全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2012, 47 (6): 581–593, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2012.00581
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收稿日期: 2012-01-16; 接受日期: 2012-04-11
基金项目: 国家基础研究发展计划(No.2010CB126006)和陕西省农业攻关项目(No.2011K02-09)
* 通讯作者。E-mail: jianingyucn@yahoo.com.cn
小麦叶绿体蛋白质编码基因RNA编辑位点的
测定及与返白现象的关系
邓李坤, 李妍, 俞嘉宁*
陕西师范大学生命科学学院, 西安 710062
摘要 RNA编辑是一种转录后基因加工修饰现象, 广泛存在于高等植物细胞器中。已有研究表明, RNA编辑与植物发生白
化或者黄化有关。通过PCR、RT-PCR及测序的方法, 对具有阶段性白化特性的小麦(Triticum aestivum)返白系FA85及其
野生型矮变一号(Aibian 1)的叶绿体蛋白质编码基因RNA编辑位点进行了测定, 在14个基因上发现了26个编辑位点。有5个
编辑位点在2个株系之间存在编辑效率的差异, 且这些差异的位点均位于编码叶绿体RNA聚合酶的基因上, 其中3个位点编
辑前后对应的蛋白质二级结构可能有差异。对2个株系叶绿体中PEP、NEP及PEP、NEP共同依赖基因转录水平的检测显
示, 除psbA和clpP外, 其它基因在小麦返白系中的转录水平均有不同程度的下降。这种转录水平的显著下降及叶绿体RNA
聚合酶基因上RNA编辑位点编辑效率的改变, 可能与小麦返白系叶片的返白有关。
关键词 叶绿体, 返白系, RNA编辑, 小麦
邓李坤, 李妍, 俞嘉宁 (2012). 小麦叶绿体蛋白质编码基因RNA编辑位点的测定及与返白现象的关系. 植物学报 47,
581–593.
RNA编辑是基因转录后加工修饰现象, 包括核
苷酸的插入、删除和缺失, 其结果导致编辑后的密码
子发生改变。RNA编辑广泛存在于动物与植物中(Ma-
ier et al., 1996; Gott and Emeson, 2000; Shikanai,
2006)。高等植物中RNA编辑主要发生在叶绿体和线
粒体转录本中。目前, 已经测定叶绿体RNA编辑位点
的高等植物有角苔(Anthoceros formosae)(Kugita et
al., 2003)、铁线蕨(Adiantum capillus-veneris)(Wolf
et al., 2004)、黑松(Pinus thunbergii)(Wakasugi et
al., 1996)、蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodita)(Zeng et
al., 2007)、豌豆(Pisum sativum)(Inada et al., 2004)、
烟草(Nicotiana tabacum)(Hirose et al., 1999)、拟南
芥(Arabidopsis thaliana)(Tsudzuki et al., 2001)、颠
茄(Atropa belladonna)(Schmitz-Linneweber et al.,
2002)、番茄 (Lycopersicon esculentum)(Kahlau et
al., 2006) 、 黄 瓜 (Cucumis sativus)(Guzowska-
Nowowiejska et al., 2009)、玉米(Zea mays)(Maier et
al., 1995) 、水稻 (Oryza sativa)(Corneille et al.,
2000)、甘蔗(Saccharum officinarum)(Calsa Jünior
et al., 2004)和棉花(Gossypium hirsutum)(江媛等,
2011b)。
研究表明, RNA编辑现象可能具有生物学意义。
首先, RNA编辑改变了基因组编码的遗传信息。大部
分RNA编辑事件都发生在密码子的第2位, 导致氨基
酸序列发生改变或产生新的启动子和终止子(Grewe
et al., 2009), 影响蛋白质功能(Bock et al., 1994;
Zito et al., 1997; Sasaki et al., 2001)。如RNA编辑的
缺失会导致植物黄化、白化甚至幼苗致死(Bock et al.,
1993; Karcher and Bock, 2002; Chateigner-Boutin
et al., 2008; Tseng et al., 2010)。其次, 大多数RNA
编辑恢复了进化上的保守序列, 增加了编码蛋白质的
疏水性 , 有助于提高转录本的稳定性 (Giegé and
Brennicke, 1999)。最后, 发生在基因非编码区上的
RNA编辑对mRNA的拼接有重要作用(Castandet et
al., 2010)。
小麦(Triticum aestivum)隶属禾本科小麦属, 是
重要的经济作物, 其叶绿体基因图谱已在2000年完
成(Ogihara et al., 2000), 但对叶绿体RNA编辑的研
·研究报告·
582 植物学报 47(6) 2012
究目前还未见报道。本实验测定了小麦叶绿体蛋白质
编码基因的RNA编辑位点, 并对其突变体小麦返白
系进行了分析测定。结果显示, 两者的编辑位点相同,
但是5个位点的RNA编辑效率有显著差异, 而且白化
期间的叶绿体基因表达也有显著不同。研究结果为探
讨小麦返白的分子机制提供了实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
实验材料选自不同生长时期的小麦(Triticum aesti-
vum L.)矮变一号以及返白系。于2010年3月从河南省
濮阳市五星种业有限公司育种基地采样, 取幼嫩心
叶, 经液氮冷却后放入–80°C冰箱中保存。
1.2 实验试剂与仪器
1.2.1 试剂
PrimeScript® RT reagent Kit Perfect Real Time试剂
盒、DNase和DNase buffer购自 TaKaRa公司。
BioSpin Gel Extraction Kit试剂盒购自Bioer Tech-
nology有限公司(杭州)。 2 × Taq PCR Mix、ddH2O
购自西安润德生物技术有限公司。异硫氰酸胍、β-巯
基乙醇、NaAc、NaCl、水饱和酚、CTAB、氯仿、
无水乙醇、LiCl、DEPC、Tris-base、EB、EDTA和
溴酚蓝购自Amresco公司。

1.2.2 仪器
实验仪器包括PICO17型离心机(Gene Limited Com-
pany)、DYY-12型电泳仪 (北京市六一仪器厂 )、
ALS1296型PCR仪 (美国BIO-RAD公司 )以及GDS-
8000型凝胶成像系统(美国UVP公司)。
1.3 方法
1.3.1 叶绿体蛋白质编码基因RNA编辑位点的预测
及引物设计
从NCBI数据库中查找小麦(AB042240.3)、水稻(X15-
901.1)、甘蔗(NC-005878.2)和烟草(NC-001879)的叶
绿体基因组序列。应用ExPASy-Translate Tool和
ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw
2/)软件比对水稻、甘蔗和烟草的叶绿体基因的氨基酸
序列与小麦中同源基因的DNA序列推导出的氨基酸
序列(图1), 预测小麦叶绿体基因RNA编辑位点。根据
NCBI数据库中发布的小麦叶绿体基因的序列设计引
物, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3.2 总DNA的提取
称取0.1 g叶片, 液氮研磨粉碎后加入600 μL预热的
CTAB溶液, 65°C水浴40分钟, 加入等体积的氯仿/异
戊醇(24:1, v/v)混匀, 15 000 ×g离心10分钟, 吸取上清,
加入500 μL异戊醇, 颠倒混匀, 15 000 ×g离心10分钟,
弃上清, 加入500 μL 70%乙醇, 15 000 ×g离心4分钟。
室温干燥后将DNA制品溶于30 μLTE缓冲液中。

1.3.3 总RNA的提取
称取0.1 g叶片, 液氮研磨粉碎后加入300 μL预冷的
异硫氰酸胍溶液(含1%的β-巯基乙醇), 加入30 μL 2
mol·L–1 NaAc、300 μL水饱和酚和100 μL氯仿, 混匀
后于6 200 ×g 4°C离心15分钟; 吸出上清, 加入2.5
倍体积的无水乙醇, 6 200 ×g 4°C离心15分钟, 弃上
清。将沉淀加入100 μL 4 mol·L–1LiCl混匀, 15 000 ×g
4°C离心15分钟, 弃上清, 加入100 μL灭菌DEPC水、
50 μL水饱和酚、50 μL氯仿, 颠倒混匀, 15 000 ×g
4°C离心5分钟 ; 吸取上清 , 再加入等体积氯仿 ,
15 000 ×g 4°C离心5分钟; 吸取上清, 加入1/10体积
3 mol·L–1NaAc和2倍体积无水乙醇, 15 000 ×g 4°C
离心5分钟, 弃上清。将沉淀干燥后, 加入20 μL灭菌
DEPC水溶解。

1.3.4 PCR及RT-PCR
PCR扩增目的基因, 反应体系为1 μL小麦DNA(约50
ng), 12.5 μL 2 × Taq PCR Mix, 上、下游引物各2 μL,
用水补足至25 μL。反应程序如下: 94°C5分钟; 94°C
30秒, 50°C30秒, 72°C1分钟, 30个循环; 72°C延伸7
分钟。PCR扩增产物于4°C保存。
RT-PCR扩增目的基因, DNA酶处理程序如下。
反应体系为19 μL小麦总RNA(约950 ng), 3.5 μL
RQ1 RNase-Free DNase, 2.5 μL RQ DNase 10×
Reaction Buffer。于37°C处理90分钟, 加入等体积氯
仿, 15 000 ×g 4°C离心5分钟, 取上清, 加入2倍体积
的4°C异丙醇, 置于冰上5分钟, 16 200 ×g 4°C离心5
分钟, 弃上清, 于室温干燥10分钟, 加入15 μL灭菌
DEPC水。
邓李坤等: 小麦叶绿体蛋白质编码基因 RNA 编辑位点的测定及与返白现象的关系 583
逆转录采用PrimeScript® RT reagent Kit Perfect
Real Time试剂盒。反应体系为2 μL 5×PrimeScript®
buffer, 0.5 μL PrimeScript® RT Enzyme Mix I, 0.5
μL Oligo dT Primer, 0.5 μL Random 6 mers, 3 μL(约
150 ng)总RNA, 用RNase Free dH2O补足至10 μL,
经37°C水浴15分钟及85°C水浴5秒后终止反应。
目的基因扩增的反应体系为1 μL(约50 ng)小麦
cDNA, 12.5 μL 2 × Taq PCR Mix, 上、下游引物各2
μL, 用水补足至25 μL。反应程序如下: 94°C5分钟;
94°C30秒, 50°C30秒, 72°C1分钟, 30个循环; 72°C
延伸7分钟。扩增产物于4°C保存。
扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测, 目的基因
条带经BioSpin Gel Extraction Kit回收纯化, 送上海
生工生物工程服务有限公司测序。

1.3.5 编辑位点及编辑效率的确定
运用Lasergene软件包中的SeqMan软件拼接目的基
因测序结果。利用ClustalW2软件将测序获得的小麦
叶绿体基因cDNA序列与DNA序列进行比对, 确定编
辑位点。
编辑效率的确定采用直接测序法, 重复测序4–6
次。使用CorelDRAW X5软件直接测量测序峰值图上
每个编辑位点的T峰和C峰高度, T峰高度与(T+C)峰
总高度的比值的平均值即为该位点的编辑效率
(Tseng et al., 2010)。

1.3.6 生物信息学分析
利用ClustalW2和GeneDoc软件对叶绿体RNA编辑
位点的上游30个和下游5个核苷酸进行比对和分析。
利用NPS@(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_au-
tomat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)分析蛋白
质二级结构。

1.3.7 叶绿体基因的半定量PCR检测
以actin为内参基因, PCR扩增petB、psaA、psbA、
psbE、rpoA、rpoB、rpoC1、atpA、atpB、clpP。反
应体系为2 μL(约100 ng)小麦cDNA, 12.5 μL 2 × Taq
PCR Mix, 上、下游引物各2 μL, 用水补足至25 μL。
反应程序如下: 94°C5分钟; 94°C30秒, 复性30秒,
72°C1分钟; 72°C延伸7分钟。扩增产物于4°C保存。
PCR反应中复性温度及循环圈数见表1。琼脂糖凝胶
表1 半定量PCR反应程序参数
Table 1 Parameters of semi-quantitative PCR
Cyclic number (circle) Annealing
temperature (°C) 17 22 23 25 30
50 petB rpoA,
atpA
54 psbA psbE,
clpP
psaA,
atpB
Actin,
rpoB,
rpoC1


电泳检测, 观察产物亮度以检测矮变一号和返白系中
叶绿体基因转录水平的差异。
2 结果与讨论
2.1 叶绿体基因RNA编辑位点的预测
由于RNA编辑大都可恢复进化上保守的氨基酸序列
(Chateigner-Boutin and Small, 2010), 通过比对已
测定编辑位点的同源基因的氨基酸序列与待分析基
因由DNA序列推导出的氨基酸序列, 可预测RNA编
辑位点。如图1所示, ndhA是叶绿体NDH复合体蛋白
质编码基因之一, 小麦中ndhA的序列由其DNA序列
推出, 而其它3种植物的ndhA从编辑位点已确定的
cDNA序列得出, 在158位、188位与357位上3个已知
编辑位点的物种中相应氨基酸是Leu与Phe, 而小麦
中为Ser, 推测这几个位点在小麦中可能也将发生编
辑。其余叶绿体蛋白质编码基因的比对与此类似(结
果未显示)。用上述比对方法, 预测出17个小麦叶绿体
蛋白质编码基因可能存在28个编辑位点(表2)。
2.2 叶绿体基因RNA编辑位点的测定
根据预测结果及小麦叶绿体基因组序列 (AB04-
2240.3)设计引物。提取矮变一号的DNA与总RNA,
通过PCR和RT-PCR得到小麦叶绿体基因的DNA和
c D N A序列。测序结果经S e q m a n软件拼接和
ClustalW2软件比对, 最终在14个基因中检测到26个
编辑位点(表3)。与预测结果相比有92.9%的一致性,
其中atpA、ndhD、ndhF、petB、rpl2、rpl20、rpoA、
rpoC2、rps8、psbL有1个编辑位点; ycf3有2个编辑
位点; ndhA和rpoB有3个编辑位点; ndhB有8个编辑
位点。26个编辑位点全部是C到U的转换, 其中24个
编辑位点在密码子的第2位, 占92.3%, 在密码子的
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图1 小麦叶绿体ndhA基因RNA编辑位点的预测
箭头指向及加粗的字母表示可能存在编辑位点。Ta: 小麦; Os: 水稻; So: 甘蔗; Nt: 烟草

Figure 1 Prediction of RNA editing sites in chloroplast gene ndhA of Triticum aestivum
Arrows and black bold letters indicate the predicted RNA editing sites. Ta: Triticum aestivum; Os: Oryza sativa; So: Saccharum
officinarum; Nt: Nicotiana tabacum


第1位和第3位各有1个编辑事件发生。
2.3 叶绿体基因RNA编辑位点
2.3.1 叶绿体基因RNA编辑倾向于发生在U_A类型
密码子中
通过对26个编辑位点上、下游的核苷酸进行统计(图
2), 结果显示, 小麦叶绿体RNA编辑位点中U_A类型
密码子最多, 达41%; 其次是C_A, 占15%, U_C占
12%; U_U类型最少, 仅有4%。此外, 编辑位点前为U
的占69%, 后一位为A的占56%。表明小麦叶绿体
RNA编辑偏向于发生在U_A类型中。

2.3.2 RNA编辑增加叶绿体蛋白质的疏水性
为了进一步了解小麦叶绿体基因发生RNA编辑对氨
基酸序列的影响, 我们分析了26个编辑位点造成氨
基酸的改变情况(图3)。结果显示, 除了1个发生在
psbL第3位的沉默编辑不造成氨基酸改变, 其余25个
编辑位点都会造成相应氨基酸序列的改变。大部分编
辑事件增加了编码氨基酸的疏水性(77%), 其中Ser
转变成Leu占54%, Ser转变成Phe占15%, Thr转变成
Met占8%。其它类型的编辑事件中, 从疏水到疏水的
转变仅有Pro转变成Leu, 占15%; 从亲水到亲水的转
变只有His转变成Tyr, 占4%。

2.3.3 顺式作用元件
目前, 在叶绿体RNA编辑位点的上、下游序列中并没
有发现完全相同的核苷酸序列或二级结构(Hammani
et al., 2009), 但某些RNA编辑位点可能有相似的顺
式作用元件, 它们可被相同的反式作用因子所识别
(Chateigner-Boutin and Hanson, 2003)。我们将26
个小麦叶绿体RNA编辑位点的上游30个和下游5个核
苷酸序列进行比对, 并未发现有共同的顺式作用元
件。但对序列进行两两比对, 结果显示, atpA C1148
与ndhA C567、ndhB C467与ycf3 C44、ndhB C586
与ndhD C878、ndhB C611与ndhB C830、ndhB
C737与petB C611、ndhB C830与rpl20 C308、ndhF
C62与psbL C111、rpl20 C308与rpoA C527的编辑
位点–30到+5之间的核苷酸一致性较高, 达60%以上
(图4)。推测这8对编辑位点可能各自由相同的反式作
用因子所识别。
2.4 叶绿体RNA编辑位点进化趋势
我们对测得的小麦叶绿体RNA编辑位点以及其它高
等植物(Maier et al., 1995; Wakasugi et al., 1996;
邓李坤等: 小麦叶绿体蛋白质编码基因 RNA 编辑位点的测定及与返白现象的关系 585
表2 小麦叶绿体蛋白质编码基因RNA编辑位点的预测
Table 2 Prediction of RNA editing sites in chloroplast genes of Triticum aestivum
Gene Editing sites Oryza sativa Saccharum officinarum Nicotiana tabacum Triticum aestivum
atpA 1 148 ＋ ＋ ＋ ＋
atpF 92 ＋ － ＋ ＋
ndhA 473 ＋ ＋ － ＋
563 － ＋ － ＋
1 070 ＋ ＋ ＋ ＋
ndhB 467 ＋ ＋ ＋ ＋
586 ＋ ＋ ＋ ＋
611 ＋ ＋ ＋ ＋
704 ＋ － － ＋
737 ＋ ＋ ＋ ＋
830 ＋ ＋ ＋ ＋
836 ＋ ＋ ＋ ＋
1 481 ＋ ＋ ＋ ＋
ndhD 878 ＋ ＋ － ＋
ndhF 62 ＋ ＋ － ＋
petB 611 － ＋ ＋ ＋
psbL 2 － － ＋ ＋
rpl2 2 ＋ ＋ － ＋
rpl20 308 － ＋ ＋ ＋
rpoA 830 － － ＋ ＋
rpoB 467 ＋ ＋ ＋ ＋
545 ＋ ＋ ＋ ＋
560 ＋ ＋ － ＋
rpoC1 62 － － ＋ ＋
rpoC2 2 774 － ＋ ＋ ＋
rps8 182 ＋ ＋ － ＋
rps14 80 ＋ ＋ ＋ ＋
ycf3 185 ＋ ＋ － ＋
+: 发生编辑现象; –: 不发生编辑现象 +: Editing; –: No editing

Hirose et al., 1999; Corneille et al., 2000; Tsudzuki
et al., 2001; Schmitz-Linneweber et al., 2002;
Kugita et al., 2003; Calsa Jünior et al., 2004; Inada
et al., 2004; Wolf et al., 2004; Kahlau et al., 2006;
Zeng et al., 2007; Guzowska-Nowowiejska et al.,
2009)的编辑位点的统计结果进行了分析(表4)。结果
表明, 随着植物的进化, 编辑位点由苔藓植物、蕨类
植物、裸子植物、双子叶植物到单子叶植物呈逐渐减
少的趋势(Chateigner-Boutin and Small, 2010)。苔藓
植物和蕨类植物中还存在着U→C的编辑, 裸子植物、
双子叶植物和单子叶植物的编辑都是C→U类型。从
苔藓植物到单子叶植物 , 第2位编辑的比例逐渐提
高。沉默编辑逐渐消失, 蝴蝶兰和玉米中的沉默编辑
存在于非编码区。编辑形成的新起始密码子和新终止
密码子数随进化逐渐减少。
2.5 返白系与野生型叶绿体基因RNA编辑位点比
对分析
2.5.1 返白系与矮变一号叶绿体基因RNA编辑位点
的比对
返白系是矮变一号的突变株。该突变体在苗期的表现
与矮变一号无异, 但在平均温度低于5°C时, 返白系
自心叶基部开始白化, 白化面积随生长自下而上扩
大。之后随着温度的逐渐升高, 又自心叶基部开始变
绿, 即具有低温诱导的阶段性白化特性(Larkin et al.,
2003)。以往研究表明, 植物白化、黄化的机制可能
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表3 小麦叶绿体基因RNA编辑位点
Table 3 RNA editing sites in chloroplast genes of Triticum
aestivum
Gene Codon position Codon change Amino acid change
atpA 1 148 uCa→uUa S→L
ndhA 473 uCa→uUa S→L
563 uCa→uUa S→L
1 070 uCu→uUu S→F
ndhB 467 cCa→cUa P→L
586 Cau→Uau H→Y
611 uCa→uUa S→L
704 uCc→uUc S→F
737 cCa→cUa P→L
830 uCa→uUa S→L
836 uCa→uUa S→L
1 481 cCa→cUa P→L
ndhD 878 uCa→uUa S→L
ndhF 62 uCa→uUa S→L
petB 611 cCa→cUa P→L
psbL 111 uuC→uuU F→F
rpl2 2 aCg→aUg T→M
rpl20 308 uCa→uUa S→L
rpoA 527* uCc→uUc S→F
rpoB 467* uCg→uUg S→L
545* uCa→uUa S→L
560* uCg→uUg S→L
rpoC2 4 031* uCg→uUg S→L
rps8 182 uCa→uUa S→L
ycf3 44 uCc→uUc S→F
185 aCg→aUg T→M
* 返白系与矮变一号编辑效率有差异的编辑位点
* Significant editing efficiency difference between FA85 and
Aibian 1


图2 小麦叶绿体基因RNA编辑密码子转变类型

Figure 2 Sequence alteration of RNA editing sites in chloro-
plast genes of Triticum aestivum
与叶绿体RNA编辑有关(Bock et al., 1993; Karcher
and Bock, 2002; Chateigner-Boutin et al., 2008;
Tseng et al., 2010)。而小麦返白系这种低温诱导的
阶段性白化特性是否与RNA编辑现象有关, 目前尚
未见报道。我们采集了小麦返白系白化期和复绿期的
叶片, 以同期的野生型矮变一号为对照, 对26个编辑
位点的编辑效率进行了4–6次测序和统计。结果显示,
返白系的叶绿体基因RNA编辑位点与矮变一号一致,
但是在rpoA C527、rpoB C467、rpoB C545、rpoB
C560和rpoC2 C4031五个编辑位点上, 返白系与矮
变一号的编辑效率存在差异(图5)。复绿期 , rpoA
C527、rpoB C467、rpoB C545和rpoB C560四个编
辑位点上返白系与野生型编辑效率基本相同, 相差不
超过5%; 仅rpoC2 C4031的编辑效率在返白系中比
同期野生型低12%。而白化期除rpoA C527的编辑效
率在返白系中比同期野生型低3.9%, 其余4个编辑位
点在返白系与野生型中的编辑效率差异显著。rpoC2
C4031的编辑效率在返白系中比同期野生型低
40.2%, rpoB C467、rpoB C545和rpoB C560的编辑
效率在返白系中比同期野生型分别高47.4%、54.2%
和56.9%。值得注意的是 , 与野生型相比 , 返白系
rpoB三个编辑位点在白化期比非白化期编辑效率高
50%左右, 而rpoC2 C4031编辑位点在白化期则比非
白化期编辑效率低28%。

2.5.2 差异位点二级结构
运用NPS@分析rpoA C527、rpoC2 C4031、rpoB
C467、rpoB C545和rpoB C560编辑前后对应的蛋白
质二级结构组成(图6)。结果显示, rpoA C527编辑后
编辑位点附近3个β折叠转变为无规则卷曲 ; rpoB
C560编辑后编辑位点附近3个β折叠转变为α螺旋;
rpoC2 C4031编辑后编辑位点附近1个α螺旋转变为
无规则卷曲; rpoB C467和rpoB C545的编辑对rpoB
的二级结构无显著影响。表明RNA编辑在一定程度上
可能会影响蛋白质的二级结构。
2.6 返白系与矮变一号不同时期基因转录水平的
差异
为了了解叶绿体RNA编辑效率的改变对返白系和矮
变一号中叶绿体光合作用相关基因转录水平的影响,
我们选取了4个依赖叶绿体基因编码的RNA聚合酶
邓李坤等: 小麦叶绿体蛋白质编码基因 RNA 编辑位点的测定及与返白现象的关系 587

图3 小麦叶绿体蛋白质编码基因RNA编辑后氨基酸亲疏水性分析

Figure 3 Amino acid hydrophilicity and hydrophobicity analysis after RNA editing in chloroplast protein-coding genes of Triticum
aestivum



图4 小麦叶绿体基因RNA编辑位点上游–30及下游+5处顺式作用元件比对
阴影表示每组中相同的核苷酸; *及加粗的字母表示发生编辑的靶C。

Figure 4 Comparison of cis-acting elements at –30 upstream and +5 downstream of RNA editing sites in chloroplast genes of
Triticum aestivum
The gray shadows indicate the similar nucleotides around editing sites; * and black bold letters denote editing sites.


588 植物学报 47(6) 2012
表4 高等植物叶绿体RNA编辑位点
Table 4 RNA editing sites in higher plant chloroplasts
Hornwort Fern Gymno-
sperm
Dicotyledon Monocotyledon
Anfo Adca Pith Nita Lyes Atbe Arth Cusa Phap Zema Saof Orsa Trae
Total editing sites 942 349 26 37 36 35 34 32 44 26 23 21 26
C to U (% of total) 54 90 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1st codon edits
(% of total)
38.4 26 26.9 5.4 5.6 2.9 14.7 9.4 9.1 4 4.3 4.8 3.8
2nd codon edits
(% of total)
58.6 68 73.1 91.9 94.4 94.3 85.3 90.6 86.4 92 95.7 95.2 92.3
3rd codon edits
(% of total)
3.0 6.0 0 2.7 0 2.9 0 0 0 4 0 0 3.8
Silent edits 28 21 0 0 0 0 0 0 2 1 0 0 0
New starts 5 21 0 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1
New stops 3 3 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Anfo: 角苔; Adca: 铁线蕨; Pith: 黑松; Nita: 烟草; Lyes: 番茄; Atbe: 颠茄; Arth: 拟南芥; Cusa: 黄瓜; Phap: 蝴蝶兰; Zema: 玉
米; Saof: 甘蔗; Orsa: 水稻; Trae: 小麦
Anfo: Anthoceros formosae; Adca: Adiantum capillus-veneris; Pith: Pinus thunbergii; Nita: Nicotiana tabacum; Lyes: Lycopersi-
con esculentum; Atbe: Atropa belladonna; Arth: Arabidopsis thaliana; Cusa: Cucumis sativus; Phap: Phalaenopsis aphrodita
subsp. formosana; Zema: Zea mays; Saof: Saccharum officinarum; Orsa: Oryza sativa; Trae: Triticum aestivum


(PEP)转录的基因(psbA、petB、psbE和psaA)、3个
依赖核基因编码的RNA聚合酶 (NEP)转录的基因
(rpoA、rpoB和rpoC1)和3个共依赖NEP和PEP转录的
基因(clpP、atpA和atpB)为研究对象。以actin为内参
基因, 用半定量PCR的方法检测以上基因在白化期
和复绿期的转录水平(图7)。结果表明, 白化期除psbA
表达量无变化外, 3个PEP依赖的基因(petB、psbE和
psaA)和3个NEP依赖的基因(rpoA、rpoB和rpoC1)的
转录水平在返白系中明显比矮变一号低; 而NEP和
PEP共同依赖的基因中, 只有clpP在野生型中的转录
水平比返白系略高, 其余2个基因(atpA和atpB)的转
录水平在返白系中均比矮变一号明显偏低。在复绿期,
所有返白系基因的转录水平均可恢复到野生型的水
平。
2.7 讨论
RNA 编辑是一种基因转录后的加工修饰现象
(Chateigner-Boutin and Small, 2010)。本实验测定了
小麦矮变一号与其突变体返白系的叶绿体蛋白质编
码基因的RNA编辑位点, 在14个基因中共检测到26
个编辑位点。通过分析表明, 小麦叶绿体基因RNA编
辑全部为C到U的转变, 主要发生在密码子第2位, 大
多数导致编码氨基酸的改变偏向于发生在U_A类型
密码子中, 且增加了编码氨基酸的疏水性(图2, 图
3)。这些特性与以往的高等植物, 尤其是被子植物中
叶绿体RNA编辑的特性相似(江媛等, 2011a)。
以往对RNA编辑机制的研究表明, 某些反式作
用因子特异性识别编辑位点上游30个和下游5个核苷
酸范围内的顺式作用元件, 进而吸引RNA编辑酶进
行RNA编辑(Chaudhuri et al., 1995; Salone et al.,
2007; Hammani et al., 2009)。但目前还没有找到一
种通用的顺式作用元件(Chateigner-Boutin and
Hanson, 2002)。而通过分析识别多个编辑位点的反
式作用因子发现其识别的编辑位点上游30个和下游5
个核苷酸有相似区域。Kobayashi等(2008)认为序列
相似性达60%以上将由同样的反式作用因子识别, 而
且反式作用因子可能不是特异性识别核苷酸种类, 而
是通过识别嘌呤和嘧啶的特异性排列来识别靶
C(Hammani et al., 2009)。因此, 小麦叶绿体RNA编
辑位点中顺式作用元件相似性较高的序列可能各自
由相同的反式作用因子所识别(图4)。其中ndhB C830
位点上、下游的顺式作用元件分别与ndhB C611和
rpl20 C308的顺式作用元件有60%以上的相似性。其
原因可能是ndhB C830位编辑由多种反式作用因子
邓李坤等: 小麦叶绿体蛋白质编码基因 RNA 编辑位点的测定及与返白现象的关系 589

图5 小麦返白系与矮变一号不同时期叶绿体RNA编辑效率的
差异
(A) 复绿期; (B) 白化期

Figure 5 Editing efficiency difference between FA85 and
Aibian 1 of Triticum aestivum
(A) Green period; (B) Pale period




图6 3个差异位点编辑前后相应蛋白质二级结构的比较
箭头指向编辑位点。

Figure 6 Comparison of protein secondary structure on 3
editing sites before and after editing
Arrows point to the editing sites.


识别完成脱氨。类似情况也出现在rpl20 C308位点
上。近年对RNA编辑的研究已经证实, 某些编辑位点
可由多个反式作用因子所识别完成靶C脱氨。
Robbins等(2009)和Yu等(2009)分别发现了识别拟南
芥accD C794编辑位点的2个不同的PPR蛋白 :
RARE1和ECB2。ECB2与Hammani等(2009)发现的


图7 小麦返白系与矮变一号叶绿体光合作用相关基因的转录
水平
1: 矮变一号; 2: 返白系

Figure 7 Transcription levels of chloroplast genes in FA85
and Aibian 1 of Triticum aestivum
1: Aibian 1; 2: FA85


OTP84又可同时作用于拟南芥ndhF C290编辑位
点上。
将小麦叶绿体蛋白质编码基因RNA编辑位点与
其它已知的高等植物叶绿体RNA编辑位点进行比对,
结果显示编辑位点数量、第1、3位编辑比例、沉默编
辑的数量、新起始、终止密码子数均随着苔藓植物、
蕨类植物、裸子植物、双子叶植物到单子叶植物的进
化呈逐渐减少趋势(表4)。目前认为, 植物RNA编辑,
特别是C到U的编辑产生于植物水生到陆地的进化过
程中, 由于失去了水的保护, 太阳产生的紫外线导致
植物基因组容易发生T到C的突变, 尤其在TT的结构
中更易发生突变。为了纠正这一突变, 植物在转录水
平产生了RNA编辑, 可把突变的C编辑成T, 以纠正
DNA中发生的突变, 保证翻译出的蛋白质具有功能
(Maier et al., 2008)。随着大气氧含量上升与臭氧层
的形成, 植物接收到的紫外线强度逐渐降低, 而植物
也在不断进化的过程中增强了抵抗紫外线的能力, 在
DNA水平发生回复突变, 于是在转录水平上的RNA
590 植物学报 47(6) 2012
编辑现象随着进化呈现出减少的趋势(Groth-Malo-
nek et al., 2007)。因此有观点认为, RNA编辑可能是
一种正在消失退化的现象(Fiebig et al., 2004)。但近
年来, 已有许多证据表明RNA编辑有改变开放阅读
框、保证蛋白质功能、提高转录本稳定性等作用。如
Grew 等 (2009) 发 现 水 韭 属 植 物 (Isoetes engel-
mannii)中5个基因的开放阅读框被RNA编辑改变, 而
atp1中有1/5的核苷酸发生了RNA编辑, 改变了基因
组的遗传信息。Zito等(1997)发现玉米和烟草叶绿体
基因petB C611位编辑可引起Pro到Leu的改变, 这种
改变有利于细胞色素b6正常生理功能的发挥。Sasaki
等(2001)也发现豌豆的乙酰辅酶A羧化酶需要RNA编
辑来保证正常的生理功能。Giegé和Brennicke(1999)
发现拟南芥线粒体中RNA编辑位点对提高转录本的
稳定性有重要作用。Castandet等(2010)通过体外实
验证明马铃薯 (Solanum tuberosum)线粒体基因
rps10内含子上的RNA编辑位点C3对该基因的正确
拼接有重要作用。
此外, 近年来一些研究显示, 叶绿体基因RNA编
辑的缺失或改变还可引起植物叶片白化、黄化。如拟
南芥幼苗黄化致死的clb19突变体rpoA C200和clpP
C560两个位点缺失编辑(Chateigner-Boutin et al.,
2008); 拟南芥芽黄突变体ys1中的rpoB上的编辑缺
失(Zhou et al., 2009); 拟南芥白化突变体vac1中有3
个编辑位点(accD3′UTR、accD C794和ndhF C290)
的编辑效率显著下降(Tseng et al., 2010); 玉米绿色
幼苗中ndhB 第3个编辑位点发生编辑, 而黄化幼苗
中此位点不发生编辑(Karcher and Bock, 2002); 菠
菜(Spinacia oleracea)叶中psbF发生完全编辑, 而根
和种子质体中只发生部分编辑(Bock et al., 1993)。我
们对野生型和返白系小麦的叶绿体RNA编辑位点进
行比对, 也发现在rpoA C527、rpoC2 C4031、rpoB
C467、rpoB C545和rpoB C560五个编辑位点上编辑
效率有显著差异(图5), 其中3个位点的RNA编辑可能
影响其蛋白质二级结构(图6)。Yura等(2009)在建立分
析RNA编辑位点与蛋白质三级结构关系的数据库
RESOPS时, 证实许多改变蛋白质二级结构的编辑
位点也会导致蛋白质三级结构的改变, 而这种改变可
能会影响蛋白质的功能。Hou等(2009)对返白系及矮
变一号小麦进行的蛋白质组学分析也发现, 双向电泳
后返白系中一些蛋白质的等电点发生改变, 提示可能
存在转录后加工修饰现象。因此小麦返白系中rpoA、
rpoB、rpoC2基因的5个编辑位点的编辑效率改变可
能与叶色的改变有关。
高等植物中叶绿体基因的转录主要依赖2种RNA
聚合酶: 核基因编码的RNA聚合酶(NEP)(Hajdukie-
wicz et al., 1997)和叶绿体基因编码的RNA聚合酶
(PEP)(Hedtke et al., 1997)。NEP主要参与叶绿体中
与转录和翻译相关基因的转录, 如accD、rpoA、rpoB、
rpoC1、rpoC2等(Kapoor et al., 1997); PEP主要参与
叶绿体基因组编码的与光合作用相关基因的转录, 主
要有psaA、psaB、psbA、psbB、petA等(Liere and
Maliga, 1999), 由rpoA、rpoB和rpoC2等基因编码
(Hedtke et al., 1997)。小麦返白系白化期间叶绿体基
因转录水平显著下降(图7), 可能是由于在低温环境
下, 某些核基因(包括编码NEP的一些基因)活性降低,
导致rpoA、rpoB和rpoC2转录水平降低, 进而导致
PEP的合成及组装受阻, 引起PEP依赖基因的转录活
性下降(Yu et al., 2009)。同时白化期间rpoA、rpoB
和rpoC2三个基因上5个编辑位点的编辑效率明显改
变(图5)也会导致PEP的合成及组装受到影响, 但这
种影响是增强还是减弱PEP的活性, 还有待于从转录
活性以及蛋白质水平进行深入研究。此外, 我们的研
究也发现, 依赖于PEP的psbA与NEP和PEP共同依
赖的clpP在复绿和返白期转录水平没有明显的改变,
可能是因为psbA和clpP的转录机制中还存在其它影
响因素(Chi et al., 2010), 还有待于进一步的研究。
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RNA Editing Sites in Chloroplast Protein-coding Genes in Leaf
White Mutant of Triticum aestivum
Likun Deng, Yan Li, Jianing Yu*
College of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China
Abstract RNA editing is a post-transcriptional process and mainly occurs in higher plant organelles. Lacking RNA edi-
ting in some plants can cause albino or yellow leaves. We investigated RNA editing in 14 protein-coding genes from the
chloroplast genome of Triticum aestivum Aibian 1 and the wheat leaf-stage albino mutant FA85. We found 26 editing sites
in these genes. The two plants significantly differed in editing efficiency of 5 partial editing events. The 5 sites include the
phosphoenylpyruvate (PEP) genes rpoC2, rpoA and rpoB, and 3 of them are predicted to change the secondary protein
structure. We further analyzed the transcriptional pattern of chloroplast genes that depend on PEP, on nuclear export
protein (NEP) and on both PEP and NEP. The mRNA levels of chloroplast genes, except for psbA and clpP, were lower in
the mutant than wild-type leaves. The wheat leaf-stage albino phenotype may be attributed to a decrease in efficiency of
the 5 editing sites and alteration of transcript level of some chloroplast genes.
Key words chloroplast, leaf white mutant, RNA editing, Triticum aestivum
Deng LK, Li Y, Yu JN (2012). RNA editing sites in chloroplast protein-coding genes in leaf white mutant of Triticum aes-
tivum. Chin Bull Bot 47, 581–593.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: jianingyucn@yahoo.com.cn
(责任编辑: 白羽红)