全 文 ：浙江大学学报(农业与生命科学版) 37(4):393～ 398 , 2011
Journal of Zhej iang University(Agric.&L ife Sci.)
文章编号:1008-9209(2011)04-0393-06 DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2011.04.006
收稿日期:2010-09-08
基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(Y3080081);浙江省台州市科技计划资助项目(08XH02).
作者简介:蒋明(1973—),男,浙江嵊州人 ,博士,副教授,从事植物基因组与分子生物学研究.E-mail:jiangming1973@139.com.
紫菜薹花青素合成酶基因 BcANS的克隆 、表达与序列分析
蒋 明1 , 陈孝赏2 , 李金枝1
(1.台州学院生命科学学院 ,浙江 临海 317000;2.台州市农业科学研究院 ,浙江 临海 317000)
摘 要:根据前期在芥蓝中克隆的 Ba ANS 基因序列设计 PCR 引物 , 从紫菜薹(Brassica campestris
var.p urp urea)子叶中克隆到基因组 DNA 和 cDNA 序列 ,基因定名为 B cANS ;序列已提交 NCBI数据
库 ,登录号为 GQ120562;BcA NS 的基因组 DNA 全长为1 637 bp , 具 1 个 560 bp 的内含子 , 编码区全长
为1 077 bp ,编码 358个氨基酸.RT-PCR检测结果表明:BcANS 在光照条件下表达 , 在暗培养植株的子
叶和胚轴中未见表达;缺磷植株的子叶和胚轴在暗培养和光照培养下 BcANS 基因均有表达 , 但光照条
件下的表达量较大.序列比对结果表明:BcANS 与同科的甘蓝 、芥菜和拟南芥的同源性最高 , 而与禾本
科植物的同源性最低 ,在进化树上相距最远.对紫菜薹花青素合成酶基因的克隆和表达分析 , 为进一步
开展基因功能和花青素生物合成机制研究奠定了基础.
关 键 词:紫菜薹;花青素合成酶;基因克隆;表达分析
中图分类号:Q 78 文献标志码:A
JIANG Ming1 , CHEN Xiao-shang 2 , LI Jin-zhi1(1 .College o f Li f e Science , Taiz hou University ,
L inhai , Zhe jiang 317000 , China;2 .Taiz hou Academy o f Agricultural S ciences , L inhai , Zhej iang
317000 , China)
Cloning , expression and sequence analysis of anthocyanidin synthase gene BcANS in Brassica campestris
var.purpurea.Journal of Zhejiang Unive rsity(Agric.& Life Sci.), 2011 , 37(4):393-398
Abstract:PCR prime rs were designed acco rding to Ba ANS gene iso la ted from Brassica albograbra , and
the gene , designated B cANS , w as am plified from co tyledons DNA and cDNA o f B.campestris var.
purpurea , r espectively.The gene sequence was submitted to NCBI with an acce ssion numbe r o f
GQ120562.Genomic DNA was 1 637 bp in leng th w ith one 560 bp intron , and the comple te coding
sequence was 1 077 bp encoding 358 amino acids.RT-PC R results showed that BcA NS expressed in
co tyledons and hypocoty ls under light condition , and there w as no expression under da rk condition.
BcANS expressed under da rk and light conditions in phospho rus-deficient medium.H ow ever , higher
expression lev els in coty ledons and hypocoty ls w ere obser ved unde r light condition.Sequence alignment
results revea led higher homo lo gy betw een BcANS and tho se of B .oleracea , B.juncea and Arabidopsis
thaliana .Low similarity w as obser ved betw een BcANS and those o f G ramineae plants , indicating their
distant ev olutionary r elationships.Isolation , sequence analy sis o f anthocyanidin synthase gene in B.
campestris var.purpurea laid the foundation fo r fur ther study of gene function and anthocyanin
biosynthesis mechanisms.
Key words:Brassica campestris var.purpurea;anthocyanidin synthase;gene cloning;expression analysis
浙江大学学报(农业与生命科学版)
花青素是植物体内广泛存在的水溶性色
素 ,它属于类黄酮物质 ,是一种重要的次生代谢
产物[ 1] .花青素决定花色和果色 ,在吸引昆虫和
动物授粉或传播种子上起着重要作用[ 2] .花青
素是一类重要的抗氧化剂 ,能有效清除体内的
自由基 ,可作为功能性食品的添加剂[ 3] ;花青素
颜色随 pH 值发生变化 ,并且具有较好的稳定
性 ,在食品和饮料行业中常用作天然着色剂[ 4] .
花青素合成酶(anthocyanidin synthase , ANS)
是类黄酮生物合成的重要催化酶 ,位于花色苷
合成通路末端 ,它是酮戊二酸依赖型的双加氧
酶 ,能催化无色花色素转变成花青素[ 5-6] .
目 前 已 经 从 拟 南 芥 (Arabidopsis
thal iana)、芥菜(B rassica juncea)、芥蓝(B.
albog labra)、芜菁(B .campestris ssp.rapa)
和紫罗兰(Matthiola incana)等十字花科植物
中克隆 到了 AN S 基因[ 7-9] , 但在紫 菜薹
(B rassica campestris var.purpurea)中未见报
道.紫菜薹是我国的特产蔬菜 ,又名红菜薹 ,为
十字花科芸薹属植物 ,它色泽红艳 、脆嫩味美 、
营养丰富 ,是深受人们喜爱的蔬菜种类之一.紫
菜薹的菜薹 、叶柄和叶脉均为紫红色 ,含有丰富
的花青素 ,提取物色泽稳定 、无毒 ,可用作食品
和饮料的添加剂[ 10] .本研究以紫菜薹品种胭
脂红为材料 ,克隆花青素合成酶基因 ,并进行
表达分析 ,旨在为开展紫菜薹花青素积累的分
子机制研究奠定基础.
1 材料与方法
1.1 实验材料
本研究所用的紫菜薹品种为胭脂红,选
取 200粒饱满 、健康的种子 ,在超净工作台上用
0.1%的 HgCl2 灭菌 10 min ,经无菌水冲洗 3
次后播种于 MS培养基(+P)和缺少 KH 2PO4
的 MS 培养基(-P)中 , 每瓶 25 粒 , 共 8 瓶 ,
+P和-P 处理各 2瓶用于暗培养 ,其余各瓶每
天光照 16 h ,培养室温度为(25±2)℃.15 d时
采集各培养瓶中的子叶和胚轴 ,放入低温冰箱
备用.TRIzol·试剂购自 Life Technologies 公
司;cDNA 合成试剂盒采用 SMART TM PCR
cDNA Synthesis Ki t ,购自 TaKaRa 公司;PCR
产物回收纯化试剂盒购自 V-gene公司.
1.2 实验方法
1.2.1 基因组 DNA 、RNA 提取和 cDNA 合
成 紫菜薹基因组 DNA 的提取采用 CTAB
法[ 11] ;子叶和胚轴 RNA 的提取采用 T RIzol
法;cDNA 第 1链和第 2 链的合成按照试剂盒
中提供的说明书进行.
1.2.2 BcANS 基因的克隆 根据前期的
研究结果[ 7] , 用 Prime r Premier 5 软件设计
PCR 扩 增引 物 , 引物 序 列 为 BCP1:5-
ATGGTGGCAG TTGAAAG-3;BCP2:5-
TCAGACT TCA TCCT TT-3.分别以30 ng 子
叶 cDN A 和 50 ng 子叶基因组 DNA 为模板 ,
引物终浓度为 40 μmol L-1 , dNT P 为 120
μmol L-1(上海生工生物工程有限公司), 1×
Taq酶缓冲液 2μL , Taq 酶1 U(北京鼎国),加
ddH2O至 20 μL .PCR程序为:95 ℃预变性 5
min;95℃变性 30 s ,54.5 ℃退火 55 s , 72 ℃延
伸 90 s ,共 31个循环;最后 72 ℃延伸 7 min.
1.2.3 PCR产物回收与测序 20 μL PCR
产物全部用于电泳.凝胶经 V-gene 试剂盒回
收 、纯化 ,产物与 p-GEM T-easy 载体连接 ,置
于室温 2 h 后导入 DH-5α大肠杆菌感受态细
胞中.挑取转化平板上的白色单菌落扩大培养.
经菌液 PCR验证 ,各取 3 个阳性克隆测序.菌
液 PCR的模板为 0.5 μL 菌液 ,所用的反应体
系与程序同1.2.2节.
1.2.4 BcANS 基因的表达分析 根据
1.2.3节的测序结果 ,设计 PCR引物用于 RT-
PCR 分析 , 上 、下游引物分别为 BCP3:5-
CT TCCA TCT TG T TTA TCCTG -3和 BCP4:
5-ACCTCCCGT TACTAAGAA T-3.分别以
30 ng cDNA 为模板进行 RT-PCR检测 ,反应
体系同1.2.2节 ,并以 ACTIN为内标.RT-PCR
重复 3次 , PCR程序为:95 ℃预变性 5 min;95
℃变性 30 s ,52.2 ℃退火 45 s ,72 ℃延伸 60 s ,
共 32个循环;最后 72 ℃延伸 10 min.
2 结果与分析
2.1 BcANS基因的克隆
利用引物 BCP1/BCP2分别从紫菜薹子叶
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蒋明 ,等:紫菜薹花青素合成酶基因 B cANS 的克隆 、表达与序列分析
DNA 和 cDNA 中扩增到约1 600 bp 和1 100
bp条带(图 1).测序结果表明 , BcANS 的基因
组 DNA 全长为1 637 bp ,具1个 560 bp的内含
子 ,外显子长度分别为 497 bp 和 580 bp.
BcANS 的编码区全长为1 077 bp ,编码 358个
氨基酸 ,分别以 ATG 与 TGA 为起始密码子和
终止密码子(图 2).比对结果表明 , BcAN S 的
编码区与同科植物芥菜(B. juncea)、甘蓝
(B rassica oleracea var.cap itata)、拟南芥(A.
thal iana)和紫罗兰(M.incana)的同源性分别
为 97%、96%、89%和 86%,与亲缘关系较远的
旋花科植物裂叶牵牛(Ipomoea tri f ida)和唇
形 科 植 物 彩 叶 草 (Solenostemon
scutel larioides)的同源性分别为 76%和 75%,
说明花青素合成酶基因序列比较保守.
M:DNA 标记;A:基因组 DNA 扩增产物;B:cDNA 扩
增产物.
图 1 紫菜薹 BcANS基因的克隆
Fig.1 Cloning of BcANS gene in B.campestris var. purp urea
图 2 BcANS基因的编码区及推导的氨基酸序列
Fig.2 Coding sequences and the deduced amino acid s equences of BcAN S gene
2.2 BcANS 基因的表达分析
根据测序结果设计 RT-PCR 引物 BCP3/
BCP4 ,分别以 30 ng 光照培养(LT)、暗培养
(DK)、缺磷+光照培养(-P +LT)、缺磷+暗
培养(-P +DK)的子叶和胚轴 cDNA 为模板
进行 RT-PCR扩增(图 3).结果表明 , BcANS
在 LT 、-P +LT 和-P +DK 中均有表达 ,而
DK 的子叶和胚轴中未能检测到;LT 和
-P +LT相比 ,子叶和胚轴中的表达量均增加 ,
说明 BcAN S 在缺磷条件下诱导表达;与
395 第 4期
浙江大学学报(农业与生命科学版)
-P+DK相比 , DK 中未见 BcAN S 基因表达 ,
而-P+DK中子叶和胚轴 BcAN S 基因均有表
达 ,但表达量低于 LT 和-P +LT .
A:PCR产物;B:肌动蛋白内标.C:子叶;H :胚轴;
LT:光照培养;DK:暗培养;-P+LT:缺磷和光照培养;
-P+DK:缺磷和暗培养.
图 3 BcANS基因在紫菜薹子叶和胚轴中的表达
Fig.3 Expression pat tern s of BcAN S gene in cotyledons
and hypocotyls of B.campestr is var. purp urea
2.3 BcANS 基因的进化分析
为研究 BcANS 基因的进化地位 ,从 NCBI
数据库中下载了 18条 AN S 基因序列 ,它们是
芥菜(B. juncea)、甘蓝(B. oleracea var.
capi tata)、 野 生 芜 菁 (B. rapa ssp.
campestris)、西洋梨(Pyruscommunis)、苹
果(Malus ×domestica)、草莓(Fragaria ×
ananassa)、大豆(Glycine max)、蒺藜苜蓿
(Medicago truncatula)、霞 草 (Gypsophi la
elegans)、裂叶牵牛(I. ni l)、圆叶牵牛(I.
purpurea)、 甘 薯 (I. batatas)、 康 乃 馨
(Dianthus caryophy llus)、翠菊(Call istephus
chinensis)、 绿 毛 山 柳 菊 (Hieracium
pi losel la)、拟南芥(A. thaliana)、银杏(G.
biloba)、小 麦 (Trit icum aestivum)、水 稻
(Oryza sat iva)、水 母 雪 兔 子 (S aussurea
med usa)、蝶豆(Cli toria ternatea)和西加云杉
(P icea sitchensis).
利用 Mega 3.1软件构建进化树(图 4),构
建方法为邻接法(neighbo r-joining , NJ), 经
1 000次 boo tst rap 检验.比对结果表明(数据未
显示),紫菜薹 BcANS 的氨基酸序列与同属的
芥菜 、野生芜菁和甘蓝的差异很小 ,仅存在个别
氨基酸残基差异 ,与同科的拟南芥差异稍大 ,与
禾本科植物水稻及小麦的差异最大.从进化树
(图 4)上看 ,同科或同类群的植物聚在一起 ,这
19种植物大致可分为 8 组 , 分别为十字花科
(Brassicaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、豆科
(Legumino sae)、石竹科(Caryophyllaceae)、旋
图 4 用邻接法构建的花青素合成酶基因进化树
Fig.4 Phylogen et ic t ree of anthocyanidin syn th as e gene const ructed by NJ methods
396 第 3 7卷
蒋明 ,等:紫菜薹花青素合成酶基因 B cANS 的克隆 、表达与序列分析
花科(Convolvulaceae)、菊科(Composi tae)、裸
子 植 物 (Gymnospermae ) 和 禾 本 科
(Gramineae).
3 讨 论
植物的花色 、叶色和茎色形成受细胞内部
环境和色素组成的影响 ,内部环境包括 pH 值
和金属离子浓度等[ 12] , 色素主要有类胡萝卜
素 、类黄酮 、甜菜碱和叶绿素等[ 13-14] .花青素是
最为常见的类黄酮类物质 ,决定红 、粉红 、桔黄 、
紫 、蓝等颜色[ 15] .自然界中 ,有超过 500 多种花
青素[ 16] ,但主要的糖苷配基仅 6 种 ,分别是花
葵素(pelargonidin)、矢车菊素(cyanidin)、飞燕
草素(delphinidin)、芍药花苷配基(peonidin)、
矮牵牛苷配基 (petunidin)和二甲花翠素
(malvidin)等[ 17] , 这些配基经过羟基化 、甲基
化 、糖基化和酰基化后呈现出不同的颜色.
ANS 是花青素合成途径的关键酶 ,它将无色的
白花色苷元转变成有色的花青素[ 8] .与同为类
黄酮生物合成途径催化酶的黄酮醇合成酶 、黄
烷酮-3-羟化酶一样 , ANS 也属于 2-氧化戊二
酸家族 ,并且为铁离子依赖型加氧酶 ,这 3种酶
在序列上有约 80%的相似性 ,它们都能氧化类
黄酮的 C 环[ 18-19] .
花青素生物合成途径工程已取得了一定进
展[ 20] ,蓝色月季[ 21] 和紫色番茄[ 22] 是 2 项代表
性成果.月季(Rosa hybrida)由于不能产生类
黄酮 3, 5-羟基 化酶 (f lav onoid-3, 5-
hydoxy lase , F35H),因此无法生成蓝色的飞
燕草素 ,将三色堇(Viola × wittrock iana)的
F35H 基因导入月季 ,最终获得了蓝色花朵.
来自金鱼草(Antirrhinum majus)的 2个转录
因子Deli la和Rosea1 基因 ,在果实特异 E8启
动子的驱动下 ,得到了富含花青素的紫色番茄 ,
这种深色果实可能在抗肿瘤 、抗衰老和延长寿
命方面有着潜在作用[ 23] .利用 RNAi技术抑制
蓝猪耳(Torenia fournieri)AN S 基因的表达 ,
花色由蓝变白 ,而且经多年观察白花性状十分
稳定[ 24] .而在水稻中过量表达 ANS 基因 ,导致
稻米中类黄酮物质大量积累 ,大大提高了抗氧
化潜力[ 4] .
ANS 的表达受环境因素影响 ,病菌侵染 、
昆虫啃食 、紫外线 、低温 、缺磷和干旱等均能诱
导其表达[ 25-27] .陆地棉(Gossyp ium hirsutum)
抗 病 类 型 在 黄 单 孢 菌 (Xanthomonas
campestris pv.malvacearum)侵染下 ,叶片病
斑周围产生红色斑点 ,可作为棉花抗病与否的
指示剂[ 28] .在缺磷条件下 ,拟南芥糖代谢受阻 ,
导致花青素大量积累[ 29] .本研究从紫菜薹中克
隆到了花青素合成酶基因 BcANS ,其编码蛋白
与同科植物的氨基酸序列有 86%以上的相似
性 ,与不同科植物也有较高的相似性 ,说明花青
素合成酶基因序列比较保守.在子叶和胚轴中 ,
BcANS 基因的表达受光照和缺磷条件诱导 ,
而在暗培养条件下未检测到该基因的表达.
紫色类型的十字花科蔬菜很少 ,常见的有
紫菜薹 、紫甘蓝和紫苤蓝等 ,由于它们富含花青
素 ,因此深受消费者的欢迎.BcAN S 基因的克
隆 ,为紫菜薹花青素合成 、累积机制的研究奠定
了基础 ,同时 ,为人工创造高花青素含量的蔬菜
提供了可能;下一步将开展载体构建 、原核表达
和转基因研究 ,以明确 BcANS 基因的功能.
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