全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (2): 223-229, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.02.012
收稿日期: 2008-08-14; 接受日期: 2008-11-11
基金项目: 国家林业局林业科技支撑计划(No.2006BAD01A1603)和黑龙江省林业厅“绒毛白蜡引种及杂交育种技术研究”课题
* 通讯作者。E-mail: yaguangzhan@126.com
.技术方法.
基于响应面法的白蜡属花粉离体萌发培养基优化
李淑娟, 詹亚光*, 杨传平, 徐云刚
东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
摘要 基于Box-Behnken设计(Box-Behnken design, BBD)的响应面法, 对绒毛白蜡(Fraxinus velutina)、新疆小叶白蜡
(F. sogdiana)和美国白蜡(F. americana)3个树种花粉的离体萌发培养基成分进行了研究。以花粉萌发率为响应指标, 建立
了3种培养基成分(蔗糖、CaCl2和H3BO3)与花粉萌发率间的响应关系模型。在此基础上, 通过无约束优化设计得到了3个树种
花粉的最佳萌发条件。 结果表明, 蔗糖是影响花粉萌发的最主要因素, 当蔗糖浓度一定时, CaCl2和H3BO3之间交互作用明显。
同时还对响应面建模优化后得到的最佳萌发培养基进行了验证, 结果表明: 上述3种花粉的实际萌发率依次为58.33%、69.71%
和59.42%, 均与优化得到的理论响应值相吻合, 同时也验证了基于BBD响应面模型进行花粉离体萌发条件优化方法的有效性。
关键词 白蜡, Box-Behnken设计, 培养基优化, 花粉萌发, 响应面法
李淑娟, 詹亚光, 杨传平, 徐云刚 (2009). 基于响应面法的白蜡属花粉离体萌发培养基优化. 植物学报 44, 223-229.
白蜡属(Fraxinus)植物全世界约有70余种, 广泛分
布于北半球。我国白蜡属植物约20余种(李延生,1990),
其中有水曲柳(F. mandshurica)、绒毛白蜡(F. velu-
tina)、新疆小叶白蜡(F. sogdiana)及美国白蜡(F.ame-
ricana)等多种重要的阔叶用材树种, 具有很高的经济价
值。白蜡属植物雌雄异株, 进行白蜡属种间杂交时, 由
于花期不遇和地域隔离, 需要对花粉进行贮藏和运输, 使
用前还需对花粉活力进行测定。花粉离体萌发是测定
花粉活力的有效方法之一, 探索白蜡属花粉离体萌发的
最佳条件, 可为花粉活力测定提供有效的方法, 也可为优
良亲本的选择提供科学依据。花粉离体萌发的基本条
件除了一定的温度和 pH值外, 还必须有碳源、硼及矿
质元素(如外源Ca2+)等参与(Zhang et al., 2003)。为
此, 优化培养基中蔗糖、CaCl2和H3BO3的浓度配比可
有效提高花粉的萌发率。
响应面法(response surface methodology ,
RSM)是一种解决多变量问题的统计实验设计方法,
在食品、发酵工程等领域有着广泛的应用(郑丽雪等,
2008; 张静和童群义, 2008)。随着计算机技术的发
展 , 该方法已经成为精度高且应用广的优化技术。
其中Box-Behnken实验设计(Box-Behnken des ign,
BBD)是一种三水平的部分因子设计, 其最大优点是
以连续型重要影响因素的响应过程和结果作为研究
对象, 寻求均值的最优解(Annadurai , 2000)。本研
究在正交实验的基础上, 应用响应面法对绒毛白蜡、
新疆小叶白蜡和美国白蜡3个树种花粉的离体萌发关
键培养基成分进行了实验设计、分析与优化 , 以期
探明花粉萌发培养基中各主要成分的最佳浓度范围
和作用效果。
1 材料与方法
1.1 材料
绒毛白蜡(Frax inus ve lu tina Torr.)花粉采自天津;
新疆小叶白蜡(F. sogdiana B.)和美国白蜡(F.am-
erica na L. )花粉采自新疆。取材方法: 取花枝在室
温下水培 , 散粉后收集花粉, 晾干后密封,-20°C
保存。
224 植物学报 44(2) 2009
1.2 方法
1.2.1 实验设计
根据预实验的结果, 在pH 5.5、培养温度25°C的条件
下, 重点研究蔗糖、CaCl2和H3BO33个因素对花粉萌
发率的影响。先用L16(43)正交实验确定每种花粉培养
基各成分的浓度范围, 在此基础上, 对有效浓度再进行3
个梯度的划分并用于建模。按照Box-Behnken设计的
法则, 分别对3种白蜡属植物的花粉进行三因素三水平
的实验设计, 以获得有效花粉萌发的极值浓度。实验设
计方法见表 1 和表 2。
1.2.2 实验方法
液体培养基成分及浓度按照表2的设计进行, 3个树种花
粉的离体萌发均采用悬滴培养法(胡适宜, 1993)。于
25°C暗培养8-12小时, 以花粉管长度超过花粉直径为
准, 统计花粉的萌发率(花粉萌发率=已萌发花粉数/花
粉总数×100%)。以花粉萌发率的均值作为后续建模和
优化的依据。
1.2.3 建模、优化与验证
用Matlab数学工具软件对表2的结果进行建模和方差分
析。采用该软件中的极小化约束优化函数fmincon对所
建立的3个响应面模型进行优化, 用优化后的培养条件
对上述3种花粉进行离体萌发验证, 将实际萌发结果与
正交实验和响应面法优化所得的理论值进行比较。
2 结果与讨论
2.1 模型建立与分析
基于BBD的实验设计及结果见表2。采用最小二乘法,
以花粉萌发率为响应值 Y, 对表 2中自变量 A、B和C
进行二次多项回归拟合, 分别得到3个树种的响应面模
型(表 3)。
对 3个树种的二次近似响应面模型进行方差分析
表 1 实验因素和水平设置(按Box-Behnken设计法则)
Table 1 Factors and corresponding levels for Box-Behnken
design
Code Factors Level
-1 0 +1
A Sucrose (g·L-1) 100 150 200
B CaCl2 (mg·L-1) 10 20 30
C H3BO3 (mg·L-1) 20 30 40
表 2 实验设计与结果(按Box-Behnken设计法则)
Table 2 Design runs and results for Box-Behnken design
Runs Variable Response value Y (germination rate)(%)
Sucrose (A) CaCl2 (B) H3BO3 (C) Fraxinus velutina (Y1) F. sogdiana (Y2) F. americana (Y3)
1 -1 -1 0 21.34 31.34 20.33
2 +1 -1 0 39.75 30.26 39.75
3 -1 +1 0 12.61 24.32 32.61
4 +1 +1 0 13.50 18.53 13.52
5 -1 0 -1 30.75 30.75 30.75
6 +1 0 -1 42.12 42.12 42.12
7 -1 0 +1 11.45 21.45 21.45
8 +1 0 +1 11.68 21.68 21.68
9 0 -1 -1 54.01 76.38 54.01
10 0 +1 -1 59.65 58.65 59.65
11 0 -1 +1 50.88 54.43 50.88
12 0 +1 +1 40.76 56.76 40.76
13 0 0 0 61.05 48.92 51.05
14 0 0 0 52.38 48.33 48.38
15 0 0 0 49.92 49.23 49.92
225李淑娟等: 基于响应面法的白蜡属花粉离体萌发培养基优化
(表4)。结果表明, 3个回归模型的F值均大于F0.05(9, 5)
(4.77), 表明3个模型均显著; 不良拟合均小于F0.05(3, 2)
(19.16), 表明3个模型的残差均不显著; 3个模型的复相
关系数分别达到 92.8%、96.0%和 95.1%。说明3个
模型的拟合程度良好, 实验误差小, 从统计学上是可行
的, 可进行下一步的优化研究。
2.2 花粉萌发影响因素交互作用分析
采用Matlab软件分别绘制3个树种的响应面图(图1-
3)。从图中可以直观地看出各因素的作用及其交互作
用对响应值的影响趋势。
由图1A和图1B可知, 蔗糖浓度在100-200 g·L-1
范围内, 随着蔗糖浓度的增加, 绒毛白蜡花粉的萌发率均
表现为低-高-低的变化趋势, 而且这种趋势不随CaCl2
和H3BO3浓度的变化而改变, 可见3个因素中蔗糖对花
粉萌发的作用最显著。当蔗糖浓度一定时, CaCl2和
H3BO3浓度的变化对萌发率均无明显影响, 说明蔗糖与
CaCl2及蔗糖与H3BO3之间的交互作用均不明显。然
而由图 1C发现, 在所选蔗糖浓度范围内, CaCl2与
H3BO3之间存在明显的交互作用, 表现为互补效应, 当
二者浓度都高或都低时, 花粉萌发率较低; 反之, 当二者
浓度一高一低时, 花粉萌发率较高; 当二者的中间浓度交
互作用时萌发率处于较高水平。
对新疆小叶白蜡花粉来说, 图2A和图2B表现的趋
势与图 1A和图 1B相似, 蔗糖的作用最显著, 蔗糖与
CaCl2及蔗糖与H3BO3之间的交互作用不明显。此外,
由图2C发现, 在所选蔗糖浓度范围内, 对于新疆小叶白
蜡, CaCl2与H3BO3之间的交互作用趋势与绒毛白蜡不
表 3 3个树种的响应面模型
Table 3 Response surface models for three species
Species Response surface models
Fraxinus velutina Y1= 54.450 0-10.590 0A-0.340 0B+0.890 0C-29.987 5AA-2.662 5BB-0.462 5CC-4.380 0AB-2.785 0AC-
3.940 0BC
F. sogdiana Y2= 51.26-6.061 2A-3.838 7B-0.475 0C-28.851 3AA+3.703 7BB+6.591 2CC-1.177 5AB-2.785 0AC+
5.015 0BC
F. americana Y3= 49.116 7-5.461 2A-2.711 2B+0.890 0C-22.444 6AA-0.119 6BB+2.327 9CC-9.627 5AB-2.785 0AC-
3.940 0BC
表 4 响应面模型的方差分析
Table 4 Analysis of variance for response surface models
Source DF Sum of squares Mean square F value R2
Regression of model Y1 9 4 408.13 489.79 7.174* R2=92.8%
Residual 5 341.34 68.27
Lack of fit 3 272.97 90.99 2.662
Pure error 2 68.37 34.18
Total 14 4 749.47
Regression of model Y2 9 4 017.18 446.35 13.344* R2=96.0%
Residual 5 167.25 33.45
Lack of fit 3 142.22 47.41 3.787
Pure error 2 25.03 12.52
Total 14 4 184.43
Regression of model Y3 9 2 695.19 299.466 10.703* R2=95.1%
Residual 5 139.90 27.980
Lack of fit 3 125.93 41.976 6.009
Pure error 2 13.97 6.986
Total 14 2 835.09
F0.05(9, 5)=4.77; F0.05(3, 2)=19.16; * P<0.05
226 植物学报 44(2) 2009
同, 表现为另一种互作效应。当二者浓度都低或都高
时, 花粉萌发率较高; 反之, 当二者浓度一高一低时, 花
粉萌发率较低; 当二者的中间浓度交互作用时萌发率处
于较低水平。
对于美国白蜡花粉, 图3A所示结果与图1A和图2A
有所不同, 蔗糖与CaCl2之间存在一定交互作用。当蔗
糖浓度较低时(100 g·L-1), 随着CaCl2浓度的增加, 萌发
率有缓慢增高的趋势; 当蔗糖浓度较高(200 g·L-1)时, 随
着CaCl2浓度的增加, 萌发率的变化却呈负相关。图3B
的趋势与图 1B和图2B相似。此外, 由图 3C发现, 在
所选蔗糖浓度范围内, H3BO3与CaCl2之间的交互作用
表现为类似图1C的互补效应, 所不同的是, 当二者的中
间浓度交互作用时萌发率处于较低水平。
2.3 模型优化、验证与比较
通过对上述响应面模型进行优化, 分别得到3个树种的
最佳培养基组合及萌发率的理论值(表5)。响应面法不
仅可以建立连续变量的响应面模型, 确定最佳水平范围,
图1 绒毛白蜡响应面
Figure 1 Response surfaces for Fraxinus velutina
图 2 新疆小叶白蜡响应面
Figure 2 Response surfaces for Fraxinus sogdiana
227李淑娟等: 基于响应面法的白蜡属花粉离体萌发培养基优化
而且所需的实验组数相对较少, 节省人力物力, 因此被广
泛应用于食品微生物发酵培养基的优化研究中(Hujanen
et al., 2001; Lai et al., 2003)。该方法可以弥补正
交实验的不足, 从而得到更精细且更有效的实验因素
范围。
通过比较正交实验、RSM优化理论值和验证实验
(表6)可知, 正交实验虽然能够确定培养基各成分的基本
浓度范围, 但确定的显著性因素较少(只有蔗糖), 各因素
间的交互作用没有显示。优化后的响应面模型除了能
够更精确地显示各因素的极值浓度和单因素的作用外,
还能明确显示各因素间的交互作用。验证实验表明, 上
述3种花粉的实际萌发率依次为58.33%、69.71%和
59.42%, 均与本文优化得到的理论响应值相吻合, 其中
绒毛白蜡花粉的萌发率比正交实验提高了10.39%。说
明本文基于BBD响应面模型进行花粉离体萌发培养基
优化的方法是有效的。
综合分析表明, 蔗糖是影响花粉萌发的最主要因素,
CaCl2和H3BO3的单独作用不明显, 二者对花粉萌发的
作用是通过交互作用实现的。在所选蔗糖浓度范围内,
二者间的交互作用明显, 且在白蜡属3个树种中表现为
不同形式的交互作用。花粉萌发培养基中的3个因素对
3种白蜡花粉的影响不完全相同, 说明对同属内不同种间
的花粉进行离体培养时, 培养条件应有所区别才能获得
最佳的萌发效果。
本文尝试将基于BBD的响应面法应用于木本植物
花粉离体萌发培养基优化的研究。在正交实验的基础
上, 建立了 3种培养基成分(蔗糖、CaCl2和H3BO3)与
花粉萌发率之间的响应关系模型, 达到显著性水平。在
此基础上, 通过无约束优化设计得到了花粉萌发培养基
的理论响应值, 验证实验得到了与优化后的理论响应值
相吻合的结果。与正交实验相比, 花粉萌发率有较大提
高, 说明该方法是有效和可行的。此外, 以往花粉离体
图3 美国白蜡响应面
Figure 3 Response surfaces for Fraxinus americana
表 5 响应面模型优化结果
Table 5 Optimized results for response surface models
Species Encoding variables Decoding variables Response value (%)
Fraxinus velutina [A,B,C]=[-0.174 8, -0.66, 1.00] [A,B,C]=[141.26, 13.4, 40.0] 57.46
F. sogdiana [A,B,C]=[-0.036 4, -1.00, -1.00] [A,B,C]=[148.18, 10.0, 20.0] 70.92
F. americana [A,B,C]=[0.030 8, -1.00, 1.00] [A,B,C]=[151.54, 10.0, 40.0] 58.89
A: Sucrose; B: CaCl2; C: H3BO3
228 植物学报 44(2) 2009
萌发研究只是从培养基层面提出花粉培养的条件, 缺少
对必需的营养成分及其交互作用进行单独细致的研究,
花粉萌发的营养机制并未完全弄清。本文通过优化的
响应面法, 除了得到影响白蜡属3树种花粉离体萌发
培养的各因素的极值浓度外, 还确定了各因素间的交
互作用。这一研究结果有助于进一步阐明花粉萌发
机制, 也是该方法应用于花粉萌发研究的一个优势所
在。因此, 该方法在花粉萌发的培养基设计和选择优
化方面可以发挥重要作用, 对其它相近的培养条件优
化研究也有一定的指导意义。
参考文献
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表 6 3树种花粉萌发实验结果对比
Table 6 Comparison of the results of pollen germination experiments for three species
Species Methods Combination of culture mediums Influential factors Germination rate (%)
Fraxinus velutina Orthogonal array A: 150.0 B: 30.0 C: 40.0 A* 47.94
Optimum by BBD-based RSM A: 141.3 B: 13.4 C: 40.0 A*, BC* 57.46
Test experiment A: 141.3 B: 13.4 C: 40.0 A*, BC* 58.33
F. sogdiana Orthogonal array A: 150.0 B: 10.0 C: 20.0 A* 66.74
Optimum by BBD-based RSM A: 148.2 B: 10.0 C: 20.0 A*, BC* 70.92
Test experiment A: 148.2 B: 10.0 C: 20.0 A*, BC* 69.71
F. americana Orthogonal array A: 150.0 B: 10.0 C: 40.0 A* 58.26
Optimum by BBD-based RSM A: 151.5 B: 10.0 C: 40.0 A*, AB*,BC* 58.89
Test experiment A: 151.5 B: 10.0 C: 40.0 A*, AB*,BC* 59.42
A: Sucrose (g.L-1); B: CaCl2 (mg.L-1); C: H3BO3 (mg.L-1); * P＜0.05
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229李淑娟等: 基于响应面法的白蜡属花粉离体萌发培养基优化
Response Surface Methodology to Determine the Optimal Medium
for Pollen Germination for Ash
Shujuan Li, Yaguang Zhan*, Chuanping Yang, Yungang Xu
Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology of Ministry of Education, Northeast Forestry University,
Harbin 150040, China
Abstract We studied the pollen germination for three species of ash, Fraxinus velutina, F. sogdiana and F. americana.
Response surface methodology (RSM) based on the Box-Behnken design (BBD) was used to construct a response surface model
between the pollen germination rate and three ingredients of sucrose, CaCl2 and H3BO3 for the culture medium. A non-constraint
optimal design was adopted to obtain the optimal conditions of pollen germination for the three species on the basis of the obtained
response surface model. The analysis of the model indicated that sucrose was the main influential factor for pollen germination.
When the concentration of sucrose was at a certain threshold, the interaction between CaCl2 and H3BO3 could be identified. The
model was confirmed with pollen germination experiments corresponding to the three optimal media. The experimental results
showed pollen germination rates of 58.33%, 69.71% and 59.42%, respectively. These proportions match theoretical response
values well. They can also verify the effectiveness of the BBD-based response surface model and analysis technique in obtaining
optimal concentrations of the culture medium components for pollen germination.
Key words ash, Box-Behnken design, culture medium optimization, pollen germination, response surface methodology
Li SJ, Zhan YG, Yang CP, Xu YG (2009). Response surface methodology to determine the optimal medium for pollen germination for
ash. Chin Bull Bot 44, 223-229.
* Author for correspondence. E-mail: yaguangzhan@126.com
(责任编辑: 白羽红)
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活动名称 主要内容 时间 规模(人) 地点 联系人 联系方式
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和植物药学术研讨会 行交流和研讨。同时召开新一届专业委
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研讨会 包括细胞与发育调控、代谢生物学、胁
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活体动态标记与成像 会议主要议题：绿色荧光蛋白及其活体 9月 120－ 150 北京 林金星 linjx@ibcas.ac.cn
技术及其在生物学研 标记技术；量子点标记技术；激光共
究中的应用研讨会 聚焦显微镜的应用；全内发射荧光显微
镜的应用。
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2009年植物进化生物 就近期该领域的研究进展和今后的发展 待定 100 待定 汪小全 xiaoq_wang@ibcas.ac.cn
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