于大量细胞的分离。密
度梯度离心因其具有操作简便、纯化效果好等优点,
是被应用最多的方法。流式细胞仪分选对设备和技术
的要求较高且操作较为繁琐, 同时需要荧光标记待分
242 植物学报 49(3) 2014
选的细胞, 目前仅用于分离玉米和拟南芥的精细胞
(Engel et al., 2003; Borges et al., 2008, 2012)。显微
操作仪挑选依赖于手工操作, 比较适合用于特定细胞
(如二型性精细胞)的挑选, 不适合GCs或SCs的大量
分离实验。今后在分离方法研究方面的主要挑战是解
决具有二型性的2个精细胞群体的规模化分离问题。
GCs或SCs分离方法的发展与完善为阐释植物
生殖生物学的重要问题奠定了基础。这些问题包括精
细胞分化、发育和功能决定的机制, 一个花粉中2个
精细胞是否存在分子细胞学的差异, 二型性精细胞的
分子基础及其倾向性受精等。近几年, 利用分离的拟
南芥和水稻精细胞通过功能基因组研究揭示了精细
胞转录组特征(Borges et al., 2008; Russell et al.,
2012)以及小RNA和DNA甲基化途径在调控父系表观
遗传、转座子沉默和基因印迹(gene imprinting)中的
重要性(Borges et al., 2008; Calarco et al., 2012)。
进一步利用高通量测序技术、单细胞测序技术等深入
比较分析GCs和SCs以及二型性精细胞的功能基因
组差异, 必将为阐释上述问题提供新的证据。
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Current Methods Used to Isolate and Purify Generative and
Sperm Cells from Pollen Grains and Tubes of Flowering Plants
Yunlong Lu1, Liqin Wei2, Shaojun Dai1*, Tai Wang2*
1Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field, Ministry of Education, Alkali Soil Natural Envi-
ronmental Science Center, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
2Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China
Abstract In flowering plants, sperm cell development involves a special postmeiotic process. During the process, each
microspore generated by pollen mother-cell meiosis undergoes unsymmetrical mitosis to result in a large vegetative cell
and a small generative cell enclosed in the vegetative cell. The vegetative cell exits the cell cycle, and the generative cell
undergoes further mitosis to generate 2 sperm cells. Functional genomics studies of generative and sperm cells are es-
sential for understanding the molecular control of fate determination and the function of sperm cells and cell–cell recogni-
tion during double fertilization. These studies require isolated and purified generative and sperm cells. Here, we summa-
rize the main methods used to isolate and purify generative and sperm cells from pollen grains and tubes of diverse plant
species since the 1970s, discuss the advantages and disadvantages of each method, and analyze factors affecting out-
put, purity, longevity and viability of purified generative and sperm cells.
Key words generative cell, sperm cell, osmotic shock, density gradient centrifugation, isolation and purification
Lu YL, Wei LQ, Dai SJ, Wang T (2014). Current methods used to isolate and purify generative and sperm cells from
pollen grains and tubes of flowering plants. Chin Bull Bot 49, 229–245.
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* Authors for correspondence. E-mail: daishaojun@hotmail.com; twang@ibcas.ac.cn
(责任编辑: 白羽红)