全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2011, 46 (3): 311–318, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2011.00311
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收稿日期: 2010-12-01; 接受日期: 2011-01-24
基金项目: 863计划(No.2007AA100503)、吉林省科技发展计划重点项目(No.20070922)和高等学校科技创新工程重大项目培育资金项目
(No.70S018)
* 通讯作者。E-mail: hyli99@163.com; xiaokunli@163.net
转基因红花中角质细胞生长因子KGF-1的表达
江莺1, 2, 刘秀明1, 3, 马吉胜1, 李巍1, 3, 朱海林1, 3, 杜美丽1, 3, 李海燕1, 3*, 李校堃 1*
1吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心, 长春 130118; 2吉林农业大学中药材学院, 长春 130118
3吉林农业大学生命科学学院, 长春 130118
摘要 通过构建重组表达质粒载体p139035S-KGF1和根癌农杆菌介导在红花(Carthamus tinctorius)中表达角质细胞生长
因子(KGF-1)。从侵染到诱导生根共需要14周, 转化率达0.1%。红花子叶在潮霉素筛选培养基上培养4–5周后便可获得丛生
芽, 再生芽移入含潮霉素的伸长生根培养基, 培养4–8周可诱导生根。通过PCR、Southern blot、RT-PCR及Western blot
检测证明目的基因KGF-1已经整合到红花细胞的染色体中, 实现了KGF-1外源蛋白在红花中的成功表达, 为开发KGF-1蛋
白新的生产途径奠定了基础。
关键词 根癌农杆菌, 角质细胞生长因子, 转基因红花
江莺, 刘秀明, 马吉胜, 李巍, 朱海林, 杜美丽, 李海燕, 李校堃 (2011). 转基因红花中角质细胞生长因子KGF-1的表达.
植物学报 46, 311–318.
近年来, 植物生物反应器以其生产成本低、安全、
易规模化生产等优点, 为世界科学研究的发展创造了
新的机遇。Rybicki(2009)认为植物比细菌、酵母(或
昆虫)和哺乳动物细胞等反应器系统更有开发潜力。
植物表达的大量重组蛋白已经进行临床试验, 其中少
数已经市场化生产。自从1986年转基因植物被批准进
入田间试验, 到1997年1月31日, 据美国农业部动植
物检疫局(APHIS)的统计数据, 美国已批准的转基因
植物田间试验达2 584例。Calgene公司研制的延熟番
茄FLAVRSAVRTM于1994年被批准商业化。截止
1997年1月31日, 被批准商业化的转基因植物美国有
17例, 加拿大18例, 澳大利亚4例, 日本7例。我国也
于1997年上半年批准了转基因延熟番茄的商业化(贾
士荣, 1997)。2001年, 我国已有10余种转基因植物进
入田间试种, 有6种转基因植物被批准商品化生产(沈
桂芳等, 2001)。到2005年, 抗虫棉、耐贮番茄等基因
已转入几乎所有主要的粮食和饲料作物, 涉及各类基
因100多种, 有30余项在我国已经被批准商品化生产
(李轶女等, 2006)。
红花(Carthamus tinctorius)为菊科(Compositae)
一年生草本植物, 又名川红花、刺红花(榕嘉, 2002)。
红花是油药两用作物, 干燥管状花是一味常用中药,
性辛、温, 具有活血通络、祛瘀止痛的功效。红花含
有丰富的红花黄色素和少量的红色素, 是一种天然的
食用色素。红花籽油中亚油酸是高级烹饪油且广泛用
于医药和化工工业。目前红花组织培养有器官发生途
径和体细胞胚途径。利用器官发生途径形成红花再生
植株包含2种方式, 一种是器官发生直接途径, 即在
外植体上直接分化出芽; 另一种是器官发生间接途
径, 即外植体先形成愈伤组织, 再进行芽的分化(李
爱新等, 2006; Radhika et al., 2006)。在转基因红花
方面, 早在20多年前美国就已成功获得转基因红花
(Ying et al., 1992)。2008年, 加拿大SembioSys生物
工程公司申请了专利, 利用北美洲普遍栽培的高产油
料作物红花成功生产出“红花子来源人胰岛素”, 并
在2009年顺利通过动物药理实验与I期和II期临床试
验(Webb et al., 2009), 其药代动力学与药效学实验
结果与美国利用大肠杆菌表达胰岛素基因生产的重
组DNA人胰岛素基本相同。2010年, SembioSys公司
向美国FDA提出做III期临床的申请。通过转基因红花
生产胰岛素工艺简单、成本低且产量高, 可为糖尿病
患者提供廉价的胰岛素来源(徐铮奎, 2010)。
·研究报告·
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角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,
KGF)是Rubin等从胚胎肺成纤维细胞培养上清中发
现的, 为FGF家族成员, 即FGF-7(宗宪磊等, 2009)。
KGF-1由间质细胞产生, 通过旁分泌机制分泌, 与上
皮细胞上的特异性受体结合, 与上皮创伤愈合、胚胎
发育、肿瘤形成与发展及免疫重建关系密切。KGF-1
是一种特异性的有效促进细胞增殖的生长因子, 在损
伤修复过程中可大量诱导表达, 促进上皮细胞的增
殖、迁移及分化, 而且又能加强皮肤毛囊和皮脂腺的
前体细胞增殖和分化。KGF-1在美容行业可以促进毛
发再生, 消除皱纹。2006年, 采用农杆菌介导的转基
因方法, 苏勇波(2006)获得了人角质细胞生长因子的
水稻(Oryza sativa)及胡萝卜(Daucus carota)转化植
株。经过PCR、RT-PCR及Western blot检测证明了
人角质细胞生长因子基因已经整合到转基因植株的
基因组中, 并表达了相应的蛋白。张国广等(2010)在
水稻中成功表达了角质细胞生长因子基因。
药油两用作物红花作为一种植物生物反应器来
生产医药用蛋白, 上游生产成本低廉、安全, 其可食
用性使得下游加工费用低, 易规模化生产, 因此被广
泛应用(Rybicki, 2009)。本实验利用根癌农杆菌LBA-
4404介导的方法在植物红花中表达KGF-1, 既优化
了红花的再生体系, 又表达了外源蛋白。这种高效的
植物生物反应器系统可以更好地发掘红花的生产潜
力, 具有十分重要的经济意义和商业价值。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 植物材料及质粒和菌种
新疆裕民无刺红花(Carthamus tinctorius L.)由本实
验室提供。质粒p1390r(35S启动子)和PUC19-KGF1、
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α及根癌农杆菌(LBA-
4404)均为本实验室保存。

1.1.2 酶和试剂
限制性内切酶KpnI、BglII、HindIII、Pyrobest DNA
polymerases、T4 DNA连接酶、DNA Marker和
RNAiso Plus等均购自日本TaKaRa公司。DNA Gel
Extraction Kit和质粒小提试剂盒等购自北京艾德莱
生物科技有限公司。PCR引物合成及测序由北京六合
华大基因科技股份有限公司完成。植物基因组提取试
剂盒、2×Power Taq PCR MasterMix购自北京百泰克
生物技术有限公司。DIG High Prime DNA Labelling
and Detection Starter Kit I购自美国Roche公司。细
胞分裂素(6-BA)、生长素(NAA)、卡那霉素(Kam)、
链霉素(Str)和利福平(Rif)等购自美国Sigma公司。乙
酰丁香酮(AS)购自日本Wako公司。头孢曲松钠(Cef)
和羧苄西林钠(Carb)购自哈尔滨制药股份有限公司。
潮霉素(Hyg)购自Boehringer Mannheim公司。其它常
规试剂均为国产或进口分析纯试剂。
1.2 实验方法
1.2.1 潮霉素敏感性实验
待红花种子发芽后, 将子叶外植体先置于共培养基上
暗培养3天 , 然后转至分别含有0、2、4、6、8、
10 mg·L–1 潮霉素(Hyg)的子叶共培养基上培养。实
验重复2次, 不同浓度潮霉素培养基每次做6个重复,
每个重复中含有10个外植体。于自然光下观察4周,
观察不同浓度的潮霉素对红花子叶的影响。

1.2.2 KGF-1基因的获得
以KGF-1片段的 cDNA植物偏好序列为基础 , 用
Primer 5.0软件设计合成特异性上下游引物P1、P2。
其中上游引物含有KpnI酶切位点(表1斜体部分)和起
始密码子ATG, 下游引物含有BgIII酶切位点(表1斜体
部分)和终止密码子TAA。引物序列见表1。
通过梯度PCR获得最佳退火温度为64°C。以质
粒PUC19-KGF1为模板, P1、P2为上下游引物, 扩增
得到515 bp的KGF-1片段。反应体系总体积为50 μL,
其中Pyrobest DNA Polymerases 0.25 μL, 10×
Pyrobest Buffer II 5 μL, 2.5 mmol·L–1 dNTP 4 μL, P1
和P2(浓度均为10 μmol·L–1)各1 μL, 模板 1 μL,
ddH2O 37.65 μL。PCR反应程序为: 94°C预变性5分

表1 引物序列
Table 1 Primer sequence
Primers Sequence(5–3) Restriction enzyme
cutting site
P1


P2
GGGGTAC-
CATGTGCAACGATATGAC
TCCA
AGTAGATCTTCTTAAG-
TAATAGCCATTGG
KpnI


BgIII
江莺等: 转基因红花中角质细胞生长因子 KGF-1的表达 313
钟; 94°C变性40秒, 64°C退火40秒, 72°C延伸40秒,
30个循环; 72°C延伸10分钟。用PCR回收试剂盒回收
KGF-1片段。

1.2.3 重组表达质粒的构建
将质粒p1390r及KGF-1的PCR回收产物同时用KpnI
和BglII酶切, 经1%核酸琼脂糖凝胶电泳及DNA回收
试剂盒回收纯化后, 用T4 DNA Ligase 16°C过夜连
接。连接产物采用热激法转化E. coli DH5α。采用碱
裂解法提取质粒(Sambrook et al., 1989), 对重组表
达质粒进行PCR、酶切和序列测定, 获得阳性克隆,
将质粒命名为p139035S-KGF-1。由北京六合华大基
因科技股份有限公司完成测序。

1.2.4 无菌苗的培养及农杆菌介导的红花转化
用0.1%的氯化汞消毒新疆裕民无刺红花种子表面,
无菌水冲洗, 浸泡过夜。次日播种于种子萌发培养基
上, 25°C暗培养3天, 待用。
培养基配方如下: 种子萌发培养基为MS+3%蔗
糖+0.75%琼脂粉; 子叶共培养基为MS+1.5 mg·L–1
6-BA+0.5 mg·L–1NAA+3%蔗糖+0.75%琼脂粉; 愈伤
诱导分化培养基为MS+1.5 mg·L–16-BA+0.5 mg·L–1
NAA+3%蔗糖+0.75%琼脂粉+200 mg·L–1Carb+100
mg·L–1Cef; 再生芽伸长生根培养基为MS+0.019%
KNO3+1%蔗糖 +0.75%琼脂粉 +100 mg·L–1Carb+
200 mg·L–1Cef。
提取质粒, 采用冻融法转化农杆菌(LBA4404),
得到阳性单菌落摇菌并保种。接种于含有三抗(Str、
Rif、Kam)的LB液体培养基中, 28°C、每分钟180转振
荡过夜, 至OD值达0.3–0.5。次日, 5 000 × g 离心,
获得菌体, 再用1/2MS液重悬, 同时加入200 µmol·
L–1 AS。剪取萌发3天的红花子叶, 侵染25分钟。然后
接种于子叶共培养基上, 置于25°C暗培养箱中。培养
3天后, 转入红花叶片愈伤诱导分化培养基培养, 并
进行阳性苗筛选。10天继代1次, 保持愈伤组织旺盛
生长, 减少褐变。红花再生芽接种到再生芽伸长生根
培养基上, 培养条件均为25°C、16小时光照/8小时
黑暗。

1.2.5 PCR检测
取潮霉素抗性苗新鲜叶片100 mg, 用新型快速植物
基因组DNA提取试剂盒提取总DNA, 以未转基因的
新鲜叶片作为阴性对照。PCR扩增目的基因反应总体
系如下: 2×Power Taq PCR MasterMix 10 μL, P1
和P2各0.5 μL, 模板1 μL, ddH2O 8 μL。PCR反应程
序为: 94°C预变性5分钟; 94°C变性45秒, 64°C退火
45秒, 72°C延伸45秒, 30个循环; 72°C延伸10分钟。
PCR扩增产物经1%核酸琼脂糖凝胶电泳后, 在DNR
Bio Imaging Systems (购自以色列DNR成像系统有
限公司)紫外灯下进行分析。

1.2.6 Southern blot杂交鉴定
取经潮霉素筛选及PCR鉴定为阳性的4株转基因红花
叶片, 每株约4 g, 用CTAB法(Rogers and Bendich,
1985)提取转基因红花总DNA。 以非转基因红花为阴
性对照。用KpnI/BglII酶切总DNA, 并以PCR扩增获
得的KGF-1片段为探针, 42°C杂交过夜, 显色, 分析
杂交信号。

1.2.7 RT-PCR检测
取潮霉素抗性苗及PCR多次鉴定为阳性植株的新鲜
叶片约200 mg, 采用改进的异硫氰酸胍法(即Trizol
法)提取红花总RNA。总RNA样品浓度用NanoDrop
2000超微量分光光度计(购自Thermo公司)测定。将
RNA反转录成 cDNA(详见Reverse Transcriptase
M-MLV (Rnase H–)试剂盒, 购自日本TaKaRa公司)。
RT-PCR反应体系如下: 2×Power Taq PCR Mas-
terMix 10 μL, P1和P2各0.5 μL, cDNA1 μL, ddH2O 8
μL。PCR反应程序为: 94°C预变性1分钟; 94°C变性
30秒, 64°C退火30秒, 72°C延伸3分钟, 30个循环;
72°C延伸10分钟。

1.2.8 转基因红花的Western blot检测
取转基因红花的叶片, 液氮研磨, 加入50 mmol·L–1
Tris-HCl缓冲液 (pH7.5)溶解 , 提取总蛋白 , 进行
SDS-PAGE电泳。然后通过双垂直电泳将胶上的蛋白
转移到硝酸纤维素膜上。转膜完毕后用牛奶封闭过夜,
次日用牛奶以1:500比例稀释一抗, 室温下孵育1–2
小时后, 用TBST漂洗, 2次/10分钟, 再用TBS洗, 1次
/10分钟; 用TBST以1:1 000比例稀释二抗, 后续方
法同一抗。最后在暗室中进行曝光, 时间30–60秒。
显影后定影并观察。
314 植物学报 46(3) 2011
2 结果与讨论
2.1 重组表达载体p139035S-KGF1的构建
质粒p1390r及KGF-1的PCR回收产物经KpnI和BgIII
双酶切, 获得产物纯化后于16°C连接。转化大肠杆菌
后, 挑取单菌落至含有50 mg·L–1Kam的LB液体培养
基中, 37°C振荡过夜。次日, 提取质粒, 进行KpnI和
BglII双酶切(图1)。获得大片段p1390r约9 000 bp, 小
片段KGF-1约515 bp。获得的KGF-1片段大小与预期
的目的片段完全吻合, 说明目的片段KGF-1已经整合
到质粒p1390r上。
2.2 潮霉素浓度耐受性筛选分析
在含有0、2、4、6、8和10 mg·L–1潮霉素(Hyg)的子
叶共培养基上进行培养。结果发现: 在不含Hyg的培
养基上, 接种的外植体大部分都能正常分化, 外植体
成活率为93%; 在含2 mg·L–1Hyg的培养基上, 外植
体的分化能力明显下降, 成活率降至56%; 当Hyg浓
度增加到4 mg·L–1时, 成活率约为25%; 当Hyg浓度
增加到6 mg·L–1时, 成活率仅为10%; 而在含8和10
mg·L–1(高浓度)Hyg的培养基上, 外植体全部变枯黄
并停止生长(或死亡)。因此, 为了减少假阳性再生芽
的发生并提高红花转化率, 在进行红花抗性筛选时,
潮霉素的适宜浓度为6 mg·L–1。
2.3 转基因红花的获得
取3日苗龄的红花, 将长约0.5 cm的子叶切下, 放入
农杆菌(LBA4404)液中侵染25分钟。共培养3天后, 转
入抑菌筛选培养基培养4–5周, 即可获得红花再生丛
生芽, 一个愈伤组织至少可以分化5个芽。随即转到
含有潮霉素的再生芽伸长生根培养基中筛选并进行
生根培养, 4–8周可生根。潮霉素抗性红花再生植株流
程如图2所示。
2.4 转基因红花的PCR鉴定
PCR检测结果显示, 植株2、3、5、6、7、8、10、
12、13均扩增获得了大小约为515 bp的KGF-1片段
(结果未显示), 说明目的基因已经整合到红花基因组
中, 转化率达0.1%。而植株1、4、9、11均未扩增出
目的基因片段, 原因可能是植株转基因过程中筛选不
充分, 因而出现假阳性, 致使PCR扩增不能获得相应


























图1 重组质粒p139035S-KGF1的酶切鉴定
M: DL15000 marker; 1: p139035S-KGF1质粒的KpnI/BglII酶切

Figure 1 Restriction digestion analysis of recombinant
plasmid p139035S-KGF1
M: DL15000 marker; 1: p139035S-KGF1 digested by KpnI/
BglII


的目的片段。
2.5 Southern blot检测
Southern blot结果显示(图3A), 阳性质粒对照和4株
转基因红花均表现出不同的杂交信号, 不同限制性内
切酶酶切后得到的杂交信号片段大小不一致, 且以单
拷贝和多拷贝形式存在, 说明目的基因KGF-1以1个或
多个拷贝的形式存在于红花基因组中, 单拷贝数约占
总数的50%。而非转基因红花未检测到任何杂交信号,
表明KGF-1片段已经整合到转基因红花基因组中。
2.6 RT-PCR检测
将提取的转基因红花总RNA反转录成cDNA, RT-
PCR产物经电泳后于DNR Bio Imaging Systems紫
江莺等: 转基因红花中角质细胞生长因子 KGF-1的表达 315


图2 红花子叶转基因再生植株流程图
(A) 种子经无菌处理后接种在种子萌发培养基上, 25°C暗培养; (B) 萌发3天的种子状态; (C) 子叶侵染后接种在子叶共培养基上,
25°C暗培养3天; (D)–(G) 红花子叶在含有1.5 mg·L–16-BA和0.5 mg·L–1NAA的愈伤诱导分化培养基上培养3–5周诱导的愈伤及分
化的丛生芽; (H) 在筛选培养基上培养6周的阳性转化植株, 仍然呈现深绿色; (I) 在筛选培养基上培养4周的假阳性转化植株, 叶片
发黄渐渐枯萎; (J), (K) 在1/3MS筛选培养基上诱导生根; (L) 转基因苗在培养室内于25°C、16小时光照的条件下培养。

Figure 2 In vitro shoot regeneration and transformation of safflowers from cotyledonary explants
(A) Safflower seeds inoculated on seeds germination medium at 25°C under dark culture conditions after asepsis; (B) Seeds
germination state after 3 days under dark culture conditions; (C) Safflower cotyledonary inoculated on cotyledonary co-culture
medium at 25°C under dark culture conditions after infection; (D)–(G) Adventitious shoot formation and callus from cotyledonary
explants of safflower on callus induction differentiation medium for containing 1.5 mg·L–16-BA and 0.5 mg·L–1NAA after 3
weeks(Figures D and E), 4 weeks(Figure F) and 5 weeks(Figure G) of culturing; (H) Positive transformed plant propagated on
selection medium for 6 weeks always show dark green; (I) False positive transformed plant became yellow and withered on
selection medium after 4 weeks of culturing; (J),(K) Rooted transgenic plants on 1/3 MS medium containing hygromycin and
without plant growth regulators; (L) Potted transgenic plant of safflower grown in the soil at 25°C under photoperiod conditions of
16 h per day.

外灯下观察(图3B), DNA谱带在515 bp处条带明显,
与预期的引物扩增片段完全吻合。阳性对照出现同样
的特异性谱带, 而阴性对照则无此谱带。这说明目的
基因KGF-1已经整合到红花基因组中, 经RT-PCR检
测是特异的。
2.7 转基因红花的Western blot检测
Western blot检测结果表明(图3C), 4株转基因红花在
约19 kDa处有杂交信号, 而野生型红花则无杂交信
号条带, 证明外源蛋白KGF-1已经在红花中得到了
表达。
2.8 讨论
植物生物反应器是一种新型、价格低廉的且可以表达
不同重组蛋白的反应器系统。随着组织培养技术和转
基因技术的日趋成熟, 为红花转基因工程奠定了基
316 植物学报 46(3) 2011


图3 转基因红花的Southern blot分析(A)、RT-PCR鉴定(B)和叶片总蛋白Western blot分析(C)
(A) +: 阳性质粒对照; 5、8、12和13: 转基因阳性红花DNA; –: 非转基因红花DNA; (B) M: DL2000 marker; +: 阳性质粒对照; 5、8、
12和13: 转基因红花; –: 非转基因红花; (C) WT: 野生型红花; 5、8、12和13: 转基因红花。

Figure 3 Southern blot hybridization analysis(A), RT-PCR identification(B), and Western blot analysis of total protein extracted
from leaves(C) of safflower transformants
(A) +: Positive plasmid control; 5, 8, 12 and 13: The DNA from the four transformed positive safflower; –: DNA from non-trans-
formed safflower; (B) M: DL2000 marker; +: Positive plasmid control; 5, 8, 12 and 13: Transformed safflower; –: Non-transformed
safflower; (C) WT: Wild-type safflower; 5, 8, 12 and 13: Transformed safflower.


础, 从而使药用植物红花表达外源蛋白成为可能。
本实验过程中仍然存在一些问题有待今后进一
步优化和解决。
第一, 红花再生丛生芽常出现玻璃化。玻璃化的
丛生芽呈半透明玻璃状, 叶片失绿增厚且硬脆, 叶表
缺少角质层, 蜡质发育不全, 呼吸、光合作用功能不
全, 植株矮小, 肿胀畸形, 不但难诱导生根, 而且再
生率低, 直接影响了后期转基因红花的转化效率。控
制玻璃化的措施(邵长文等, 2004)有: (1) 增加或减
少光照强度或时间; (2) 增加昼夜温差; (3) 40°C热激
处理愈伤组织培养物; (4) 降低或消除铵盐离子浓度;
(5) 增加通气度; (6) 增加琼脂或蔗糖浓度; (7) 降低
激素浓度; (8) 添加AgNO3、青霉素和活性炭等。
第二, 褐变是植物组织培养中经常遇到的问题,
也是影响本实验组培成功的重要因素(陈凯, 2004)。
外植体的褐变是一种酶促褐变, 产生褐变的因素有:
植物的种类及基因型; 外植体的生长部位及生理状
态; 培养基的成分及培养条件; 愈伤组织的继代增殖
方法。抑制褐变的措施有: 选择适当的外植体; 对培
养材料进行预处理, 如流水冲洗; 选择适当的培养基
和培养条件; 抑制剂和吸附剂的加入; 多次继代培养
等。
第三, 抗性筛选直接影响转化效率和成功率, 筛
选剂剂量及其加入时间是选择标记基因转化中的重
要问题。在目的基因转化过程中, 转化细胞具备潮霉
素磷酸转移酶活性而可以耐受较高浓度潮霉素的毒
性, 其生长和分化受影响较小, 植株绿色器官呈正常
的绿色; 而非转基因植株由于缺乏潮霉素磷酸转移酶
基因, 表现为植株绿色器官黄化或死亡, 因此潮霉素
筛选可以明显区分转化组织与未转化组织。同时, 外
江莺等: 转基因红花中角质细胞生长因子 KGF-1的表达 317
植体愈伤组织大小也受潮霉素浓度的影响。筛选剂浓
度越高, 效率越高, 但筛选剂浓度过高, 会抑制组织
细胞的生长; 筛选剂加入太迟或太少, 会使假阳性的
比例升高, 给转基因植株或组织的鉴定工作带来不
便。因此可以通过在整个转化过程中逐渐降低筛选剂
浓度的方式来减少对细胞生长速度的影响(王晓春等,
2008), 或者在不同阶段选择不同浓度的潮霉素进行
筛选。
第四, 红花再生芽生根率低。Ying等(1992)利用
根瘤农杆菌介导的方法, 从子叶中诱导愈伤得到红花
再生芽, 形成美国转基因红花品种Centennial, 出芽
率为26%, 尝试生根却没有成功。近年来, 红花品种
从愈伤组织诱导出的再生芽, 其生根率低的问题一直
没有得到有效解决(李爱新等, 2006)。本实验中转基
因红花生根率较低, 严重影响转化效率。影响生根率
的因素有: 刺激红花再生芽生根的生长激素, 包括激
素类型、浓度、不同激素浓度配比等未能达到最佳效
果, 因而导致根粗细不均匀、不紧密甚至不生根; 后
期移栽基质、光照等培养条件不适宜, 导致红花逐渐
枯萎死亡或根腐烂, 从而造成生根率低。因此今后
将重点探讨上述培养条件, 以提高转基因红花的生
根率。
第五, 转基因红花转化率较低。综上所述, 组培
苗玻璃化、愈伤组织褐化、筛选剂浓度及时间和生根
等问题严重影响了红花的转化效率。转化率低还与转
化过程中侵染菌液的浓度、侵染时间、AS浓度、抑
菌剂浓度、红花外植体和农杆菌LBA4404的亲和性等
因素有关。此外, 角质细胞生长因子KGF-1外源蛋白
对红花外植体可能产生不良影响, 继而转基因红花再
生苗长势弱, 植株纤细, 不易成活, 也会导致转化率
较低。
在不同的植物反应器系统中, 植物种子有更多优
势 , 例如蛋白高产和稳定贮藏外源蛋白 (Lau and
Sun, 2009)。本实验中受体红花作为油药两用作物,
其种子是红花油的主要贮藏场所, 转基因红花一旦成
功, 将同时收获红花的药用部位及外源蛋白(Markley
et al., 2006), 因此红花不仅仅只是一个表达载体。本
实验中未收获红花种子, 故还没有进行红花种子中角
质细胞生长因子KGF-1蛋白的含量研究 , 但从
Western blot检测结果中可以看出红花叶片中角质细
胞生长因子KGF-1蛋白确实已经表达。依照红花的特
性结合表达的角质细胞生长因子KGF-1, 今后可采用
ELISA检测转基因红花中目的蛋白占总蛋白的百分
比; 还可将目的蛋白进行分离、纯化并测活。
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Expression of Keratinocyte Growth Factor-1 (KGF-1) in
Transgenic Safflower
Ying Jiang1, 2, Xiuming Liu1, 3, Jisheng Ma1, Wei Li1, 3, Hailin Zhu1, 3, Meili Du1, 3,
Haiyan Li1, 3*, Xiaokun Li1*
1Ministry of Education Engineering Research Center of Bioreactor and Pharmaceutical Development,
Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2College of Chinese Medicinal, Jilin Agricultural University,
Changchun 130118, China; 3College of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
Abstract The recombinant plasmid vector p139035S-KGF1 was constructed and transfected into safflower by
Agrobacterium tumefaciens transfection. The period of infection to rooting was 14 weeks, and transformation efficiency
was about 0.1%. Adventitious shoots were generated after cotyledons were cultured in selecting media containing
hygromycin for 4–5 weeks. Rooted safflower was obtained in 4–8 weeks. KGF-1 was transformed into safflower
chromosomes and expressed successfully, as determined by PCR, Southern blot, RT-PCR and Western blot analysis,
which established the basis for the production of KGF-1.
Key words Agrobacterium tumefaciens, keratinocyte growth factor-1 (KGF-1), transgenic safflower
Jiang Y, Liu XM, Ma JS, Li W, Zhu HL, Du ML, Li HY, Li XK (2011). Expression of keratinocyte growth factor-1 (KGF-1)
in transgenic safflower. Chin Bull Bot 46, 311–318.
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* Author for correspondence. E-mail: hyli99@163.com; xiaokunli@163.net
(责任编辑: 白羽红)