全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2012, 47 (5): 462–473, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2012.00462
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收稿日期: 2012-04-06; 接受日期: 2012-07-10
基金项目: 国家自然科学基金(No.30830086)和国家基础研究发展计划(No.2009CB119100)
* 通讯作者。E-mail: lwqi@caf.ac.cn
落叶松体胚发育中5个miRNA前体与成熟体的表达
张俊红1, 2, 张守攻1, 吴涛1, 韩素英3, 杨文华1, 齐力旺1*
1中国林业科学研究院林业研究所细胞生物学实验室, 北京 100091; 2浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地,
临安 311300; 3中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所, 北京 100091
摘要 利用同源比对或RACE克隆了5个落叶松(Larix leptolepis) miRNA前体。结果显示, 在各物种miRNA前体间, 成熟序
列高度相似, 但其它序列相似度差异大, 序列相似度与亲缘关系有关。采用qRT-PCR分析了5个miRNA、前体和靶基因在
落叶松体胚8个发育阶段的表达变化。结果显示, miRNA表达最高峰出现在后期子叶胚, 暗示与促进胚胎休眠有关; 表达次
高峰出现时期不同, 表现为miR397和miR408在PEMIII, miR398在早期单胚, miR156和miR166在早期子叶胚, 表明其与保
持薄细胞壁、质子传递、顶端分生组织形成等调控有关。miRNA成熟体表达与前体含量不呈线性相关, 可能受多重调控。
研究结果对于阐明MIR基因进化、表达调控及在体胚发育中的调控功能具有重要理论意义。
关键词 表达分析, 落叶松, miRNA成熟体, miRNA前体, 体细胞胚胎发生
张俊红, 张守攻, 吴涛, 韩素英, 杨文华, 齐力旺 (2012). 落叶松体胚发育中5个miRNA前体与成熟体的表达. 植物学报
47, 462–473.
落叶松(Larix ssp.)是重要的针叶树种, 其体细胞
胚胎发生途径不仅是重要的无性繁殖手段, 也为松杉
类树种的胚胎发生机理研究提供了理想的实验体系。
体细胞胚胎发生过程与合子胚发育高度相似
(Pullman et al., 2003), 二者发生同步化使其能收集
特定发育阶段的大量材料, 可作为研究植物胚胎发育
的模式系统。体胚发生过程是个复杂的生物学事件,
涉及一系列信号转导过程和基因表达(Chugh and
Khurana, 2002)。虽已分离出许多相关基因(Bray-
brook et al., 2006; Park and Harada, 2008), 但从体
细胞诱导成胚性细胞、胚性的维持、再由胚性细胞发
育成体细胞胚胎过程中的很多机制还不清楚, 仍不足
以阐明胚胎发生机理和解决生产问题。研究表明 ,
microRNA作为上层调控因子在胚胎发生过程中起重
要调控作用(Carrington and Ambros, 2003; Fletcher
et al., 2006)。
microRNA(miRNA)通过碱基互补原则切割靶基
因mRNA、抑制翻译、介导DNA甲基化等实现调控功
能(Bartel, 2004)。植物MIR基因经RNA聚合酶II转录
产生初级miRNA前体(pri-miRNA)。DCL1切割产生
miRNA前体 (pre-miRNA), 再次切割形成miRNA:
miRNA*二聚体, HEN1甲基化修饰3′端碱基, HASTY
转运二聚体出细胞核, miRNA成熟体进入AGO沉默
复合体发挥调控作用(Llave et al., 2002; Reinhart et
al., 2002)。miRNA的产生和作用过程中每个环节都
受到调控。86%的MIR基因转录起始上游存在TATA
box, 表明MIR基因受到转录水平上的调控(Xie et al.,
2005)。滞留于转录点的pri-miRNA比多腺苷酸化的
pri-miRNA被更有效地加工成pre-miRNAs(Pawlicki
and Steitz, 2008)。RNA二级结构影响miRNA前体加
工(Song et al., 2010)。miRNA前体的RNA编辑调控
miRNA成熟体的产生和功能(Luciano et al., 2004)。
此外, 成熟miRNA降解速率与靶基因丰度、互补性以
及miRNA的3′端修饰有关(Chatterjee and Grossh-
ans, 2009; Ameres et al., 2010; Arvey et al., 2010;
Baccarini et al., 2011)。
miRNA是胚胎正常发生和顶端分生组织形成所
必需的 (Schauer et al., 2002; Bartel, 2004) 。
miR172、miR164和miR166通过调控靶基因AP2、
CUCs、PHV和PHB直接或间接控制顶端分生组织形
成、分化和胚胎发生(Vernoux and Benfey, 2005;
Williams et al., 2005)。水稻(Oryza sativa)分生组织
·研究报告·
张俊红等: 落叶松体胚发育中 5 个 miRNA 前体与成熟体的表达 463
分化前后, miR156、miR319和miR397表达差异显著
(Luo et al., 2006)。甜橙(Citrus sinensis)体胚发生过
程中, miR156、miR168和miR171在诱导时期起作用;
miR159、miR164、miR390和miR397影响球形胚形
成; miR166、miR167和miR398参与子叶胚发生(Wu
et al., 2011)。植物miRNA通过抑制分化促进转录因
子的过早表达, 调控胚胎发育时序, 如miR156通过
作用于SPL10和SPL11调控胚胎正常发育 (Nodine
and Bartel, 2010; Willmann et al., 2011)。miRNA除
了调控转录因子, 也直接作用于某些功能蛋白质, 如
miR397调节Laccase含量(Sunkar and Zhu, 2004),
参与细胞壁加厚与木质化(Luo et al., 2006); miR398
靶向作用于 CSDs (Jones-Rhoades and Bartel,
2004)和Cytochrome coxidase (Sunkar et al., 2006),
调节铜动态平衡和应激干旱胁迫(Trindade et al.,
2010); miR408的靶基因Laccase(Schwab et al.,
2005)和Plantacyanin(Sunkar and Zhu, 2004)调控细
胞壁增厚、光合系统间质子传递和应激干旱胁迫等
(Trindade et al., 2010)。然而, miRNA在植物胚胎发
育中的研究多集中于被子植物, 有关裸子植物尤其是
针叶树报道较少。据报道, 火炬松(Pinus taeda)中雌
配子体miR166和胚胎AGO9在胚胎成熟时为表达最
高峰(Oh et al., 2008); 落叶松(Larix leptolepis) miR-
171在胚性细胞期显著上调表达, miR159、miR169和
miR172则显著下调, 暗示miRNA参与细胞胚性维持或
胚性向非胚性转变过程(Zhang et al., 2010)。为进一步
挖掘落叶松miRNA信息, 本课题组应用Solexa测定体
细胞胚胎小RNA文库, 鉴定了35个家族83个保守mi-
RNAs, 并发现了16个新miRNAs(Zhang et al., 2012)。
miRNA表达分析多集中在miRNA成熟体, 前体
表达分析较少(Qin et al., 2011)。Qin等(2011)监测了
胡杨(Populus euphratica)17个miRNA成熟体和14个
前体在脱水和高盐胁迫下的表达响应。获得miRNA
前体是表达分析的先决条件, 虽已有多种miRNA前
体搜寻软件或方法(Huang et al., 2007), 但对于无基
因组信息的裸子植物及一些EST信息匮乏的物种, 其
miRNA前体序列的获得存在障碍。
本研究以落叶松miR156、miR166、miR397、
miR398和miR408为研究对象, 通过克隆或比对获得
了这5个miRNA前体并进行保守性分析; 然后预测靶
基因并注释功能; 进而运用qRT-PCR分析miRNA成熟
体、前体和靶基因在落叶松体细胞胚胎的8个发育阶段
的表达变化, 以期揭示miRNA表达、miRNA前体加工
调控、miRNA与靶基因互作规律, 并为阐明miRNA在
体细胞胚胎发生过程中的调控功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
以日本落叶松 (Larix leptolepis (Sieb. et Zucc.)
Gord.)体胚发生稳定的638＃细胞系为研究材料, 根据
形态解剖学特征划分为8个发育阶段, 依次为原胚团
I(PEMI, 继代培养2天)、原胚团III(PEMIII, 继代培养
15天)、早期单胚(成熟培养2天)、中期单胚(成熟培养
6天)、后期单胚(成熟培养15天)、早期子叶胚(成熟培
养24天)、中期子叶胚(成熟培养29天)和后期子叶胚
(成熟培养39天 )。实验材料用液氮速冻并保存于
–70°C冰箱。
1.2 实验方法
1.2.1 miRNA及其前体获得
miRNA成熟序列从前期落叶松小RNA文库高通量测
序结果中获得。序列如下: lle-miR156, UGACAGAA-
GAGAGUGGGCAC; lle-miR166, UCGGACCAGG-
CUUCAUUCCCC; lle-miR397, CAUUGAGUGCAG-
CGUUGACGA; lle-miR398, CGUGUUCCCAGGU-
CGCCCCAG; lle-miR408, UGCACUGCCUCUUC-
CCUGGCU。miRNA前体序列获得方式包括 : (1)
miRNA成熟序列比对落叶松ESTs、二级结构分析、
与miRBase中前体序列同源性分析 ; (2) 未比对上
EST的miRNA, 前体序列通过RACE技术克隆获得。

1.2.2 miRNA靶基因预测
5个miRNA序列与落叶松ESTs上传至psRNATarget
网页(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)。选择
功能3和默认参数, 进行miRNA靶基因预测(Dai and
Zhao, 2011), 并在Uniprot注释其功能(http://www.
uniprot.org/)。

1.2.3 miRNA前体序列的克隆
用总RNA纯化试剂盒(NORGEN biotek corporation,
加拿大)提取落叶松体细胞胚胎8个发育阶段材料总
464 植物学报 47(5) 2012
RNA, 操作过程参照说明书。用ND-1000和1%琼脂
糖凝胶电泳检测RNA浓度和质量。将总RNA等量混
合, 用Oligotex mRNA Kit (Qiagen, 德国)富集Poly
(A)+mRNA, 用SMARTer RACE cDNA Amplification
Kit (Clontech, 美国)合成5′/3′-RACE cDNA, 具体操
作步骤参照说明书。将cDNA稀释20倍后, 用Hot start
EX Taq polymerase(宝生物, 大连)进行PCR反应, 将
扩增产物连接到pEASY-T3克隆载体(全式金, 北京),
转化Trans1-T1感受态细胞(全式金, 北京)。37°C过夜
培养, 挑取单克隆摇菌, 进行PCR验证并测序。

1.2.4 miRNA前体的qRT-PCR定量分析
用总RNA纯化试剂盒提取总RNA, RQ1 RNase-Free
Dnase (Promega, 上海 )去除基因组DNA, Revert
Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas,
EU)反转录, cDNA稀释5倍用于定量分析。应用引物
设计软件Primer Premier 5.0设计定量引物, 分别为:
pre-miR156F, 5′-GTGGGCACACATAACCCCTAA-
C-3′; pre-miR156R, 5′-GAAAGAGACGTGAGCAC-
GCAT-3′; pre-miR166F, 5′-GGTGTTTTTGGGGCC-
GATAAA-3′; pre-miR166R, 5′-GAATGAAGCCTG-
GTCCGACG-3′; pre-miR397F, 5′-CGTTGACGAT-
AAACAAATCCTCC-3′; pre-miR397R, 5′-CATGGC-
ACTCCACAGAGATAGAT-3′; pre-miR398F, 5′-AC-
ACATTCCATTCACAGTGTCGTG-3′; pre-miR398R,
5′-GTCCACATTCTCATCTGCGTCA-3′; pre-miR-
408F, 5′-GGATGAGTTAGGGCATGGGAG-3′; pre-
miR408R, 5′-TGAGAATGGCAGAAGCAGACG-3′。
应用SYBR Premix EX Taq Kit (宝生物, 大连)在ABI-
7500 定量仪器(美国)上进行RNA前体的定量分析,
具体反应体系和步骤参照说明书。PCR反应结束后,
用熔解曲线和2%琼脂糖凝胶电泳验证产物特异性。
每个样品设3次重复。在前期的筛选与分析后, 选择
EF-1 为 内 参 基 因 (EF-1F, 5′-TACTGCACTGTG-
ATTGATGCC-3′; EF-1R, 5′-CATCCATCTTGTTAC-
AGCAGC-3′)(Schwarzerová et al., 2010)。

1.2.5 miRNA成熟体的qRT-PCR定量分析
用Small RNA Isolation Kit(百泰克, 北京)提取落叶松
体胚发生过程中8个发育阶段材料的小RNA, 用ND-

1000和15%变性PAGE胶检测小RNA的浓度和质量。
用NCode VILO miRNA cDNA Synthesis Kit (Invi-
trogen, 美国)将小RNA加A反转录成cDNA, 稀释20
倍后用于miRNA定量分析。反向引物为试剂盒中的通
用定量引物(Invitrogen)。正向引物分别为: miR156F,
5′-GATGACAGAAGAGAGTGGGCACA-3′; miR166F,
5′-GACCAGGCTTCATTCCCCAA-3′; miR397F, 5′-
ATTGAGTGCAGCGTTGACGAA-3′; miR398F, 5′-
TGTTCCCAGGTCGCCCCAGAA-3′; miR408F, 5′-
CACTGCCTCTTCCCTGGCTAA-3′。定量分析所用
试剂和步骤同1.2.4节所述。在前期的筛选与分析后,
选择5.8S rRNA为内参基因, 正向引物为5′-GTCTG-
TCTGGGCGTCGCATAA-3′。

1.2.6 miRNA靶基因的qRT-PCR定量分析
RNA提取、DNA去除及反转录等参照1.2.4节。应用
引物设计软件Primer Premier 5.0设计定量引物, 分
别为: QTmiR156F, 5′-CTGAAGGGGACTTAGCAA-
CTGG-3′; QTmiR156R, 5′-CCCAACTACCCTCTG-
GCACTC-3′; QTmiR166F, 5′-CAGAGGAGACTTT-
GACGCAG-3′; QTmiR166R, 5′-CAGAACATCCAA-
GCACCGACA-3′; QTmiR397F, 5′-GCTGTAAAAC-
AAGGAGAAACG-3′; QTmiR397R, 5′-GTCTTGTA-
TGGTTTGGTGTAGCA-3′; QTmiR398F, 5′-GGTG-
TTAGGGTTTGGGTTGG-3′; QTmiR398R, 5′-ATG-
GTCCATCCTGAGCTTCC-3′; QTmiR408F, 5′-CA-
GAATAGTGGTGGGGGGAA-3′; QTmiR408R, 5′-T-
GTCGCTACCAGAAGTGAGAGG-3′。定量所用试
剂、步骤和内参基因选择等同1.2.4节所述。

1.2.7 统计学分析
应用SPSS软件进行统计学分析, 包括采用双变量相
关模式分析miR398和miR408成熟体的表达相关性,
miRNA与其靶基因相关性分析。采用回归分析中的曲
线估算分析miRNA成熟体与其前体的表达关系。
2 结果与讨论
2.1 miRNA前体的获得及分析
lle-miR398比对到一条落叶松EST(JR165099), 经
张俊红等: 落叶松体胚发育中 5 个 miRNA 前体与成熟体的表达 465
二级结构分析和与miRBase前体序列同源性分析后,
确认为lle-miR398前体序列。针对其余4个miRNA前
体, 采用RACE技术克隆。经miRNA前体序列分析后
发现, miRNA成熟序列与其互补序列在物种间保守,
但其它序列在物种间相似度不同, 序列相似度与亲缘
关系有关(图1)。例如, miR166成熟序列在落叶松、火
炬松(P. taeda)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)几个
物种中完全相同 , 但 lle-MIR166a中间序列与ath-
MIR166b(拟南芥中相似度最高 )完全不同 , 与pta-
MIR166a相似度很高, 仅5个碱基差异。
2.2 miRNA的靶基因预测
植物miRNA与靶基因高度互补 , 便于预测靶基因
(Jones-Rhoades and Bartel, 2004)。5个miRNA预测
到8个靶基因(表1)。其中miR166靶基因为HD-Zip转
录因子 , 参与顶端分生组织的形成 (McHale and
Koning, 2004); miR397靶基因为3个漆酶基因, 可能
参与次生生长细胞壁的木质化和加厚(Constabel et
al., 2000); miR398靶基因Phytocyanin为植物特异蓝
色铜蛋白, 参与质子传递(Ma et al., 2011); miR408
靶基因Plastocyanin在细胞色素b(6)f和光合系统I间
传递质子(Cruz-Gallardo et al., 2011)。未预测到
miR156靶基因SBP或SPL转录因子, 但预测到一个
未知功能mRNA。
2.3 落叶松体胚发生过程中miRNA的表达
针对这5个miRNA在落叶松体胚发生过程中的表达分
析, 采用qRT-PCR技术比较了8个发育阶段miRNA
的表达丰度。miRNA在体胚发育8个阶段动态表达, 5
个miRNA表达模式不同(图2)。具体表现为: miR156



图1 落叶松和其它植物miRNAs前体序列比对

Figure 1 The sequence alignment of miRNAs hairpin precursors among larch and other plants
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表1 5个落叶松miRNA的靶基因预测
Table 1 Target prediction of five larch miRNA
miRNA Target gene (mismatch) Function annotation Score/Expect
miR156 JR158379 (3.0) GQ04008_M09 mRNA (Picea glauca) 370(410)/4e-99
miR166 JR140760 (1.5) Class III HD-Zip (Picea glauca) 1 532(1 698)/0.0
miR397
JR163822 (2.5)
JR147962 (3.0)
JR160714 (2.0)
Laccase (Pinus radiate)
Laccase (Pinus taeda)
Laccase (Ricinus communis)
241(266)/5e-60
210(534)/7e-63
84.2(92)/8e-13
miR398
JR143920 (3.0)
JR166406 (3.0)
Phytocyanin (Pinus taeda)
60S ribosomal protein (Picea abies)
832(922)/0.0
919(1 018)/0.0
miR408 JR167856 (2.0) Plastocyanin (Oryza sativa) 130(328)/5e-36




图2 5个落叶松miRNA在体胚发生过程中的表达

Figure 2 qRT-PCR-derived expression analysis
of five miRNA at eight stages of larch SE


张俊红等: 落叶松体胚发育中 5 个 miRNA 前体与成熟体的表达 467
丰度在前4个阶段变化不大, 在后期单胚、早期子叶
胚阶段显著持续升高, 在中期子叶胚降低, 但在后期
子叶胚急剧升高至表达最高峰; miR166从PEMI至
PEMIII上调表达, 而早期单胚、中期单胚阶段表达水
平降至PEMI, 但在后期单胚阶段升高, 表达次高峰
出现在早期子叶胚, 在中期子叶胚降低, 并于后期子
叶胚阶段急剧升高至最高峰; miR397表达水平在继
代培养中显著上升, 表达次高峰出现在PEMIII, 单胚
3个阶段逐渐降低, 而在早期子叶胚升高, 于中期子
叶胚降至最低水平 , 但在后期子叶胚显著升高 ;
miR398表达水平在前3个阶段逐渐升高, 表达次高峰
出现在早期单胚阶段, 在中后期单胚降低, 在中期子
叶胚降至最低水平, 但在后期子叶胚急剧升高至最高
值 ; miR408 表 达 模 式 与 miR398 相 似 (r=0.992,
P<0.01), 其表达次高峰在PEMIII, 比miR398略提前。
2.4 落叶松体胚发生过程中miRNA前体的表达
为分析miRNA前体在落叶松体胚发生过程中的表达
模式, 采用qRT-PCR实时监测5个miRNA前体在体
胚8个发育阶段的表达变化。如图3所示, miRNA前体
表达模式不同于miRNA, 其变化幅度小于成熟体。具
体表现为: miR156前体水平在前7个阶段逐渐升高,
表达最高峰在中期单胚, 在后期单胚降低, 但仍保持
较高水平, 呈升-降模式; miR166前体表达次高峰在
PEMIII, 单胚阶段逐渐降低, 早期子叶胚期升高, 中
期子叶胚期降至最低值, 但在后期子叶胚上升至最高
峰, 呈升-降-升-降-升模式; miR397前体表达水平在
PEM保持稳定, 单胚阶段逐渐降低, 最低峰在后期单
胚, 在子叶胚阶段逐渐升高, 最高峰出现在后期子叶
胚, 呈降-升模式; miR398和miR408前体丰度均在前
5个阶段逐渐降低, 最低值出现在后期单胚, 在早期
子叶胚显著升高, 在中期子叶胚略有降低, 并在后期
子叶胚急剧升高至最高峰, 呈降-升模式。
2.5 miRNA成熟体与前体的关系
miR156成熟体和前体表达水平在体胚发育前6个阶
段逐渐升高, miR156前体在中期子叶胚继续升高, 而
成熟体降低, 但在后期子叶胚, 成熟体急剧升高, 前
体降低。miR166成熟体与前体在前4个阶段变化模式
相同, 后期单胚至后期子叶胚, miR166成熟体与前体
仍有相似的表达模式, 但成熟体变化幅度远大于前
体。miR397成熟体和前体在前5个阶段有相同变化模
式, 而在中期子叶胚, 前体升高, 但成熟体降低, 后
期子叶胚阶段, 前体稍微上升, 成熟体急剧升高。
miR398和miR408前体在前5个阶段逐渐降低, 成熟
体表达次高峰分别在早期单胚和PEMIII, 子叶胚阶段
成熟体与前体变化模式相同。
回归分析表明, miRNA成熟体丰度与前体表达量
不呈线性相关。比较各种估计模型的决定系数R2、标
准误和F值, miR166、miR397、miR398和miR408前
体和成熟体表达量拟合程度最好, 为Cubic三次多项
式, 而miR156相对较好, 为Power幂函数, 但未达到
显著水平(表2)。
2.6 落叶松体胚发生过程中miRNA靶基因的表达
为验证预测的靶基因, 我们运用qRT-PCR技术监测
了5个miRNA潜在靶基因在落叶松体胚8个发育阶段
的表达分析。如图4所示, 5个潜在靶基因表达模式不
同。miR156靶基因(一个未知mRNA)表达在前5个阶
段保持相对稳定水平, 在早期子叶胚急剧降低, 后期
子叶胚含量最低。miR166靶基因(HD-Zip)表达模式呈
双峰, 表达最高峰和次高峰分别在早期子叶胚和中期
单胚, 后期单胚阶段表达水平最低。miR397靶基因
(Laccase)表达最高峰在中期单胚, 在中期子叶胚略
有升高, 而在后期子叶胚为最低水平。miR398靶基因
(Phytocyanin)和miR408靶基因(Plastocyanin)表达最
高峰均出现在后期单胚, 但两者表达模式略有不同。
相关性分析表明, 5对miRNA-靶基因mRNA表达
均为负相关。然而, 仅miR156与靶基因间的负相关性
达到显著水平。另外, 在某些发育阶段, 靶基因与
miRNA表达趋势相同, 存在“共表达现象”。例如,
miR156含量与其靶基因水平在中期单胚向后期单胚
过渡时共同升高; miR166与其靶基因在后期单胚向
早期子叶胚发育时共同升高。
2.7 讨论
2.7.1 MIR基因的进化特性
目前公认20个miRNA家族在陆地植物中保守, 其靶
基因亦保守(Jones-Rhoades et al., 2006)。然而, 虽
然miRNA成熟体在植物间高度相似, 但是miRNA前
体中非成熟序列在物种间存在实质性差异, 这与亲缘
关系有关(图1)。例如, miR166或miR408成熟序列在
468 植物学报 47(5) 2012


表2 miRNA成熟体与前体的回归分析
Table 2 Regression analysis of mature and precursor miRNA by curve estimation
miRNA R square Significance Regression equation
miR156 0.312 0.150 y=1.073x1.011
miR166 0.945 0.006 y=–19.899+57.301x–45.137x2+11.211x3
miR397 0.728 0.125 y=–64.841+399.718x–694.13x2+363.192x3
miR398 0.995 0.000 y=1.109+1.142x–2.052x2+0.801x3
miR408 0.984 0.000 y=–0.676+13.849x–29.492x2+17.687x3



图3 5个落叶松miRNA前体在体胚发生过程中的
表达

Figure 3 qRT-PCR-derived expression analysis
of five miRNA precursor at eight stages of larch
SE


张俊红等: 落叶松体胚发育中 5 个 miRNA 前体与成熟体的表达 469


落叶松、火炬松或拟南芥中相同, 但lle-MIR166非成
熟序列与ath-MIR166b(拟南芥中相似度最高)或lle-
MIR408与ath-MIR408不仅有碱基差异, 而且长度也不
同, 发生了插入/缺失突变, 而与pta-MIR166或pta-
MIR408相似度高, 仅几个碱基差异。这种现象不是随
机发生的, 可能是自然选择过程中突变积累并固定的
结果。研究表明, miRNA基因与蛋白质编码基因一样,
受到达尔文正选择影响, 发生快速进化(Chen and
Rajewsky, 2007)。miRNA基因由靶基因反向重复进化
而来(Allen et al., 2004); 也有假设认为与靶基因的协
同作用是miRNA基因进化的主要来源(Li and Mao,
2007)。因此, miRNA基因经长期进化, 成熟序列和
miRNA*承受选择压力而在进化中保持不变, 而其它序
列因受选择压力较小, 在长期进化历程中积累突变。


图4 5个落叶松miRNA靶基因在体胚发生过程中
的表达

Figure 4 qRT-PCR-derived expression analysis
of five miRNA target gene at eight stages of larch
SE

470 植物学报 47(5) 2012
2.7.2 miRNA在体胚发育中的调控功能
Nodine和Bartel(2010)认为植物miRNA通过抑制分化
促进转录因子过早表达, 从而调控胚胎发育时序。
miRNA表达水平在各发育阶段动态变化(Wu et al.,
2011), 对胚胎各个发育阶段miRNA及其靶基因的表达
分析可揭示miRNA在胚胎发育中的调控作用。本研究
结果表明, 5个miRNA及其靶基因在落叶松体胚发生过
程中表达模式不同(图2)。miR156在前4个阶段表达相
对稳定, 而在后期单胚和早期子叶胚急剧升高, 对应
地, 预测的靶基因(未知mRNA)表达呈显著负相关。研
究表明miR156在拟南芥胚胎八细胞时期抑制SPL转录
因子, 阻止应在胚胎成熟时期表达的基因转录物提前
积累, 实现胚胎正常发育(Nodine and Bartel, 2010)。
因此, miR156含量在后期单胚和早期子叶胚急剧升高,
可能抑制落叶松胚胎成熟时期表达基因的过早积累,
调控体胚正常发育时序。miR166丰度在后期单胚上调
表达, 次高峰在早期子叶胚。miR166调控HD-ZIP转录
因子, 控制顶端分生组织形成(Williams et al., 2005),
HD-ZIP表达最高峰在早期子叶胚(与miR166共表达),
而在中期和后期子叶胚降低。因此, 早期子叶胚中
miRNA与其靶基因的共表达可能参与子叶形成时顶端
分生组织的维持。miR397靶基因漆酶可能参与细胞次
生生长细胞壁的木质化和加厚(Constabel et al., 2000;
Luo et al., 2006)。胚性细胞由许多未分化薄壁细胞组
成, miR397在继代培养中上调表达, 而Laccase含量降
低, miR397在单胚阶段逐渐降低, 而靶基因表达最高
峰在中期子叶胚, 此时可能经历了一次细胞壁的加厚,
因此miR397通过调节Laccase进而调控细胞壁厚度。
miR398和miR408靶基因分别为Phytocyanin和Plas-
tocyanin, 同属含铜蛋白, 参与质子传递和干旱胁迫应
激(Trindade et al., 2010)。2个miRNA和其靶基因表达
模式一致(r1=0.992, P1<0.01; r2=0.932, P2=0.001)。
miR398和miR408表达最高峰在后期子叶胚, 次高峰
分别在早期单胚和PEMIII, 而靶基因表达最高峰在后
期单胚, 最低值在后期子叶胚。这2个miRNA在早期单
胚以后的发育阶段表达下调, 为后期单胚的靶基因积
累创造了环境。

2.7.3 落叶松体胚发育中miRNA前体的动态表达及
成熟体的表达
miRNA表达分析集中于miRNA成熟体 , 而有关mi-
RNA前体报道较少(Qin et al., 2011)。在落叶松体细
胞胚胎整个发育过程中进行miRNA前体的表达分析,
同时结合miRNA成熟体的表达变化, 可以揭示体胚
发育中miRNA产生、加工过程的调控。miRNA成熟
体和前体含量回归分析表明, miRNA成熟体丰度与前
体表达量不呈线性相关 , 其中miR166、miR397、
miR398和miR408前体和成熟体表达量拟合程度最
好 , 为Cubic三次多项式 , 而miR156相对较好 , 是
Power幂函数(表2)。miR166成熟体与前体在前4个阶
段表达模式相同, 暗示miR166成熟体含量在此阶段
主要受前体丰度调控, 即MIR基因转录水平的调控;
后期单胚和子叶胚期其表达模式虽相似, 但成熟体变
化幅度远大于前体, 可能与miRNA前体的相对不稳
定有关。已有研究表明, miRNA前体比成熟体更容易
降解(Schmittgen et al., 2008)。miR397成熟体和前
体在前6个阶段表达模式相似, 表明miR397成熟体可
能受MIR基因转录水平调控; miR397在中期子叶胚前
体水平升高 , 但成熟体含量降低 , 说明此阶段mi-
R397成熟体含量可能受加工调控。miR398和miR408
前体在前5个阶段逐渐降低, 而成熟体表达次高峰分
别出现于早期单胚和PEMIII, 说明miRNA成熟体积
累稍晚于前体, 可能受加工过程调控或与miRNA前
体的相对不稳定有关; 在子叶胚3个发育阶段, mi-
RNA成熟体与前体表现相同的变化模式 , 说明
miR398和miR408成熟体在这3阶段的积累可能主要
受前体丰度影响。落叶松早期子叶胚发生前6个阶段,
miR156前体和成熟体表达水平逐渐升高 , 暗示
miR156成熟体丰度主要受MIR基因转录水平的调控;
在中期子叶胚miR156前体含量继续升高, 但成熟体
水平降低, 表明此阶段miR156成熟体丰度可能受加
工过程调控以及DCL1水平降低或miR156成熟体降
解等影响。另外, miRNA成熟体与前体含量的非线性
相关, 多呈Cubic三次多项式, 成熟miRNA丰度变化
远大于前体, 这可能由于保守miRNA呈家族式存在,
成熟体间高度相似或完全相同, 而前体序列不同。因
此一个成熟体miRNA可能由多个前体产生。
本研究分析了落叶松miRNA前体在物种间的保
守性, 但因基因组信息的缺乏和ESTs信息限制, 仍
有许多miRNA前体需要鉴定。miRNA、前体和靶基
因在体胚发育各个阶段呈动态表达 , miR156、
miR166、miR397和miR398/miR408及其靶基因表达
张俊红等: 落叶松体胚发育中 5 个 miRNA 前体与成熟体的表达 471
模式不同, 暗示这些miRNA在体细胞胚胎发生过程
中起不同调控作用。然而, miRNA成熟体丰度与前体
含量并不呈简单线性相关, 表明miRNA成熟体的积
累可能同时受MIR基因转录水平、miRNA前体降解水
平和DCL1加工等多层次调控。
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张俊红等: 落叶松体胚发育中 5 个 miRNA 前体与成熟体的表达 473
Expression Analysis of Five MiRNAs and Their Precursors
During Somatic Embryogenesis in Larch
Junhong Zhang1, 2, Shougong Zhang1, Tao Wu1, Suying Han3, Wenhua Yang1, Liwang Qi1*
1Laboratory of Cell Biology, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China; 2The Nurturing Station
for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang Agricultural and Forestry University, Lin’an 311300, China
3Research Institute of Forest Ecology, Environment and Protection, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China
Abstract We used the homolog search strategy or RACE to obtain 5 precursor microRNAs (miRNAs) of larch, Larix
leptolepis. Mature miRNAs shared high similarity among plant species, and non-mature sequences showed distinct simi-
larity related to genetic relationships. Expression profiles of the 5 precursor and mature miRNAs were examined during 8
developmental stages with quantitative RT-PCR. The expression of precursor and mature miRNAs changed dynamically
during developmental stages, with major peaks in expression for mature miRNAs in late cotyledonous embryos, which
might be associated with promoting embryo dormancy. However, miR397 and miR408 showed minor peaks in expression
at PEMIII, miR398 at the early single embryo stage, and miR156 and miR166 at the early cotyledonous embryo stage,
which might be related to regulation to maintain a thin cell wall, proton transfer between photo systems, and formation of
shoot meristem. However, the expression of mature miRNAs was not linearly associated with that of precursor miRNAs,
which might be regulated at several levels. Our study sheds light on miRNA evolution, expression regulation of mature
miRNAs, and regulation of somatic embryogenesis in larch.
Key words expression analysis, Larix leptolepis, mature miRNA, precursor miRNA, somatic embryogenesis
Zhang JH, Zhang SG, Wu T, Han SY, Yang WH, Qi LW (2012). Expression analysis of five miRNAs and their precursors
during somatic embryogenesis in larch. Chin Bull Bot 47, 462–473.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: lwqi@caf.ac.cn
(责任编辑: 白羽红)