全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2014, 49 (2): 203–208, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2014.00203
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收稿日期: 2013-10-21; 接受日期: 2013-11-19
基金项目: 国家自然科学基金(No.31000873)和山西农业大学科技创新基金(No.2014025)
* 通讯作者。E-mail: owenhe73@sohu.com
植物材料快速石蜡制片方法
贺冰*, 李志岗, 郝晓娟, 贺运春
山西农业大学农学院, 太谷 030801
摘要 真空干燥箱已越来越广泛地应用于现代生物学研究领域。该文利用真空干燥箱温度和负压的可控制性能, 将固定、
脱水、透明和石蜡渗透等过程在真空干燥箱中进行, 建立起一套可行的植物组织快速石蜡制片方法。结果显示, 真空干燥
箱的应用加速了多种试剂的渗透速率, 提高了切片质量, 达到了优化实验步骤、节省实验时间和减少室内有毒化学气体污
染的目的。
关键词 真空干燥箱, 快速石蜡制片, 叔丁醇
贺冰, 李志岗, 郝晓娟, 贺运春 (2014). 植物材料快速石蜡制片方法. 植物学报 49, 203–208.
石蜡制片技术的应用和发展已有150年的历史, 目
前在动物、植物以及微生物等研究领域得到广泛应用,
是细胞学和病理解剖学研究工作中一项非常重要的基
础技术。传统的石蜡制片技术耗时较长且操作过程繁
琐, 完成一个连续工作周期需要5–6天的时间, 且制片
质量不稳定(林月惠等, 2001; 李和平, 2009)。近年来,
快速石蜡制片技术成为该领域关注和探索的热点。
随着快速石蜡制片技术研究的发展和日臻完善,
植物材料的快速石蜡制片质量和效率有了显著提高。
常用于快速石蜡制片的设备有玻璃真空干燥器、
YB-DX23B型电动吸引器及熔蜡箱等, 并可将石蜡制
片周期缩短到2天(贺运春, 2002)。利用震荡法进行组
织固定、脱水、透明和渗蜡, 石蜡制片周期只需2小
时即可完成(任成林等, 2007)。通过改良透明、包埋
试剂、染色等方法, 可将制片周期缩短三分之一(潘叶
等, 2008)。将植物组织置于微波中进行固定、脱水、
石蜡渗透, 用时只需3小时(魏欣悦等, 2011)。还可以
通过改良脱水、包埋、染色、分色等制片环节简化实
验步骤, 减少有毒试剂的使用(杨虎彪等, 2009; Lim
et al., 2010; 王静等, 2011)。本研究在植物快速石蜡
制片中进行创新和尝试, 通过对仪器设备的选用和试
剂种类的改进, 即采用DZF-1型真空干燥箱, 利用其
温度和负压可控的性能, 加快石蜡制片进程, 使制片
周期缩短到1天。改进的技术具有使用仪器设备少、
制片质量高等优点。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 供试材料M-1
梨褐腐病菌(Monilinia fructigena (Aderh. et Rubl.)
Honey)菌种由山西农业大学农学院植物病理实验室
提供。选取白梨(Pyrus bretschneideri Rehd)作为组
织培养的材料。将梨褐腐病菌菌种接种于培养20天后
的梨果实愈伤组织表面, 每个三角瓶中接种10个愈
伤组织。梨果实愈伤组织接种褐腐病菌60小时后取
材, 用锋利的刀片小心地切取5–7 mm × 5–7 mm的
片段, 置于装有50%乙醇的玻璃小瓶中保存。

1.1.2 供试材料S-1
选用山西省农业科学院经济作物研究所培育的谷子
(Setaria italica (L.) Beauv)品种晋谷21号作为实验材
料。选取谷子抽穗期健壮新鲜的叶片, 用锋利的单面
刀片将叶片中部中脉部位切成3–5 mm的小段, 然后
投入到装有70%乙醇的玻璃小瓶中保存。
1.2 仪器和设备
实验所用仪器包括DZF-1型真空干燥箱(北京市永光
·技术方法·
204 植物学报 49(2) 2014
明医疗仪器厂)、YB-DX23B电动吸引器(上海医疗器
械工业集团公司)和KD-202轮转式切片机(浙江省金
华市科迪仪器设备有限公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 固定抽气
配制FAA固定液 I(50%乙醇 :冰乙酸 :36%–40%甲醛
=90:5:5, v/v)和FAA固定液II(70%乙醇:冰乙酸: 36%–
40%甲醛=90:5:5, v/v)(周仪, 2008)。将材料M-1和S-1
分别放入装有3–5 mL FAA固定液I和II的玻璃小瓶中,
确保材料完全浸没在固定液中。将实验材料放入真空
干燥箱中(打开瓶盖), 设定固定温度, 打开电动吸引
器设定真空压力, 当达到设定负压时关闭真空干燥箱
的真空阀, 同时关闭电动吸引器, 迅速杀死组织并排
出组织中的气体直至其沉入瓶底(表1)。

1.3.2 脱水、透明
固定结束后, 打开排气阀放出废气。打开真空干燥箱,
将小瓶内的固定液倒出, 依次换入不同体积分数比的
乙醇进行梯度脱水, 然后逐次换入脱水剂I(95%乙醇:
叔丁醇:蒸馏水=50:35:15, v/v)、脱水剂II(95%乙醇:
叔丁醇:蒸馏水=40:55:5, v/v)及脱水剂III(95%乙醇:叔
丁醇=25:75, v/v), 最后换入纯叔丁醇。由于叔丁醇兼
有脱水和透明两种作用, 因此完成此步骤之后, 不需
再进行透明步骤(表2)。

1.3.3 石蜡渗透(浸蜡)和包埋
将经过脱水、透明后的材料依次放入叔丁醇-石蜡I液
(5 g石蜡+30 mL叔丁醇)和叔丁醇-石蜡II液(15 g石蜡
+40 mL叔丁醇), 然后将真空压力设定到0.07 MPa,
温度设定为54°C, 使叔丁醇-石蜡溶液始终保持液态
(表3)。最后换入预先熔化好的纯石蜡(选用54–56°C
切片石蜡)溶液浸蜡1小时, 温度设定为56°C。包埋过
程与传统快速石蜡切片法相同。

1.3.4 切片、粘片和展片
采用KD-202轮转式切片机切取蜡片切片(厚度为
9–12 μm)。用明胶粘贴剂贴于载玻片上。粘片时必须
将蜡片完全伸展。无展片器的可在酒精灯上略加热,
蜡片受热后, 即慢慢伸直展平。然后将粘贴好的载玻


表1 固定阶段组织处理的时间、温度和负压
Table 1 Time, temperature, and negative pressure for tissue treatment at the fixation stage
Sample Fixative Time (min) Temperature (°C) Negative-press (MPa)
M-1 FAA fixative I 30 24 0.08
S-1 FAA fixative II 60 24 0.08


表2 脱水阶段组织处理的时间、温度和负压
Table 2 Time, temperature, and negative pressure for tissue treatment at the dehydration stage
Sample Dehydrating agent Time (min) Temperature (°C) Negative-press (MPa)
M-1 50% ethanol 30 24 0.08
60% ethanol 30 24 0.08
70% ethanol 60 24 0.08
t-Butanol I 60 30 0.08
t-Butanol II 60 30 0.07–0.08
t-Butanol III 60 30 0.07–0.08
* t-Butanol 60 30 0.07–0.08
S-1 70% ethanol 60 24 0.08
80% ethanol 60 24 0.08
t-Butanol I 60 30 0.08
t-Butanol II 60 30 0.07–0.08
t-Butanol III 60 30 0.07–0.08
* t-Butanol 60 30 0.07–0.08
* 溶液替换2次。* Solution is replaced twice
贺冰等: 植物材料快速石蜡制片方法 205
表3 石蜡渗透阶段材料处理的时间、温度和负压
Table 3 Time, temperature, and negative pressure for tissue treatment at the infiltration stage
Sample Paraffin infiltration agent Time (min) Temperature (°C) Negative-press (MPa)
M-1 Paraffin t-Butanol I 60 54 0.07
Paraffin t-Butanol II 60 54 0.07
* Paraffin 60 56 0.07
S-1 Paraffin t-Butanol I 60 54 0.07
Paraffin t-Butanol II 60 54 0.07
* Paraffin 60 56 0.07
* 溶液替换2次。* Solution is replaced twice


片放入真空干燥箱内进行烤片, 以便使蜡带牢固地黏
附在载玻片上, 设定温度28°C, 烤片10–30分钟。烤
片结束以后, 将载玻片取出, 降至室温备用。

1.3.5 染色和封固
采用番红-固绿双重染色法染色(李和平, 2009)。取材
料分别按以下步骤操作(除染色外各需3–5秒): 二甲
苯→无水乙醇+二甲苯(1:2, v/v)→无水乙醇+二甲苯
(1:1, v/v)→无水乙醇→95%、90%、80%、70%、60%
乙醇→1%苯胺番红染液 (50%乙醇溶液配制 )染色
5–10分钟→60%、70%、80%、90%、95%乙醇→0.5%
苯胺固绿染液 (95%乙醇溶液配制 )染色10–15秒
→95%乙醇(分色)→无水乙醇→无水乙醇+二甲苯
(1:2,v/v)和无水乙醇+二甲苯(1:1,v/v)→纯二甲苯。最
后用二甲苯稀释的加拿大树胶作为封固剂, 盖上盖玻
片封固。将封片放入真空干燥箱, 设定温度28°C, 烤
片30分钟, 制成永久玻片。

1.3.6 显微观察
使用OLYMPUS CH20光学显微镜观察切片。用
OLYMPUS BX51数码显微镜观察并拍照。
2 结果与讨论
2.1 固定、脱水和透明技术的优化
固定的目的是快速停止组织和细胞的生命活动, 尽可
能地保存材料的原有形态和结构, 所以固定的过称应
使固定液尽快渗透进组织中。固定时材料在真空干燥
箱中进行真空抽气, 并保持恒定的温度。这样材料中
的气体会被彻底迅速地抽出, 固定液在相对较高的温
度下增强了对组织的渗透能力, 使细胞各个成分得到
充分的沉淀和凝固, 避免由于材料长时间浸泡在固定
液中而发生膨胀、变硬, 使材料受破坏, 有利于获得
较好的染色和观察效果。本实验固定时间仅为30–60
分钟, 较常规快速制片(固定120分钟以上)大幅减少。
脱水即除尽材料中的水分, 使包埋剂渗透到组织
中。M-1材料的梨果肉愈伤组织非常柔软幼嫩, 含大
量水分。在脱水、透明和浸蜡过程中容易出现组织块
的脆化和变形等, 需要仔细处理(Schmelzer et al.,
1989)。而S-1材料采自谷子叶片, 材料比较纤细且易
折, 为避免脱水时间过长引起的组织变硬和变脆, 需
要严格控制脱水和透明的时间, 否则会造成后期浸蜡
时石蜡不能充分渗透到组织细胞中, 导致组织出现空
洞或破碎, 影响切片的质量。脱水和透明共需7小时,
较传统渗蜡(用时15小时以上)提高效率1倍。
叔丁醇可与水、乙醇和二甲苯等溶剂混合, 也是
石蜡的溶媒。叔丁醇不会使组织收缩和变硬, 不必经
过透明即可渗蜡, 且比熔融的石蜡轻, 是目前最好的
脱水剂(李正理, 1996)。此外, 叔丁醇的凝固点仅为
24.0–25.5°C, 在室温较低时操作困难, 而在真空干
燥箱中, 可将温度设定到30°C, 不受季节温度变化的
影响。真空干燥箱可将废气直接排出室外, 避免对实
验室造成污染。
2.2 石蜡渗透过程的改良
石蜡渗透是以石蜡-脱水剂和纯石蜡逐步替代脱水剂
和透明剂的渐进过程。在传统的植物快速石蜡制片中
使用玻璃真空干燥器置于数显水浴锅中进行, 器内温
度不易精确控制, 受室温变化的影响; 特别是纯石蜡
溶液在温度过高时, 会使材料收缩; 温度过低时会影
响石蜡的渗透速率。而在真空干燥箱中不必考虑室温
变化等因素的影响, 无需先用软蜡后换入硬蜡。在真
206 植物学报 49(2) 2014
空负压下不同的溶媒经过加温, 可加速渗蜡的进程。
实验结果显示: 使用真空干燥箱后, 渗蜡共需4小时,
较传统渗蜡方法(用时10小时以上)提高效率1倍以上。
2.3 切片分析
2.3.1 材料M-1的形态特征分析
对梨果肉愈伤组织纵切面(固绿染色)的显微观察显



图1 梨果肉愈伤组织横切面显微观察
(A) 梨果腐病菌菌丝在梨果肉愈伤组织中的侵入状态(Bar=250 μm); (B) 梨果肉愈伤组织薄壁细胞中的菌丝(Bar=100 μm)。 PH:
初级菌丝; PC: 薄壁细胞

Figure 1 Light micrographs of transverse sections of pear callus
(A) Hypha of Monilinia fructigena deeply immersed in pear callus (Bar=250 μm); (B) Detail of hyphal infection (Bar=100 μm). PH:
Primary hypha; PC: Parenchyma cells



图2 谷子叶片横切面显微观察
(A) 切片解剖结构显示叶片由叶表皮、叶肉和叶脉三部分组成(Bar=250 μm); (B) 维管束解剖结构(Bar=100 μm)。UE: 上表皮; LE:
下表皮; S: 厚壁组织; VB: 维管束; MC: 叶肉组织; XY: 木质部; PH: 韧皮部; BS: 维管束鞘; KA: 花环结构

Figure 2 Light micrographs of transverse section of millet leaf
(A) Anatomical structure of millet leaf sections showing epidermis, mesophyll and leaf vein (Bar=250 μm); (B) Vascular bundle
structure (Bar=100 μm). UE: Upper epidermis; LE: Lower epidermis; S: Selerenchyma; VB: Vascular bundle; MC: Mesophyll; XY:
Xylem; PH: Phloem; BS: Bundle sheath; KA: Kranz anatomy
贺冰等: 植物材料快速石蜡制片方法 207
示: 菌丝体侵入边缘分生组织, 进入分生组织细胞间
隙, 菌丝体呈深红色, 分生组织细胞呈淡绿色。菌丝
在细胞间清晰可见(图1)。

2.3.2 材料S-1的解剖结构分析
对谷子叶片切片横切面(番红-固绿双重染色)的显微
观察显示: 谷子叶片由表皮、叶肉和叶脉3部分组成。
在两个叶脉之间有较大的泡状细胞紧密地连接在一
起, 表皮层的外壁有硅细胞向外突出, 其上有刚毛。
在叶肉组织中未见栅栏组织和海绵组织的分化, 故为
等面叶(胡正海, 2010)。谷子叶脉为平行叶脉, 主脉处
有较大的维管束, 上表皮一侧为木质部, 而靠近下表
皮一侧为韧皮部。其外部有单层薄壁细胞组成的维管
束鞘。在各个维管束上下两面靠近表皮处可见成束的
厚壁组织, 起到机械支撑的作用。谷子叶肉中的维管
束平行排列, 其上下侧有机械组织(厚壁组织)。在谷
子各个侧脉的维管束鞘细胞周围紧密包围着1层叶肉
细胞, 呈辐射状排列, 共同形成花环结构(图2)。其结
构特征证明谷子是一种高光合效率的C4植物(Mc-
Kown and Dengler, 2007)。
2.4 讨论
植物快速石蜡切片技术克服了传统植物石蜡制片技
术存在耗时长、使用有毒害试剂多和实验步骤繁琐冗
长等诸多缺点。它不仅节省了时间, 同时也为提高制片
质量提供了一种新的方法和途径, 对一些处理时间不
能过长的组织材料尤为重要。在固定抽气、脱水透明及
石蜡渗透等步骤中, 在相对稳定的温度和真空环境下,
可以加速气体分子扩散, 加快水分子与有机溶剂的交
换和渗透速率, 使实验材料的处理时间大幅缩短, 而
实验材料中的组织结构和细胞形态依然保持完整。
本文采用真空干燥箱, 解决了传统石蜡切片技术
中常温、常压下不能解决的多项难题, 使整个实验始
终保持在可控、稳定的条件下, 从而极大地缩短了实
验时间, 避免了材料在各级溶液中长时间处理而引起
的组织变形、脆化和收缩, 使制片质量显著提高。该
技术特别适用于小型实验室的教学和研究工作, 无需
购置组织脱水机、包埋机、展片和烤片机等设备也可
达到相同的制片效果。
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Cell 10, 993–1001.

208 植物学报 49(2) 2014
A New Technique of Fast Paraffin Sectioning in Plant Tissues
Bing He*, Zhigang Li, Xiaojuan Hao, Yunchun He
College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China
Abstract The vacuum drying oven has been widely used in modern biology research. We developed a fast method for
paraffin sectioning of plant tissue using a vaccum drying oven in which temperature and negative pressure was controlled.
The fixation, dehydration, transparency, and paraffin infiltration can be performed in the vacuum drying oven. Use of the
oven in plant-tissue paraffin sectioning accelerates the infiltration rate, improves the quality of sections and save time. It
also reduces the toxic chemical fumes with indoor pollution.
Key words vacuum drying oven, fast paraffin section, tertiary butanol
He B, Li ZG, Hao XJ, He YC (2014). A new technique of fast paraffin sectioning in plant tissues. Chin Bull Bot 49, 203–
208.
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* Author for correspondence. E-mail: owenhe73@sohu.com
(责任编辑: 白羽红)