全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 1期，2009年 1月 9 7
采用植物离体培养技术生产精油
邓盾 1,2, 王永飞 1, 马三梅 1, 李晓东 2,*
1暨南大学生物工程学系, 广州 510632; 2深圳职业技术学院, 广东深圳 518055
Production of Essential Oil by in vitro Culture Techniques of Plant
DENG Dun1,2, WANG Yong-Fei1, MA San-Mei1, LI Xiao-Dong2,*
1Department of Biotechnology, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2Shenzhen Polytechnic, Shenzhen, Guangdong 518055,
China
提要: 本文对近三十年来采用植物离体培养技术生产精油的研究进展作了介绍。
关键词: 植物离体培养; 精油; 毛状根培养; 细胞悬浮培养; 细胞固定化
收稿 2008-08-06 修定 2008-10-06
资助 深圳职业技术学院重点课题(0 6KJX0 12 )。
* 通讯作者(E-mail: lxd1819@yahoo.com.cn; Tel: 0755-
2 6 0 1 9 1 6 9 )。
植物精油又称挥发油、芳香油等, 其成分比
较复杂, 包括萜类、酯类和黄酮类等物质。其中
单萜是植物精油的主要成份, 酯类和氧化形式的单
萜是其香味的主要来源。常见的氧化单萜有芳樟
醇(linalool)、香茅醇(cephrol)、薄荷醇(menthol)、
柠檬醛(citral)、1,8-桉叶素(1,8-cineole)、聚伞花
素(ρ-cymene)和百里酚(thymol)等。此外, 植物精
油中还含有一些不含氧的单萜, 它们主要是一些烯
烃, 但是不具有香味, 较常见的有 α - 蒎烯(α -
pinene)、β-蒎烯(β-pinene)、樟烯(camphene)、
月桂烯(myrcene)等(许任生等 2006)。单萜具有共
同的生物合成途径 , 即由异戊烯基焦磷酸
(isopentenyl diphosphate, IPP)和它的同分异构体二
甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyldiphosphate,
DAMPP)在异戊烯转移酶(prenyltransferase)催化下
合成牻牛儿基焦磷酸(geranyl pyrophosphate, GPP),
G P P 则是所有单萜合成的共同前体( R o b e r t s
2007)。
植物精油的经济价值和药用价值均较高, 有
“液体黄金”的美誉。但是它在植株中的含量较低,
而且传统的精油生产方式易受到环境的制约。因
此, 人们期望采用植物细胞培养技术生产精油。本
文对这方面的研究进展作了介绍。
1 采用几种离体培养技术生产植物精油
为了弥补传统精油生产方式的缺陷, 科学家期
望采用各种植物离体培养技术实现精油的工厂化生
产, 这些技术主要包括细胞悬浮培养(cell suspension
culture)、细胞固定化(cell immobilization)、毛状
根培养(ha i ry - r oot cul tu re )和畸状茎( s hoot y
teratomas)培养等。
1.1 细胞悬浮培养技术的利用 单萜的合成比较特
殊, 植物细胞内有特定的合成和储存单萜的部位, 如
腺毛(glanduar trichomes)、树脂道(resin ducts)和
裂生腺(schizogenous glands)等。一些科学家认为
分化程度不高的植物培养物不能够合成精油, 而且
随着继代次数的增加单萜在愈伤组织中有不断减少
的趋势(Charlwood和 Brown 1988)。但是更多的
研究认为这些培养物可以产生单萜类物质和植物精
油, 如表 1中列出的一些文献报道。甚至, 一些研
究还指出采用细胞悬浮培养技术还可以提高精油产
量, 如 J os hi 等(2 00 0)利用素馨花( Ja sm in um
grandiflorum)节间诱导出的愈伤组织建立了细胞悬
浮培养体系, 12 d后精油产量是花的3倍, 达1.12%
(V/W , FW)。在液体培养基中加入前体芳樟酸
(50~100 mg·L-1)或芝麻、花生和大豆的提取液
(0.5~l.0 g·L-1)都能够较大程度地提高精油的产量。
在优化的条件下, 细胞悬浮培养体系中的芳樟醇产
量是花的 8倍。又如Kintzios等(2003)建立的罗勒
(Ocimum basilicum)细胞悬浮培养体系产迷迭香酸
的能力是愈伤组织或植株产迷迭香酸的能力的
8.5~11倍, 产量达 10 mg·g-1 (DW)。
但是采用愈伤组织或细胞悬浮培养技术生产
植物生理学与农业及生产应用 Plant Physiology and Agriculture and Applications
植物生理学通讯 第 45卷 第 1期，2009年 1月9 8
表 1 用植物细胞培养技术获得的一些挥发性成份
物种名 培养方式 主要挥发性成份 精油产量 参考文献
洋蓍草(Achillea millefolium 细胞悬浮培养 丁香酚、桧萜、ρ - 聚伞 0.001%~0.002% (W/W, FW) Figueiredo等 1995
ssp. millefolium) 花素
洋蓍草(Achillea millefolium) 毛状根培养 异戊酸橙花酯、橙花醇、 0.05% (V/W, FW) Lourenço等 1999
反 -β -法呢烯
母菊(Chamomilla recutita) 愈伤组织 母菊醇、库贝醇、Gossonorol Magiatis等 2001
印度藏茴香(Carum copticum) 细胞悬浮培养 榄香醇、α-杜松醇、δ-杜松 Lockwood等 2002
烯(7.8%)
印度藏茴香(Carum copticum) 愈伤组织 百里酚 Prabha等 1991
圆金柑(Citrus japonica) 愈伤组织和 d - 柠檬烯、α - 萜品醇 Lockwood等 2007
细胞悬浮培养
葡萄柚(Citrus paradisi) 愈伤组织 瓦伦烯、努特卡酮 瓦伦烯(8.0±0.6) µg·100 g-1 del Río等 1991
努特卡酮(160±13.6) µg·100 g-1
甜橙(Citrus sinensis) 愈伤组织 氨基苯甲酸甲酯、柠檬烯、 Alonzo等 2001
β - 丁香烯、罗勒烯
赤桉(Eucalyptus 愈伤组织 β - 蒎烯、α - 蒎烯、樟脑烯 Giamakis等 2001
camaldulensis) (camphene)
素馨花(Jasminum 细胞悬浮培养 芳樟醇、丁香酚、顺 - 茉 1.12% (V/W, FW) Joshi等 2000
grandiflorum) 莉花素、茉莉酮酸甲酯
欧当归(Levisticum officinale) 毛状根 正庚醛、γ - 榄烯、反 - β - 0.006%~0.018% (V/W, FW) Santos等 2005
法呢烯
胡椒薄荷(Mentha arvensis) 愈伤组织 薄荷酮、异薄荷酮、薄荷醇 Phatak和 Heble 2002
辣薄荷(Mentha piperita) 细胞悬浮培养 薄荷醇 薄荷醇 166 mg·L-1 Chang等 1998
柠檬留兰香(Mentha citrata) 畸状茎 芳樟醇、乙酸芳樟酯 精油含量约为植株的 10% Hilton等 1995
柠檬留兰香(Mentha citrata) 畸状茎 芳樟醇、乙酸芳樟酯 精油含量为叶片的 20% Spencer等 1990
辣薄荷(Mentha piperita) 畸状茎 薄荷醇、薄荷呋喃 Spencer等 1993
肉豆蔻天竺葵 细胞悬浮培养 柠檬烯、月桂烯、β - 萜品烯 单萜含量约为植株的 1%~3% Brown和 Charlwood
(Pelargonium fragrans) 1986
橙花糙苏(Phlomis fruticosa) 愈伤组织 Nikolakaki和
Christodoulakis 2007
茴芹(Pillpinella anisum) 畸状茎 β- 没药烯 精油含量为植株的 0.0727% Salem和 Charlwood
1995
茴芹(Pimpinella anisum) 毛状根 反 -环氧假异丁香酚 -2甲基 0.1% (V/W, DW) Santos等 1998
丁酸、β - 没药烯、青枝烯
毛缘光萼苔 细胞悬浮培养 β-没药烯、水蓼二醛、去绿 Ono等 1996
(Porella vernicosa) 片酮甲酯
迷迭香(Rosmarinus 细胞悬浮培养 十六烷酸、2 , 6 - 二异丁基 - 朱汝幸等 1996
officinalis) 4-甲基苯酚、樟脑、桉精油
银灰菊(Santolina 愈伤组织 α - 雪松烯、β - 雪松烯、 Ahuja等 2005
chamaecyparissus) vulgarone
缬草(Valeriana officinalis) 毛状根 野缬草醇、乙醋野缬草酯、 0.3% (V/W, DW) Gränicher等 1995
乙酸冰片酯、β - 丁香烯
Zataria multiflora 愈伤组织 百里酚、香芹酚、乙酸百里
Boiss (Labiatae, Zataria) 酚酯(thymol aceta te)、乙酸 Mohagheghzadeh等
(唇形科, 新塔花属) 香芹酯(carvacrol acetate)、 2000
γ - 萜品烯、ρ - 伞花烃
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植物精油也存在着一些问题。一方面, 在愈伤组织
中合成的单萜, 在植株中含量很低或是不存在。如
从迷迭香(Rosmarinus officinalis)细胞悬浮培养物的
精油中含有柳杉烯, 而在植株中却不存在(朱汝幸等
1996)。在欧芹(Petroselinum crispum)愈伤组织中
合成的柠檬烯(limonene)和苯乙酮(acetophenone)也
没有在植株中发现(López等1999)。黑暗培养的肉
豆蔻天竺葵(Pelargonium fragrans)愈伤组织中, 柠
檬烯占挥发性物质的50%, 而在植株中柠檬烯仅占
挥发性成份的 5% (Brown和 Charlwood 1986)。
另一方面, 更多的情况是愈伤组织或悬浮培养
细胞的精油产量较低。如洋蓍草(Achillea millefolium)
悬浮培养细胞中精油最大得率仅有 0.002% (W/W,
FW), 而植株的精油产量则达到 0.2% (W/W, FW)
(Figueiredo等 1995)。又如, 在已分化出毛状体
(trichome), 但未生根的肉豆蔻天竺葵(P. fragrans)
愈伤组织中的精油含量仅为植株的0.3% (Brown和
Charlwood 1986)。因此如何提高植物离体组织或
细胞合成精油的质量和产量是一个亟待解决的问
题。
1.2 毛状根和畸状茎培养技术的利用
1.2.1 毛状根培养技术 与愈伤组织和悬浮培养的
细胞相比, 毛状根培养物具有遗传和化学性状稳
定、分化程度高的特点, 也不需要植物生长调节
剂去刺激它的生长。从产量上比较, 采用毛状根培
养技术获得的精油量相对较高。如洋蓍草( A .
millefolium ssp. millefolium)毛状根培养物的精油
产率为 0.05% (V/W, FW), 和植株中的精油含量相
当(Lourenço等 1999)。但悬浮培养的洋蓍草(A.
millefolium)细胞的精油产量仅是植株水平的 0.5%
(Figueiredo等 1995)。Santos等(1998)建立了茴芹
(Pillpinella anisum)毛状根培养体系, 在光照培养条
件下毛状根培养物的精油量为1.2% (V/W, DW), 高
于茴芹(P. anisum)根和果实中的精油含量。可见
毛状根培养技术在植物精油离体生产方面具有较大
的应用价值。但是也有研究报道称, 由毛状根培养
物产生的精油在产量和化学成分上都与植株不同,
如 Santos 等(2005)获得的欧当归(Lev is t icum
officinale)毛状根培养物的精油产量仅为 0.006%~
0.018% (V/W, FW)。另外, 欧当归(L. officinale)植
株中的挥发性成份 β-芹子烯(β-selinene)也未在毛
状根培养物中发现(Santos等 2005)。又如反式茴
香脑(trans-anethole)在茴芹(P. anisum)果实中比例
高达 92.5%, 但是在毛状根培养物中只占 1%左右
(Santos等 1998)。再如, 虽然缬草(Valer iana
officinalis)毛状根精油产量和植株根中的相当, 但
是缬草毛状根精油中的单萜比例却下降了 10倍
(Gränicher等 1995)。
1.2.2 畸状茎培养技术的利用 畸状茎同毛状根的
特点类似, 也不需要植物生长调节剂去刺激生长。
不同的是, 畸状茎常常被用来研究植物地上部分的
次生产物合成, 而毛状根常常被用来研究植物地下
部分的次生产物合成。畸状茎一般是由根癌农杆
菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染植物茎段形成的,
但不是所有的根癌农杆菌都能够引起畸状茎的形
成。Spencer等(1990)比较了 10个不同的根癌农杆
菌株系诱导柠檬留兰香(Mentha citrata)产生畸状茎
的效果时发现仅有胭脂碱(nopaline)型的根癌农杆菌
T37和C58才能诱导柠檬留兰香产生畸状茎, 并且
在畸状茎上发现了油腺(oil gland)。虽然畸状茎的
精油含量比植株叶片低4倍, 但是精油的质量有了
很大提高。芳樟醇和乙酸芳樟酯(linalyl acetate)是
柠檬留兰香(M. citrata)精油的主要成分, 在叶片中
它们占精油 93%, 在畸状茎中的约占精油的 94%。
柠檬留兰香(M. citrata)畸状茎的精油成分和植株的
十分接近, 但产量却比叶片的低 4倍。Salem和
Chailwood (1995)利用根癌农杆菌T37感染茴芹(P.
anisum)茎, 获得了茴芹畸状茎。畸状茎中精油的
含量比植株茎低 18%, 比完整植株低 89%, 但是精
油的主要成分和植株较为相似。
从上面的研究可以看出畸状茎的精油产量不
一定比植株高, 一般比植株低几倍到 10倍。但是
畸状茎的优点在于产生的精油质量较高, 而且生长
速度快, 这可以弥补精油产量不高的缺陷。因此采
用畸状茎培养技术去实现植物精油的离体生产有很
好的应用前景。
1.3 细胞固定化培养的利用 细胞固定化技术的优
点在于固定化后的细胞相对密集, 生长缓慢, 有利
于细胞的聚集和分化。另外, 由于固定化介质对细
胞起到保护作用, 细胞受到剪切力和渗透压的影响
较小, 因而可能有利于精油的合成。郝建平等
(1995)建立了一种薄荷(Mentha haplocalyx Briq)的
细胞固定化生产薄荷醇的方法, 他们用 3%海藻酸
钠固定愈伤组织, 并进行细胞悬浮培养, 成功获得
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了薄荷醇。
但也有报道称采用细胞固定化的方法并不能
提高精油的产量, Kintzios等(2003)就发现固定化后
的罗勒(O. basilicum)细胞的产迷迭香酸能力比悬浮
培养的罗勒细胞要低。Kintzios等(2003)还发现使
用 1.5% 藻酸钙(calcium alginate)固定罗勒(O.
basilicum)愈伤组织时, 迷迭香酸的合成完全被抑制;
使用3%藻酸钙时, 细胞仅合成少量的迷迭香酸; 使
用 2%藻酸钙的固定效果最好。原因可能是浓度
为1.5%藻酸钙会造成细胞表面包裹层的空隙较大,
使细胞易于受到微环境的影响。而浓度为 3%藻
酸钙固定细胞则造成包裹层的空隙太小, 影响了营
养物质的交换。因此, 采用细胞固定化技术生产精
油还需要进一步深入研究。
2 离体条件下影响精油合成的因素
2.1 植物生长调节剂对精油合成的影响 如何提高
离体的细胞和组织中精油产量是个亟待解决的问
题。研究发现, 植物生长调节剂能够影响离体细胞
和组织中精油的合成。当培养基中 2,4-D浓度调
整到 2 mg·L-1时, 辣薄荷(Mentha piperita)细胞悬浮
体系中薄荷醇的产量最大(Chang等 1998)。可见
适当浓度的植物生长调节剂能够促进精油的合成。
但是植物生长调节剂促进精油的合成并不是
通过提高生物合成量来实现的, 当 IBA浓度为 1.0
mg·L-1和 6-BA浓度为 5.0 mg·L-1时, 夏风轮菜
(Satureja hortensis)愈伤组织的生物合成量达到最大,
但是迷迭香酸的合成量却在 IBA浓度为 1.0 mg·L-1
和 6-BA浓度为 1.0 mg·L-1时达到最大(Tepe和
Sokmen 2007)。Sudriá等(1999)研究了细胞分裂素
对齿叶薰衣草(Lavandula dentata)精油合成的影响,
它们发现6-BA虽然能够提高齿叶熏衣草生物合成
量, 但是6-BA对精油合成量的影响却是通过改变腺
毛的分泌状态来实现的。
2.2 光照对精油合成的影响 Brown和 Charlwood
(1986)发现光照可以促进单萜积累, 当肉豆蔻天竺
葵(P. fragrans)愈伤组织在连续黑暗的培养条件下,
单萜产量为植株的 1%, 而在 18 h的光照培养条件
下, 单萜的产生量为植株的 3%。说明光照肉豆蔻
天竺葵的愈伤组织合成单萜。Giamakis等(2001)报
道赤桉(Eucalyptus camaldulensis)愈伤组织在光照培
养条件下, 氧化形式的1,8-桉叶素含量比在黑暗条
件下培养的高, 但是另一种单萜β-蒎烯的含量却比
黑暗条件下培养的低。Figueiredo等(1995)发现与
光照条件下培养的洋蓍草(A. millefolium)细胞相比, 黑
暗环境更能刺激洋蓍草合成丁香酚。看来光对单
萜的影响比较复杂, 因为光不但能够改变一些酶的
活性, 也能够能够导致一些萜类的降解, 这两方面
都是导致植物挥发油成分发生改变的原因。
2.3 低温和诱导物 植物次生代谢是和防御反应密
切联系的, 在逆境环境下植物次生代谢往往被刺
激。有研究说明低温能够促进精油合成。未分化
的辣薄荷(M. piperita)愈伤组织在酵母提取物的诱
导下精油合成量为0.39 g·L-1, 如果把培养温度降低
到 10 ℃则精油产量可达到 0.53 g·L-1 (Dörnenburg
和 Knorr 1996)。
真菌细胞壁成份中的壳聚糖(chitosan)和果胶
(pectin)能够模拟植物病源菌与植物作用模式, 从而
刺激植物防御反应并提高精油产量。在植株水平
上, 添加诱导物是提高精油产量常用的方法, 但是
在细胞水平上这方面的报道还不多见, Chang等
(1998)报道在培养基中添加 200 mg·L-1壳聚糖可以
使薄荷醇的产量增加 40倍。可见采用诱导物刺激
精油的合成是一个不错的方法。
3 采用植物离体培养技术生产精油时需要注意的
问题
3.1 植物精油的合成能力与细胞的分化程度有
关 一般认为如果某种次生产物是在特化的器官中
合成, 那么这种物质在未分化的组织中出现的几率
就较低, 甚至不出现。尽管精油是在特殊的器官中
合成的, 但大量的研究证明未分化的愈伤组织和悬
浮培养细胞也能够进行单萜和精油的合成(表1), 这
就说明组织是否分化不是精油是否能够合成的前
提。
但是, 从另一方面看组织分化程度的高低确实
和精油的质量和产量有着密切关系。Lockwood等
(2002)发现2,4-D和激动素(kinetin, KT)能诱导印度
藏茴香(Carum copticum)形成未分化的愈伤组织, 不
过这种愈伤组织并不能够合成百里酚。而有趣的
是半组织化的愈伤组织合成百里酚的能力是未分化
愈伤组织的6倍, 这可能是半分化愈伤组织中含有
较多叶绿素 II的缘故(Prabha等 1991)。Pasqua等
( 2 0 0 1 ) 认为精油的合成和根的次生分泌管
(secondary secretory duct)分化程度有密切关系, 因
为完整欧白芷(Angelica archangelica)植株的根中有
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较多的单萜, 而由愈伤组织诱导后的根仅能合成少
量的挥发性萜类, 原因是这种再生根的中柱鞘仅含
有两个发育程度较低的初级管(primary duct), 而植
株根的中柱鞘则含有分化程度相对较高的次生分泌
管。Alonzo等(2001)发现甜橙非胚状体中检测不
到单萜的存在, 而在胚状体中可检测出柠檬烯的存
在。
又如, 在细胞悬浮培养体系中固定后细胞的精
油生产能力比游离细胞的精油生产能力强。以前
一种方式获得的精油产量约是植株的20%, 而以后
一种方式获得精油产量仅为植株的 1%, 原因可能
就是固定后细胞的排列方式更接近植株(Brown和
Charlwood 1986)。
这些研究说明分化程度的高低和单萜的合成
有密切关系。因此从具有一定分化程度的愈伤组
织或细胞入手才是提高精油合成能力的合理途径。
3.2 选择合适的植物离体培养技术 对于细胞悬浮
培养技术而言, 由于单萜对植物细胞的毒性, 剪切
力和渗透压力对植物细胞生长的影响, 细胞的精油
产生能力很难提高。应采取相应的措施避免这些
不利因素, 如采用两相培养技术等。
一般认为毛状根培养技术较为适合生产积累
于植物根部的次生代谢物, 畸状茎培养技术则适合
生产积累于植物地上部分的次生代谢物, 植物精油
一般以植物地上部分, 如花、叶和茎中的含量最为
丰富。因此多数研究认为毛状根产生的植物精油
质量不高的现象也就不足为奇了(Santos等 1998;
Lourenço等 1999)。
从不同的植物离体培养方式来看, 畸状茎培养
技术在精油生产中最具应用前景。与其他植物离
体培养方式相比, 畸状茎最大的优势在于所获得的
精油质量较高, 主要成分基本上与植株的一致。尽
管精油产量较低, 但是畸状茎生长周期短的特点可
以弥补这一缺点, 例如茴芹(P. anisum)畸状茎的生
长周期仅有 30 d (Salem和 Charlwood 1995), 短时
间内即可获得大量原材料。因此, 在离体条件下,
畸状茎培养技术是目前最有可能实现精油工厂化生
产的技术。需要注意的是畸状茎在不断继代培养
后, 精油的成分可能会发生改变。如 Hilton等
(1995)认为辣薄荷(M. piperita)畸状茎在培养之初精
油中以薄荷呋喃(menthofuran)为主, 而继代 5年之
后则以薄荷醇和薄荷酮(menthone)为主, 显然精油
的主要成分发生了改变。但是这种改变也是相对
的, 柠檬留兰香(M. citrata)畸状茎的精油成分相对
稳定的多, 在继代培养 5年之久后还基本保持不
变。这可能是由于在继代培养过程中一些酶不稳
定的表达导致了精油成分的改变。
4 结语
虽然分化程度低或未分化的愈伤组织和悬浮
培养细胞也具有精油合成能力, 但是精油的产量和
质量均不高。精油的合成和储存与组织的分化程
度相关, 因此建立植物离体培养体系需要从具有一
定分化程度的组织入手, 如毛状根和畸状茎等。相
对而言畸状茎的精油成分与植株最为接近, 因而畸
状茎培养技术是目前离体生产精油的最佳选择。
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