全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2015, 50 (2): 180–190, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2015.00180
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收稿日期: 2014-03-12; 接受日期: 2014-05-08
基金项目: 国家高技术研究发展计划(No.2007AA021403)、国家转基因生物新品种培育科技重大专项(No.2009ZX08009-060B)、国家自
然科学基金委员会青年科学基金(No.31100195)和宜宾学院重点科研项目(No.2013QD07)
* 通讯作者。E-mail: zyjyj@ibcas.ac.cn; gongyh01@163.com
复苏植物旋蒴苣苔J结构域蛋白编码基因BhDNAJC2的
克隆、表达与功能
陈世璇1, 3, 张振南3, 4, 王波3, 朱燕3*, 龚月桦1, 2*, 孙冬梅4, 邓馨3
1西北农林科技大学生命科学学院, 杨凌 712100; 2宜宾学院生命科学与食品工程学院, 宜宾 644000
3中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室, 北京 100093; 4黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院, 大庆 163319
摘要 热激蛋白(HSP)是一类在受到逆境刺激后大量表达的蛋白质, 能够帮助蛋白质正确折叠, 促使变性蛋白质降解, 缓
解逆境胁迫对生物体的损伤。为揭示热激蛋白在耐旱的复苏植物中的保护作用, 该研究对复苏植物旋蒴苣苔(Boea hy-
grometrica)HSP40家族中J结构域蛋白BhDNAJC2的编码基因进行了克隆、表达与功能分析。Real-time PCR检测表明, 该
基因受脱水、低温、热激等多种逆境条件和脱落酸(ABA)诱导表达。BhDNAJC2-YFP定位于细胞质、内质网和细胞核。过
表达BhDNAJC2的拟南芥(Arabidopsis thaliana)株系在干旱、热激、盐胁迫和碱胁迫下均表现出明显的抗逆性。综上所述,
BhDNAJC2可能在旋蒴苣苔抗旱、耐热及耐盐碱等胁迫反应中起关键作用。
关键词 热激蛋白, J结构域, 逆境胁迫, 亚细胞定位, 转基因植物
陈世璇, 张振南, 王波, 朱燕, 龚月桦, 孙冬梅, 邓馨 (2015). 复苏植物旋蒴苣苔J结构域蛋白编码基因BhDNAJC2的克
隆、表达与功能. 植物学报 50, 180–190.
由于高等植物一般固着于陆地, 因此植物在生长
发育过程中不可避免地遭受环境改变带来的逆境胁
迫。逆境胁迫不仅能导致蛋白质变性, 还能使合成热
激蛋白(heat shock protein, HSP)的信号转录激活,
促进热激蛋白的积累(Glynn et al., 2008)。一方面热
激蛋白能促使新生蛋白折叠和错误折叠的蛋白重新
正确折叠; 另一方面还能使变性聚集蛋白降解, 维持
一系列酶和细胞膜的稳定性。热激蛋白根据其分子量
的大小分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、
HSP40和小热激蛋白 (small heat shock proteins,
sHSPs) (Al-Whaibi, 2011)。
J结构域蛋白(DNAJ蛋白)是HSP40家族成员, 最
初发现于大肠杆菌(Escherichia coli)中, 近年发现它
们作为分子伴侣单独或者与HSP70结合, 参与植物
的生长发育、信号转导以及抵抗环境胁迫(Shen et
al., 2011)。由70个氨基酸残基组成的J结构域是与
HSP70互作的主要区域, 它具有4个α螺旋和C端终止
域, 并且在螺旋II和III之间有一个包含高度保守的三
肽(组氨酸、脯氨酸和天冬氨酸残基, HPD基元)环状
区。几乎所有的HSP40/DNAJ家族成员都包含J结构
域(J-domain), 只有极少数例外。根据保守区域相似
性, DNAJ家族分为3类。类型I蛋白与E. Coli的DnaJ
类似, 除了J结构域以外, 还有甘氨酸/苯丙氨酸富集
区域 (Gly/Phe-rich region) 和半胱氨酸重复区域
(Cysteine repeats)。类型II蛋白有J结构域和甘氨酸/
苯丙氨酸富集区域, 但是缺少半胱氨酸重复区域。类
型 III蛋白除了J结构域外不含有任何其它保守区域
(Horne et al., 2010)。
已鉴定的J结构域蛋白多定位于细胞器, 受干旱、
高温、低温、强光、甲基紫精(methyl viologen, MV)
和脱落酸(abscisic acid, ABA)等诱导表达, 并参与植
物胁迫应激响应。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,
过表达编码线粒体J结构域蛋白的BIL2基因能够增强
植物的耐盐性和对强光的耐受能力(Bekh-Ochir et
al., 2013); 而另一个定位于线粒体J结构域蛋白
AtDjB1能增强线粒体mtHSC70-1的ATPase活性, 并
·研究报告·
陈世璇等: 复苏植物旋蒴苣苔 J 结构域蛋白编码基因 BhDNAJC2 的克隆、表达与功能 181

能使过表达该基因的转基因拟南芥在经受热激锻炼
后提高氧化应激能力(Zhou et al., 2012)。同时还有研
究表明, AtDjB1是渗透胁迫的负调控因子, 其表达受
NaCl和聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)诱导, 敲
除该基因后的转基因拟南芥表现出ABA超敏感表型
(Wang et al., 2014)。在番茄(Lycopersicon escu-
lentum)中 , 叶绿体定位的J结构域蛋白LeCDJ1在
PEG、低温、热激、强光、MV、NaCl和ABA处理下
基因表达显著增强; 而对其过表达转基因植物的分析
显示, LeCDJ1在低温胁迫下能与HSP70相互作用而
维持PSII的稳定性(Kong et al., 2014)。根据文献报
道, 定位于细胞质和细胞核的J结构域蛋白多见于哺
乳动物和酵母中, 而在植物中较少见。
复苏植物是一类能忍受极度干旱, 在复水后又
能恢复生长的植物, 其独特的耐旱复苏能力显示出
植物适应性的巨大潜力。脱水后的复苏植物耐低温和
高温的能力提高。例如, 苦苣苔科中分布最北的一种
复苏植物旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)能以脱水状
态在北纬40°附近地区越冬, 并能在以石灰岩为主的
喀斯特地区生长旺盛, 表明脱水诱导的一些保护机
制也有利于植物对其它环境胁迫的耐受性(Mitra et
al., 2013)。目前已发现该植物中的一系列抗旱相关
基因(Liu et al., 2009; Wang et al., 2009; Zhu et al.,
2009; 张兰军等, 2012)。为进一步明确复苏植物抗
逆保护的分子机理并挖掘有重要功能的抗逆基因,
本研究对旋蒴苣苔中的一个编码J结构域蛋白的基因
进行了克隆、表达及功能研究, 以期阐明该基因在提
高植物对干旱、盐碱和高温等逆境抗性中的作用机
制。
1 材料与方法
1.1 植物材料和胁迫处理
旋蒴苣苔(Boea hygrometrica (Bunge) R. Br.)来源于
野外旋蒴苣苔自交纯系后代。培养温度为25°C, 相对
湿度为50%, 光照周期为16小时光照/8小时黑暗。取
正常条件下生长3个月的旋蒴苣苔进行处理。干旱-复
水处理: 分别在停止浇水后0天(F)、5天(S5d)、14天
(S14d)和复水后3天(R3d)取地上部分作为样品。高温
和低温处理: 分别将整株旋蒴苣苔置于4°C和37°C处
理24小时。氧化胁迫、盐胁迫、碱胁迫以及ABA处理:
分别用20 mmol·L–1 MV、20 mmol·L–1 CaCl2、20
mmol·L–1 KOH (pH9.0)和100 μmol·L–1 ABA的水溶
液浇灌植株并在48小时后取样。
拟南芥Columbia-0生态型的种子用70%乙醇清
洗30秒, 用10%次氯酸钠消毒15分钟, 再用无菌水洗
3–5次后播种于1/2 MS培养基上。在4°C黑暗保湿冷
藏3天打破休眠后, 置于22°C、相对湿度为50%、光
照周期为16小时光照/8小时黑暗的无菌培养室培养,
1周后移植到土壤中, 相同条件下培养。
1.2 RNA提取、第1链cDNA的合成和BhDNAJC2
基因的克隆
用总RNA提取试剂盒(Trizol Reagent, TaKaRa)提取
样品总RNA, 并用DNase I (TaKaRa)纯化。按照
SuperScript III反转录酶(Invitrogen)说明书合成第1
链cDNA, 作为基因扩增及荧光定量PCR (real-time
PCR, RT-PCR)的模板。
1.3 ReaI-time PCR
用Realplex PCR仪(Eppendrof公司)实时定量检测基
因表达。基因特异性引物为5′-GTTCTTGGTGTTC-
GCTCGTAC-3′ 和 5′-AGCAGAGCCGTACAATCCA-
G-3′。PCR反应程序: 95°C预变性5分钟; 94°C变性30
秒, 55°C退火30秒, 72°C延伸1分钟; 40个循环; 72°C
延伸10分钟。以18S rRNA作为对照, 所用引物序列
为 5′-CTTAGTTGGTGGAGCGATTTG-3′ 和 5′-CCT-
GTTATTGCCTCAAACTTCC-3′, 退火温度为58°C,
循环数为40。实验数据用MX3000P软件分析, 采用
2−∆∆Ct法分析基因相对表达量(Livak and Schmittgen,
2001)。
1.4 生物信息学分析
用 ClustalX 1.83 和 Genedoc 软件进行序列比对
(Thompson et al., 1997)。用Wolf psort软件(http://
wolfpsort.seq.cbrc.jp/)进行蛋白质亚细胞定位预测分
析(Horton et al., 2007)。
1.5 BhDNAJC2-YFP融合蛋白表达载体构建
将BhDNAJC2基因去除终止密码子的完整开放阅读
框的PCR产物回收纯化后用Hpa I单酶切质粒, 经1%
核酸琼脂糖凝胶电泳及DNA回收试剂盒回收纯化后,
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用T4 DNA Ligase与经过相同酶切的载体pENSG在
16°C下连接过夜, 以构建BhDNAJC2-YFP融合蛋白
表达载体。连接产物采用热激法转化E. coli DH5α (de
Rybel et al., 2011)。采用碱裂解法提取质粒, 对重组
表达质粒进行PCR酶切和测序验证。
1.6 烟草叶片瞬时表达与激光共聚焦成像
挑取含有BhDNAJC2-YFP融合表达载体的农杆菌单
菌落接种于10 mL LB液体培养基中(含50 μg·mL–1卡
那霉素, 35 μg·mL–1利福平, 50 μg·mL–1庆大霉素),
28°C振荡培养过夜。扩大培养至OD600约1.0时收集菌
体, 重悬于含10 mmol·L–1 MgCl2、10 mmol·L–1 MES
(pH5.7)和150 μmol·L–1乙酰丁香酮的溶液中, 黑暗下
振荡培养1小时。用下表皮注射法注射烟草(Nicotiana
benthamiana)叶片(Sparkes et al., 2006)。2天后, 将
叶片置于双光子激光扫描显微镜(FV1000MPE, 日本
Olympus)下观察烟草叶片中YFP信号。
1.7 载体构建与转基因拟南芥的获得
用引物 5′-CACCTTTGATTTCTGAATGGAGTTC-3′
和 5′-TTGTGAAGCTGGTACACTCGAATTT-3′ 扩增
BhDNAJC2全长基因, 通过Gateway@Enzyme Mix
(Invitrogen)构建35S:BhDNAJC2过表达载体。转化入
大肠杆菌, 挑选阳性克隆, 测序验证。用电击法转化
农杆菌菌株GV3101, 挑取阳性克隆培养, 用浸花法
转化拟南芥(Katavi et al., 1994)。经10 mg·L–1草胺膦
(phosphinthricin, PPT)筛选得到T1代阳性植株, 再用
PPT筛选T2代种子, 获得符合3:1分离比的纯合转基
因株系。
1.8 转基因拟南芥抗逆性分析
渗透及盐碱胁迫处理: 将1/2 MS培养基(1%蔗糖, 1%
琼脂, pH5.6)上正常萌发并生长3天的拟南芥幼苗分
别转移到1/2 MS (pH5.6, 对照)、1/2 MS+20% PEG、
1/2 MS+150 mmol·L–1 NaCl和1/2 MS (pH9.0)培养基
上进行垂直培养 , 10天后观察表型 (Verslues and
Bray, 2004)。低温胁迫处理: 取在1/2 MS+1%蔗糖
+0.6%琼脂的培养基上正常生长3天的拟南芥幼苗置
于4°C、相对湿度为50%、光照周期为16小时光照/8
小时黑暗的光照培养箱中, 培养1天后转至正常条件
培养。
热激处理: 取在1/2 MS+1%蔗糖+0.6%琼脂的培
养基上生长1周左右长出真叶的拟南芥幼苗; 处理1:
将拟南芥幼苗置于37°C培养1小时, 再置于22°C培养
3小时, 然后于49°C热激1小时; 处理2: 直接将拟南
芥幼苗置于45°C热激1小时。2种处理结束后, 将幼苗
置于22°C、相对湿度为50%、光照周期为16小时光
照/8小时黑暗的无菌培养室培养。
1.9 Fv/Fm和相对电导率测定与数据分析
以不同处理下的拟南芥幼苗为材料, 用调制叶绿素荧
光成像系(MAXI-Imaging-Pam, 德国Walz公司)测定
PSII原初光能转化效率(Fv/Fm)。用电导率仪(EC215,
意大利HANNA公司)测定相对电导率。每个处理设3
个重复, 每个株系至少测6个植株。所得数据用SAS
9.2软件统计。采用单因素方差分析Ducan’s多重比较
法对数据进行统计分析(P=0.05, n=3)。
2 结果与讨论
2.1 BhDNAJC2基因的克隆和序列分析
从旋蒴苣苔叶片中克隆到1个913 bp的cDNA片段。序
列分析表明, 其含有1个完整CDS序列, 其开放阅读
框(ORF)长度为504 bp, 编码1个含有168个氨基酸
残基的蛋白质(图1A)。该蛋白在N-端有1个J结构域
(大约占全序列的34%), 而并无甘氨酸/苯丙氨酸富集
区域和半胱氨酸重复区域, 因此属于DNAJ亚家族第
III类, 被命名为BhDNAJC2。
蛋白质序列比对发现, BhDNAJC2与其它DNAJs
的序列相似度在33%–56%之间, 但在J结构域之外
的序列相似性很低, 表明BhDNAJC2是DNAJ家族的
一个新蛋白。将与BhDNAJC2同源性较高的16个蛋白
进行多重序列比对, 发现它们都含有特征性的高度保
守的三肽基元(HPD), 除此之外没有其它保守结构域
(图1B)。HPD是DNAJ与HSP70相互作用的核心序列,
表明BhDNAJC2可能与HSP70结合。BhDNAJC2同
源蛋白多定位于细胞核和叶绿体 , 除拟南芥的
AT1G56300 (XP_177256)具有核定位信号肽外, 其
余蛋白预测均无信号肽。而蛋白质亚细胞定位预测分
析结果表明, BhDNAJC2定位于细胞质和细胞核, 在
N-端含有1个EFRG内质网膜信号肽和RRKR核定位
信号(图1B)。
陈世璇等: 复苏植物旋蒴苣苔 J 结构域蛋白编码基因 BhDNAJC2 的克隆、表达与功能 183


图1 BhDNAJC2的序列分析
(A) BhDNAJC2的cDNA序列及氨基酸序列(J结构域用下划线标注); (B) BhDNAJC2与含有J结构域蛋白的保守结构域的氨基酸序列
比对(黑色方框表示保守的三肽(HPD)基元、EFRG内质网膜滞留信号和RRKR核定位信号; 横线表示4个α螺旋)

Figure 1 Sequence analysis of BhDNAJC2
(A) Nucleotide and deduced amino acid sequences of BhDNAJC2 (The putative J-domain is underlined); (B) Amino acid se-
quences of BhDNAJC2 and other J-domain-containing proteins (Black boxes are HPD conserve domain, EFRG ER membrane
retention signal and RRKR nuclear localization signal; Horizontal lines are four helix structures)
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图2 BhDNAJC2-YFP的亚细胞定位
Fluorescence表示荧光信号; Bright light表示明场; Merged表示整合后的图片。Bar=40 μm

Figure 2 Subcellular localization of BhDNAJC2-YFP
Fluorescence indicates confocal images under the YFP channel; Bright light indicates confocal images of the same cells with
transmitted light; Merged indicates the merged images of YFP confocal images and transmitted light. Bar=40 μm

2.2 BhDNAJC2的亚细胞定位
为了确定BhDNAJC2的亚细胞定位 , 我们构建了
BhDNAJC2-YFP蛋白融合表达载体。瞬时表达结果
显示, 在细胞核和细胞质以及类似于内质网的部位均
出现荧光信号(图2)。因此推测BhDNAJC2定位于细
胞核和细胞质以及内质网, 与预测结果一致。
2.3 BhDNAJC2基因表达对环境胁迫和ABA信号
的响应
为检测BhDNAJC2对环境胁迫和ABA信号的响应 ,
用Real-time PCR检测了BhDNAJC2基因在不同处理
下的表达变化情况(图3)。结果表明, 在干旱5天(叶片
萎蔫, 相对含水量降至40%–60%)后, BhDNAJC2基
因表达量略上调到1.5倍, 干旱14天(叶片完全脱水卷
曲 , 相对含水量降至10%以下)后其升高至20.5倍 ,
复水时表达量下降, 基本回复到未处理前水平; 在
4°C、37°C、MV、pH9.0和ABA处理下, BhDNAJC2
基因表达量均上调, 与未处理相比, 均有显著差异;
而CaCl2处理下升高幅度较小(1.8倍)。说明该蛋白受
干旱、低温、热激、MV、pH9.0等胁迫条件和ABA
信号诱导, 尤其在重度干旱时大量积累。
2.4 转基因植物的获得及其抗逆性分析
为进一步揭示BhDNAJC2蛋白的功能, 我们构建了
35S:BhDNAJC2植物表达载体(图4A), 得到3个过表
达该基因的拟南芥纯合株系, 分别为OE4-5、OE7-7
和OE8-7。对这3个株系中BhDNAJC2的表达量进行
分析, 发现转基因植物中BhDNAJC2表达水平较高
(图4B)。其中, OE8-7表达量最高, OE7-7次之, OE4-5
最低。
电导率是衡量细胞质膜是否受到伤害的指标。
Fv/Fm反映PSII反应中心光能转化效率。因此我们以电
导率、Fv/Fm和生长情况为指标, 检测了BhDNAJC2
过表达转基因植物在PEG模拟干旱、低温和不同热激
胁迫条件下及盐碱胁迫下的表型。结果表明, 非胁迫
条件下, 过表达株系与野生型(wild type, WT)没有差
异, 相对电导率均在20%左右, Fv/Fm在0.8左右(图5)。
在20% PEG模拟干旱胁迫下, WT与过表达植物均
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图3 各种处理对旋蒴苣苔BhDNAJC2基因表达的影响
(A) 在干旱-复水过程中BhDNAJC2的表达(F为未处理, S5d为
干旱5天, S14d为干旱14天, R3d为复水3天); (B) 不同胁迫和
信号分子对BhDNAJC2表达的影响(F为未处理, 不同胁迫处理
分别为4°C、37°C、20 mmol·L–1 CaCl2、20 mmol·L–1 MV、100
μmol·L–1 ABA和pH9.0)

Figure 3 Expression of BhDNAJC2 under various treat-
ments in Boea hygrometrica
(A) Expression of BhDNAJC2 under dehydration and rehy-
dration treatments (F: Fresh leaves; S5d: Leaves dehydrated for
5 days; S14d: Leaves dehydrated for 14 days; R3d: Leaves
rehydrated for 3 days after dehydrated for 14 days); (B) Ex-
pression of BhDNAJC2 under other various treatments (F:
Fresh leaves; other various treatments are 4°C, 37°C, 20
mmol·L–1 CaCl2, 20 mmol·L–1 MV, 100 μmol·L–1 ABA and pH9.0)

图4 35S:BhDNAJC2转基因拟南芥株系的RT-PCR检测结果
(A) 35S:BhDNAJC2载体结构示意图; (B) 35S:BhDNAJC2转基因株系RT-PCR验证。WT: 野生型; OE4-5, OE7-7, OE8-7: 过表达
BhDNAJC2的转基因拟南芥株系

Figure 4 Analysis of 35S:BhDNAJC2 transgenic Arabidopsis lines
(A) Map of vector 35S:BhDNAJC2; (B) Expression of 35S:BhDNAJC2 in transgenic Arabidopsis OE line. WT: Wild-type; OE4-5,
OE7-7, OE8-7: Transgenic lines overexpressing BhDNAJC2


表现为子叶发黄, 生长受到抑制, 幼苗大小与根长无
明显差异; 但野生型植物相对电导率高达45%, Fv/Fm
下降至0.5, 变化显著, 而转基因植物相对电导率的
上升(至30%左右)和Fv/Fm的下降(至0.6左右)均未达
到显著水平(图5A)。其中OE8-7生长状态最好, 相对
电导率最小, Fv/Fm值最大; OE7-7与OE4-5略弱, 这
与3个株系的BhDNAJC2表达量一致。可见在干旱胁
迫下, BhDNAJC2过表达株系较野生型植物细胞膜系
统更完整, 具有更高的光合潜力。
在150 mmol·L–1 NaCl的盐胁迫下, WT几乎全部
黄化, 相对电导率高达70%, Fv/Fm也显著下降(降至
0.2), 表明细胞膜系统已经被破坏, 光合作用失活;
而过表达株系叶片呈绿色, 主根长, 相对电导率虽升
高至50%, 但Fv/Fm仍保持在0.8左右, 与未处理前均
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图5 过表达BhDNAJC2的转基因拟南芥与野生型在干旱和盐胁迫条件下的表型分析
(A) 过表达BhDNAJC2的转基因拟南芥与野生型在1/2 MS对照和20% PEG8000处理条件下的表型及生化指标(根长、相对电导率和
Fv/Fm)分析; (B) 过表达BhDNAJC2的转基因拟南芥与野生型在1/2 MS对照和150 mmol·L–1 NaCl处理条件下的表型及生化指标(根
长、相对电导率和Fv/Fm)分析。WT: 野生型; OE8-7, OE7-7, OE4-5: 过表达BhDNAJC2的转基因拟南芥株系。Bar=1 cm

Figure 5 Phenotype of transgenic Arabidopsis plants overexpressing BhDNAJC2 and wild-type under PEG mediated osmotic
stress and salt treatment
(A) Phenotype and biochemical criterion (primary root length, relative electrolytic leakage and photochemical efficiency (Fv/Fm))
of Arabidopsis seedlings grown on 1/2 MS plate and 1/2 MS plate with 20% PEG8000; (B) Phenotype and biochemical criterion
(primary root length, relative electrolytic leakage and photochemical efficiency (Fv/Fm)) of Arabidopsis seedlings grown on 1/2 MS
plate and 1/2 MS plate with 150 mmol·L–1 NaCl. WT: Wild-type; OE8-7, OE7-7, OE4-5: Transgenic lines overexpressing
BhDNAJC2. Bar=1 cm
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图6 过表达BhDNAJC2的转基因拟南芥与野生型在碱胁迫下和热激胁迫下的表型分析
(A) 过表达BhDNAJC2的转基因拟南芥与野生型在1/2 MS对照和1/2 MS (pH9.0)碱胁迫处理条件下的表型及生化指标(根长、相对
电导率和Fv/Fm)分析; (B) 过表达BhDNAJC2的转基因拟南芥与野生型在获得抗热性(T1)和基本抗热性(T2)处理条件下的表型及绿
苗率。WT: 野生型; OE8-7, OE7-7, OE4-5: 过表达BhDNAJC2的转基因拟南芥株系。Bar=1 cm

Figure 6 Phenotype comparison of wild-type and transgenic Arabidopsis plants overexpressing BhDNAJC2 under alkaline
(pH9.0) stress and heat shock treatment
(A) Phenotype and biochemical criterion (primary root length, relative electrolytic leakage and photochemical efficiency (Fv/Fm))
of Arabidopsis seedlings grown on 1/2 MS plate and on 1/2 MS plate (pH9.0); (B) Phenotype and ratio of green seedlings of
Arabidopsis seedlings grown on acquired thermotolerance (T1) and basal thermotolerance (T2) heat shock treatment. WT:
Wild-type; OE8-7, OE7-7, OE4-5: Transgenic lines overexpressing BhDNAJC2. Bar=1 cm
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无显著差异 , 表明转基因植物抗盐胁迫能力提高
(图5B)。
在碱胁迫下, WT生长受到抑制, 根变短, 叶片变
小且黄化, 相对电导率是正常条件下的3倍, 细胞膜
已受到严重破坏; 而转基因植物生长状况、Fv/Fm和相
对电导率均未受明显影响(图6A)。在抗热性方面, 当
植物未经过热激锻炼就直接处于热激条件下时, 过表
达株系和WT全部死亡。而经过37°C1小时热激锻炼
后, 转基因株系的耐热性明显增强, 恢复培养后绿芽
率高达70%; 而野生型只有23%(图6B)。说明Bh-
DNAJC2能够增强植物的获得性耐热性。与此相反,
低温处理后转基因株系和野生型植物生长均受到抑
制, 叶片黄化, Fv/Fm降低, 相对电导率上升; 但转基
因株系和野生型植物之间未见明显差异(数据未显
示)。
2.5 讨论
在复苏植物中已发现多种sHSP和HSP70等HSP基因
(Ingle et al., 2007), 但编码J结构域蛋白的基因尚属
首次被报道。生物界存在很多种编码J结构域蛋白的
基因, 根据蛋白质结构的不同可分为I、II和III三类
(Kroczynska and Blond, 2001)。生物信息学分析表
明, 大肠杆菌有5种编码J结构域蛋白的基因, 农杆菌
有7种, 酵母中有22种, 水稻有101种, 拟南芥中有
120种(Miernyk, 2001)。本文报道的BhDNAJC2是编
码复苏植物旋蒴苣苔 III类J结构域蛋白的一个新基
因。
J结构域蛋白可以作为分子伴侣单独或与HSP70
结合而协助维持蛋白质结构的稳定(Kelley, 1998),
因此对植物在逆境下的生存起到重要作用。例如, 拟
南芥中线粒体J结构域蛋白Mdj1p能帮助新合成的蛋
白质正确折叠, 并能防止高温胁迫下变性蛋白的聚集
(Rowley et al., 1994)。BhDNAJC2过表达植株在盐、
高温、碱和干旱胁迫下表现出明显抗逆性。以往研究
显示, 干旱会在植物体内产生渗透胁迫, 使植物因缺
水受到伤害, 表现在植物的生长和发育受抑制、光合
能力下降、活性氧伤害和代谢失调等方面(Shinozaki
and Yamaguchi-Shinozaki, 2007)。盐胁迫不但对植
物造成渗透胁迫, 而且使得离子平衡紊乱, 酶活性发
生变化, 进而影响植物的正常生理活动(Chaves et
al., 2009)。碱胁迫不仅会直接伤害植物的根部, 破坏
根系的生长与细胞的分化, 还能改变细胞的结构与膜
的稳定性, 干扰跨膜电位的形成, 致使根细胞功能及
代谢紊乱(Yang et al., 2009)。热激胁迫使植物根系活
力下降 , 矿质营养吸收减慢 , 导致植株萎蔫早衰
(Kregel, 2002)。BhDNAJC2对提高植物逆境抗性的
作用机制未知, 但可以推测其参与的可能是多种逆境
共有的反应, 属于基础抗性。
蛋白质在细胞中的定位与其执行的功能有很大
关系。拟南芥的J结构域蛋白中有50个定位于细胞质,
19个定位于线粒体, 12个定位于叶绿体, 9个定位于
内质网, 3个定位于细胞骨架, 1个定位于细胞质膜,
24个定位于细胞核 , 2个定位于液泡中(Rajan and
D’Silva, 2009)。BhDNAJC2定位于细胞核、内质网
和细胞质, 与定位于其它细胞器的J结构域蛋白相比,
可能具有更加广泛的功能, 这可能是其能提高多种逆
境抗性的机制之一。
张振南等报道旋蒴苣苔小热激蛋白基因家族中
存在很多除了受干旱和冷胁迫诱导外, 在CaCl2、MV
和pH9.0处理下表达也上调的基因 (Zhang et al.,
2013)。与此相似, BhDNAJC2基因也受干旱、低温、
高温、盐、碱和氧化等胁迫条件及ABA诱导, 表明该
基因可能参与多种逆境胁迫的反应。HSF因子在热激
蛋白表达的调控中起重要作用。已发现旋蒴苣苔中干
旱诱导的热激因子基因BhHsf1在拟南芥和烟草等植
物中过表达时可促进下游热激蛋白等基因的表达, 提
高转基因植物的抗旱和抗热性(Zhu et al., 2009)。
BhDNAJC2的表达是否受到BhHsf1等转录因子的调
控、是否与特定HSP70和小热激蛋白互作, 还有待于
进一步研究。
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Cloning, Expression and Functional Analysis of a J-domain Protein-
coding Gene, BhDNAJC2, from the Resurrection Plant
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Shixuan Chen1, 3, Zhennan Zhang3, 4, Bo Wang3, Yan Zhu3*, Yuehua Gong1, 2*, Dongmei Sun4, Xin Deng3
1College of Life Sciences, Northwest Agriculture & Forestry University, Yangling 712100, China; 2College of Life Sciences
and Food Engineering, Yibin University, Yibin 644000, China; 3Key Laboratory of Plant Resources, Institute of Botany, Chi-
nese Academy of Sciences, Beijing 100093, China; 4College of Life Sciences and Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural
University, Daqing 163319, China
Abstract Heat shock proteins (Hsps) can relieve environmental stress damage by aiding proper folding or degradation
of denatured proteins. The resurrection plant Boea hygrometrica can tolerate desiccation and revive after rehydration. In
desiccated leaves of B. hygrometrica, an Hsp-coding gene was cloned and designated BhDNAJC2. Sequence analysis
revealed that BhDNAJC2 contained a J-domain and thus was a novel member of the Hsp40 family. Real-time PCR re-
vealed that BhDNAJC2 was induced by dehydration, cold, heat, oxidative, alkaline stresses and abscisic acid treatment.
Confocal microscopy revealed the BhDNAJC2-YFP fusion protein in the endoplasmic reticulum, nucleus and cytoplasm.
Compared to the wild type, Arabidopsis plants overexpressing BhDNAJC2 showed improved stress tolerance under
drought, heat, salt and alkaline stresses, as indicated by better growth, higher Fv/Fm, and lower electrolytic leakage.
BhDNAJC2 likely plays a key role in resistance to osmotic, saline, alkaline and heat stresses in B. hygrometrica.
Key words heat shock protein, J-domain, stress tolerance, subcellular localization, transgenic plant
Chen SX, Zhang ZN, Wang B, Zhu Y, Gong YH, Sun DM, Deng X (2015). Cloning, expression and functional analysis of
a J-domain protein-coding gene, BhDNAJC2, from the resurrection plant Boea hygrometrica. Chin Bull Bot 50, 180–190.
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* Authors for correspondence. E-mail: zyjyj@ibcas.ac.cn; gongyh01@163.com
(责任编辑: 白羽红)