全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2016, 51 (3): 363–368, www.chinbullbotany.com
doi: 10.11983/CBB15102
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收稿日期: 2015-06-06; 接受日期: 2015-09-28
基金项目: 广东省科技计划(No.2011B020304006)
* 通讯作者。E-mail: shihp@scnu.edu.cn
五寸石竹毛状根诱导及其植株再生
施和平*, 王蓓, 杨树楠, 郭亚鹏
华南师范大学生命科学学院, 广东省植物发育生物工程重点实验室, 广州 510631
摘要 建立了五寸石竹(Dianthus chinensis)毛状根诱导及其植株再生体系。用含野生农杆碱型Ri质粒的发根农杆菌
(Agrobacterium rhizogenes) 15834感染五寸石竹叶片外植体10天后, 从其形态学下端产生白色不定根; 30天后, 叶片外植
体的生根率为95%; 所产生的毛状根能在无外源生长调节剂的固体和液体MS培养基上快速自主生长。遗传转化鉴定结果表
明, 发根农杆菌Ri质粒的生根基因(rol)已在毛状根基因组中整合并表达。五寸石竹毛状根的根段在成分为MS+2.0 mg·L–1
6-BA+0.2 mg·L–1 NAA的培养基中培养15天后产生浅绿色疏松愈伤组织; 将愈伤组织转入成分为MS+1.0 mg·L–1 6-
BA+0.02 mg·L–1 NAA的培养基中培养30天后逐渐形成不定芽。盆栽的五寸石竹毛状根再生植株与非转化植株(对照)相比节
间缩短, 开花期提前18天。
关键词 五寸石竹, 毛状根, 植株再生, 提早开花
施和平, 王蓓, 杨树楠, 郭亚鹏 (2016). 五寸石竹毛状根诱导及其植株再生. 植物学报 51, 363–368.
毛状根(hairy roots)是发根农杆菌(Agrobacter-
ium rhizogenes)感染植物细胞后, 其Ri质粒含rol基
因(生根基因)的T-DNA片段在植物细胞核基因组中插
入、整合和表达所产生的(Tepfer and Casse-Delbart,
1987)。它不仅具有单细胞起源、遗传稳定和可在无
外源激素培养基上自主生长的特性, 以及表现出相当
或远高于原植株次生代谢物合成能力的优势 (Giri
and Narasu, 2000; 吴晓凤等, 2008); 而且容易通过
组织培养技术获得再生植株(Choi et al., 2004; Shi et
al., 2011; 施和平等, 2014), 且其再生植株通常还具
有诸如矮化(Godo et al., 1997)、顶端优势减弱(侯丽
丽等, 2014)、花序缩短、花叶形态改变(Christensen
et al., 2008)或提早开花(Koike et al., 2003)等观赏性
状的改变, 表明利用毛状根的多态性可进行植物尤其
是园艺植物种质创新或观赏性状改良的研究。五寸石
竹(Dianthus chinensis), 别名矮石竹, 锦团石竹, 是
石竹科多年生草本植物, 目前在园林绿化中广泛应
用。但截至目前尚未见有关其种质创新或利用发根农
杆菌对其遗传转化及其毛状根植株再生的研究报道。
本研究报道了发根农杆菌感染后, 五寸石竹叶片外植
体毛状根诱导和培养以及毛状根的组织培养和植株
再生的结果, 旨在为今后从五寸石竹毛状根再生植株
中筛选出花色变异的新品种, 并为利用该毛状根的同
源多倍体化创新其种质奠定实验和技术基础。
1 植物材料
1.1 细菌菌株及培养
感染实验用的菌株为含野生农杆碱型Ri质粒的发根
农杆菌(Agrobacterium rhizogenes) ATCC15834 (由
德国马丁·路德大学Peter Lindemann博士馈赠)。感染
前, 挑取该农杆菌单菌落, 接种于添加20 μmol·L–1乙
酰丁香酮的YEB液体培养基中, 28°C振荡(每分钟160
转)活化培养30小时后, 待用。
1.2 无菌苗及其外植体的制备
五寸石竹(Dianthus chinensis L.)种子购自北京市芳
萱苑种子有限公司。将种子用清水浸泡2–3小时后,
在超净工作台上用75%乙醇和0.1%HgCl2溶液常规
消毒后, 置于盛有50 mL固体MS (Murashige and
Skoog, 1962)培养基的无菌锥形瓶中暗萌发2天, 之
后转至室温, 在2 000 lux光照条件下萌发成无菌苗。
·技术方法·
364 植物学报 51(3) 2016

萌发12天后, 取无菌苗叶片切成1–1.5 cm2大小的叶
片外植体, 并置于无外源植物生长调节剂的MS培养
基上预培养24小时后, 用于转化。
2 培养基成分与培养条件
2.1 毛状根的诱导和培养
将经过24小时预培养的五寸石竹叶片外植体浸入用
液体MS培养基稀释2倍的发根农杆菌ATCC15834菌
悬液中15分钟, 取出并用无菌吸水纸吸干多余菌液,
接回至原培养基中共培养2天后 , 转入添加500
mg·L–1头孢噻肟钠的无外源植物生长调节剂的MS培
养基上, 于25°C每天14小时散射光下诱导毛状根。切
取从叶片外植体产生的3–4 cm长的毛状根置于含
500 mg·L–1头孢噻肟钠的无外源植物生长调节剂的
MS培养基上进行单根除菌培养, 直到获得无菌的毛
状根。
2.2 毛状根rol基因的PCR检测
选取能够快速自主生长的无菌毛状根500 mg, 按照
Edwards等(1991)的方法提取其基因组DNA, 纯化后
用作rol基因PCR扩增的模板。以非转化组培苗根的基
因组总DNA作对照。根据Furner等(1986)发表的序列,
设计并合成扩增rol B以及rol C的PCR引物, 其序列如
表1所示, 由中国科学院上海细胞生物研究所合成。
PCR反应总体积为50 μL, 模板DNA用量为50
ng, Taq DNA聚合酶2个单位。rol B和rol C基因的
PCR扩增条件相同, 均为: 94°C预变性3分钟; 94°C
变性1分钟, 53.5°C退火1分钟和72°C延伸1分钟, 35
个循环; 最后72°C延伸10分钟。采用0.8%琼脂糖凝
胶电泳和EtBr染色进行PCR扩增产物检测。
2.3 毛状根的愈伤组织诱导及其植株再生
取上述转化鉴定呈阳性的五寸石竹毛状根切成2–3
cm长的根段, 接入成分为MS+2.0 mg·L–1 6-BA+0.2
mg·L–1 NAA的培养基中诱导愈伤组织; 30天后, 将愈
伤组织转入不定芽分化培养基 (成分为MS+1.0
mg·L–1 6-BA+0.02 mg·L–1 NAA)中进行不定芽分化;
切取3–4 cm高的不定芽接入生根培养基 (成分为
1/2MS+0.1 mg·L–1 NAA+15 g·L–1蔗糖)中进行不定
根诱导, 形成毛状根再生植株。
表1 PCR扩增所用的引物及其序列
Table 1 Primer sequences used for the PCR amplification
Target gene Primer sequence
rol B

rol C
P1: 5-GCT CTT GCA GTG CTA GAT TT-3
P2: 5-GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC -3
P1: 5- CTC CTG ACA TCA AAC TCG TC-3
P2: 5- TGC TTC GAG TTA TGG GTA CA-3

2.4 再生植株的盆栽及其性状观察
打开锥形瓶封口膜, 将生根良好的五寸石竹毛状根再
生植株试管苗置于2 000 lux光照度下炼苗4–5天后,
取出并洗去根部的琼脂培养基, 移植到含椰糠:泥炭
土=1:2 (v/v)的营养基质中, 使用保鲜膜保温保湿3–4
天后, 转入25°C温室中培养, 并定期观察和记录植株
的生长发育情况。
3 结果与讨论
3.1 毛状根的诱导和培养
发根农杆菌ATCC15834感染五寸石竹叶片外植体
8–12天后, 可观察到从其叶片外植体切口中脉处或
附近表面产生白色的毛状根(图1A)。而未感染的五寸
石竹叶片外植体(对照)在无外源植物生长调节剂的
MS+500 mg·L–1头孢噻肟钠培养基上连续培养30天
后无一生根, 仅可见大部分的叶片外植体边缘变黄或
变褐。感染30天后, 将叶片外植体产生的毛状根切下
并置于MS+500 mg·L–1头孢噻肟钠中进行单根除菌
培养 , 每隔7天取毛状根根尖段转接至新的含500
mg·L–1头孢噻肟钠的MS培养基上, 大约经过5–6次
转接便可获得完全除菌的毛状根根系。当无菌的五寸
石竹毛状根在无外源植物生长调节剂的MS固体或液
体培养基中培养时, 不仅能快速自主生长, 而且具有
较多的分枝(图1B, C)。将获得的可自主快速生长的无
菌五寸石竹毛状根置于无外源植物生长调节剂的MS
培养基中继代保存, 供随后的遗传转化鉴定和植株再
生使用。
3.2 毛状根rol基因的PCR扩增
rol B和rol C是发根农杆菌Ri质粒T-DNA左臂(TL-
DNA)上的2个生根基因。以rol B和rol C的引物分别从
五寸石竹毛状根和非转化根(对照根)基因组DNA及发
根农杆菌ATCC15834单菌落扩增, 所得产物的电泳
施和平等: 五寸石竹毛状根诱导及其植株再生 365



图1 五寸石竹毛状根诱导、离体培养及其植株再生
(A) 发根农杆菌ATCC15834菌株感染12天后叶片外植体产生的毛状根; (B) 固体培养14天的毛状根; (C) 液体培养14天的毛状根;
(D) 毛状根在MS+2.0 mg·L–1 6-BA+0.2 mg·L–1 NAA上培养15天后形成的愈伤组织; (E) 毛状根愈伤组织在MS+1.0 mg·L–1 6-BA+
0.02 mg·L–1 NAA上培养20天后分化出不定芽; (F) 不定芽在MS+0.1 mg·L–1 6-BA+0.2 mg·L–1 NAA上增殖; (G) 盆栽45天的非转化
植株(组培苗); (H) 盆栽45天的毛状根再生植株

Figure 1 Induction and in vitro culture of hairy roots and its plant regeneration of Dianthus chinensis
(A) Hairy root formation from leaf explants infected by the strain of Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 for 12 days; (B) Solid
medium culture of hairy roots for 14 days; (C) Liquid medium culture of hairy roots for 14 days; (D) Calli formation from hairy roots
cultured on MS+2.0 mg·L–1 6-BA+0.2 mg·L–1 NAA for 15 days; (E) Adventitious shoots formation from calli after cultured on
MS+1.0 mg·L–1 6-BA+0.02 mg·L–1 NAA for 20 days; (F) Multiplication of adventitious shoots on MS+0.1 mg·L–1 6-BA+0.2 mg·L–1
NAA; (G) Pot-grown untransformed (control) plants of Dianthus chinensis for 45 days; (H) Pot-grown regenerated plants from
hairy roots for 45 days


结果如图2所示。从图2可以看出, 利用rol B和rol C的
PCR引物能从五寸石竹毛状根的基因组DNA及发根
农杆菌ATCC15834单菌落克隆中分别扩增到期望的
540 bp和770 bp大小的特异性DNA片段, 而从五寸
石竹非转化根的基因组DNA中扩增不到任何片段(图
2)。说明发根农杆菌含rol B和rol C基因的Ri质粒的
T-DNA片段已在五寸石竹毛状根基因组中插入、整合
且得到表达。
3.3 毛状根的愈伤组织诱导及其不定芽分化
取转化鉴定呈阳性的五寸石竹毛状根切成长2–3 cm
的根段, 转入添加不同浓度6-BA和NAA组合的MS固
体培养基中诱导愈伤组织。接种6天后, 可观察到毛
状根根段开始变粗且膨大, 并逐渐脱分化产生浅绿色
疏松的愈伤组织。15天后所有毛状根根段均脱分化产
生愈伤组织, 且随着培养时间的延长, 其愈伤组织的
体积迅速增大(图1D)。为了获得五寸石竹毛状根再生
植株, 将生长旺盛的上述毛状根愈伤组织转入添加
1.0 mg·L–1 6-BA+0.02-0.2 mg·L–1 NAA的不定芽分
化培养基中, 分化培养20天后, 可见从膨大的愈伤组
织表面逐渐分化出绿色芽点, 30天后芽点逐渐发育成
丛生不定芽(图1E)。将所产生的丛生不定芽切下并转
至成分为MS+0.1 mg·L–1 6-BA+0.2 mg·L–1 NAA的壮
苗和增殖培养基中, 培养15天后, 幼芽变得粗壮且叶
色更绿(图1F)。
3.4 不定芽生根诱导及再生植株的移栽
为了诱导不定芽生根, 将上述五寸石竹毛状根愈伤组
织再分化产生的高2–3 cm的健壮不定芽切下, 分别
转接到1/2MS+0.1-0.5 mg·L–1 NAA的固体生根培养
基进行不定根诱导, 接种10天后从不定芽基部逐渐
分化出白色的不定根, 发育成完整植株。
待再生植株根长到3–4 cm时, 打开五寸石竹毛
状根再生植株试管苗的三角瓶封口膜, 并置于2 000
366 植物学报 51(3) 2016



图2 五寸石竹毛状根rol B和rol C基因的PCR扩增产物的凝胶
电泳分析
1: 1 kb DNA marker; 2–5: rol B引物扩增片段; 6–9: rol C引物
扩增片段; 2, 6: 从发根农杆菌菌落扩增的片段; 3, 7: 从非转化
根(对照根)基因组DNA扩增的片段; 4, 5, 8, 9: 从毛状根基因组
DNA扩增的片段

Figure 2 Gel electrophoresis analysis of PCR fragments of
rol B and rol C genes amplified from the genome DNA of ha-
iry roots
Lane 1: 1 kb DNA marker; Lane 2–5: Fragments with rol B
primers；Lane 6–9: Fragments with rol C primers; Lane 2 and
6: Fragments amplified from the colony of Agrobacterium
rhizogenes ATCC15834; Lane 3 and 7: Fragments from
genome DNA of untransformed roots; Lane 4, 5, 8, and 9:
Fragments amplified from genome DNA of hairy roots

lux光照度下炼苗4–5天, 取出并洗去根部培养基, 移
植到盛有椰糠:泥炭土=1:2 (v/v))的花盆中, 用保鲜膜
保温保湿, 置于散射光下培养; 当五寸石竹毛状根再
生植株的叶片逐渐恢复生长后, 去掉保鲜膜, 转入
25°C温室中进行光照培养。五寸石竹毛状根再生植株
与非转化株(对照)的生长形态和开花情况见表2、图1
G和H。从表2可以看出, 与同时栽培的非转化植株(对
照)相比, 培养20天后的五寸石竹毛状根再生植株的
节间缩短, 叶片不皱缩, 茎秆稍粗, 顶端1–3叶的叶
片大小与对照相比无明显差异, 但从顶端起第1–3叶
的节间比对照分别缩短了29.2%、26.6%和10%; 平
均株高比对照缩短了23.6%; 培养45天后, 五寸石竹
毛状根再生植株即可分化出花芽, 其开花时间约比对
照提前18天(图1G, H)。
3.5 讨论
由于每条毛状根都是发根农杆菌Ri质粒的T-DNA片
段在植物细胞基因组中随机插入、整合和表达所产生
的结果, 因而, 毛状根不仅可自主生长, 且具有不同
的遗传背景和次生代谢产物的合成能力, 其通过组织
培养再生形成的转化植株还具有不同的生长发育性
状变化。如通过其毛状根植株再生已获得了更具观赏
性的矮化紫高杯花(Nierembergia scoparia) (Godo
et al., 1997)和花器官形态变化的长寿花(Kalanchoe
blossfeldiana) (Christensen et al., 2008), 实现了园
艺植物种质创新或观赏性状改良的目的。国内外也有
学者开展了发根农杆菌对石竹科植物香石竹(Dian-
thus caryophyllus)的遗传转化(范惠琴等, 2001;
Casanova et al., 2004)及其毛状根植株再生的研究
(施和平等, 2014), 以及香石竹转基因技术的研究(余
义勋等, 2006)。但迄今为止, 尚未见有关发根农杆菌
对石竹属植物五寸石竹遗传转化的报道。本研究中,
我们利用含野生农杆碱型R i质粒的发根农杆菌
ATCC15834对五寸石竹进行了遗传转化, 获得了可
自主生长的毛状根; 并通过组织培养途径获得了五寸

表2 五寸石竹毛状根再生植株与非转化株生长形态的比较
Table 2 Comparison of growth morphology of untransformed and hairy root-regenerated plants of Dianthus chinensis
Control plants Hairy roots regenerated plants
Plant height (cm) 22.50±2.64 17.20±2.25
Internode Length of 1st leaf from apex (cm)
Internode Length of 2nd leaf from apex (cm)
Internode Length of 3rd leaf from apex (cm)
2.26±0.74
2.67±0.92
1.70±0.73
1.60±0.35
1.96±0.60
1.53±0.14
Length of 1st leaf from apex (cm)
Length of 2nd leaf from apex (cm)
Length of 3rd leaf from apex (cm)
2.54±0.321
4.11±0.34
5.09±0.28
3.18±0.17
4.20±0.32
4.94±0.30
Width of 1st leaf from apex (cm)
Width of 2nd leaf from apex (cm)
Width of 3rd leaf from apex (cm)
0.50±0.08
0.94±0.07
1.16±0.07
0.58±0.07
0.9±0.15
1.00±0.06

施和平等: 五寸石竹毛状根诱导及其植株再生 367

石竹毛状根再生植株。所建立的五寸石竹遗传转化体
系, 为今后利用基因工程手段改良其花卉性状奠定了
实验技术基础。
已有的研究表明, 发根农杆菌Ri质粒的含4个生
根基因rolABCD的T-DNA片段在植物细胞核基因组
中插入、整合及稳定表达后, 所产生的毛状根不仅可
自主快速生长, 及通过组织培养技术再生出转化株
(Christey, 2001; 施和平等, 2014); 而且发现, Ri质
粒rol基因的表达还会导致毛状根再生转化株呈现出
一些观赏性状变异和生长习性方面的改变。例如, 通
过含发根农杆菌Ri质粒rol C基因的遗传转化及其毛
状根组织培养和植株再生, 能够获得较对照花期提早
的矮牵牛属植物碧冬茄(Petunia hybrida)的转化植株
(Winefield et al., 1999); 或可从毛状根再生株系中筛
选到具有矮化观赏性状以及开花习性从原来两年生
开花的对照植株变为一年生或每年开花的欧洲菊苣
(Cichorium intybus)和胡萝卜 (Daucus carota var.
sativa)转化植株 (Sun et al., 1991; Limari et al.,
1998); 以及获得无需春化诱导即可成花的菊苣新品
种(Kamada et al.,1992)。此外, 发根农杆菌rol基因的
遗传转化既可改变植株的生长习性, 也可以获得花瓣
颜色组成发生变化的长春花 (Catharanthus roseu)
(Choi et al., 2004), 获得株高缩短、叶面积和花瓣变
小但比对照植株提前22天开花的大花天竺葵(Regal
pelargonium)转化植株(Boase et al., 2004)以及株型
和叶片形态改变并提早开花的大豆(Glycine max)植
株(Zia et al., 2010)与提前开花的欧洲菊苣毛状根再
生植株(Bogdanovic et al., 2014), 达到通过Ri质粒
T-DNA的遗传转化来创新、改良和培育植物新品种
(或新种质)的目的。本研究中, 与对照相比, 我们获得
的五寸石竹毛状根再生植株不仅节间缩短, 而且提早
18天开花。这与Winefield等(1999)用发根农杆菌rol C
基因对碧冬茄遗传转化获得花期提早(前)的碧冬茄转
化株, 以及Bogdanovic等(2014)利用Ri质粒遗传转
化获得开花提前的欧洲菊苣毛状根再生转化株的结
果基本一致, 但与我们已完成的发根农杆菌ATCC-
15834遗传转化产生的烟草(Nicotiana tabacum)毛状
根再生植株的性状变化不一致。与对照相比, 烟草毛
状根再生植株不仅顶端优势减弱, 而且营养生长期延
长, 并比对照延迟21天开花(侯丽丽等, 2014)。这种
差异表明, 发根农杆菌遗传转化产生的毛状根可用作
植物种质创新、新品种培育及性状改良的有效工具,
但其新种质性状的形成因植物类型而异。
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Induction of Hairy Roots of Dianthus chinensis and Its
Plant Regeneration
Heping Shi*, Bei Wang, Shunan Yang, Yapeng Guo
Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, School of Life Sciences, South China Normal
University, Guangzhou 510631, China
Abstract This study established an efficient system for inducing hairy roots and plant regeneration of Dianthus
chinensis. Hairy roots could be induced from the basal surface of leaf explants of D. chinensis at 10 days after inoculation
with the strain of Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 harbouring the wild agropine-type plasmid. The percentage of
rooting leaf explants was 95% at 30 days after inoculation. Hairy roots could grow rapidly and autonomously in liquid or
solid plant-growth regulator-free MS medium. The transformation was confirmed by PCR amplification of the rol gene of
the Ri plasmid from D. chinensis hairy roots. Hairy roots could form light green callus after culture on MS + 2.0 mg·L–1
6-BA + 0.2 mg·L–1 NAA for 15 days. Adventitious shoots were gradually produced from calli after culture on MS + 1.0
mg·L–1 6-BA + 0.02 mg·L–1 NAA for 30 days. Compared to the control, pot-grown plants regenerated from hairy roots had
shorter internodes and flowering was earlier by 18 days.
Key words Dianthus chinensis, hairy roots, plant regeneration, early flowering
Shi HP, Wang B, Yang SN, Guo YP (2016). Induction of hairy roots of Dianthus chinensis and its plant regeneration.
Chin Bull Bot 51, 363–368.
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* Author for correspondence. E-mail: shihp@scnu.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)