全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2013, 48 (5): 519–530, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2013.00519
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收稿日期: 2012-07-27; 接受日期: 2012-12-27
基金项目: 国家自然科学基金(No.31000729)、江苏省高校自然科学基金(No.09KJB180006)和南通市应用研究计划(No.BK2012062)
* 通讯作者。E-mail: zhuxinyu@ntu.edu.cn
根瘤感受样基因的进化: 结构歧异与功能分化
朱新宇*, 吕万胜, 余春梅, 汪保华
南通大学生命科学学院, 南通 226019
摘要 豆科植物百脉根(Lotus japonicus)的根瘤感受基因Nin与根瘤的早期发育有关。Nin的同源基因(Nin-like基因)功能上
涉及氮代谢过程。从完成测序的豆科和非豆科植物基因组中获取Nin-like基因并进行系统发育分析。在此基础上, 追踪基因
和蛋白质结构的歧异式样, 尝试建立结构歧异和功能分化的联系。通过比较, 新的Nin-like基因被鉴别。系统发育分析不仅
重现了以前分辨的直系同源群(分支I、II和III), 且识别了它们之间的姐妹群关系。Nin-like基因的结构呈现多样性, 支持系统
发育分析的结果。水稻OsNLP5基因缺乏内含子, 可能起源于基因返座事件。NIN-like蛋白结构域组织和功能位点在不同分
支中存在差异, 提示它们的功能发生了分化。根瘤固氮植物NIN-like蛋白的GAF结构域中存在一个显著变异区, 三级建模分
析显示这个变异区对应于百脉根非固氮NIN-like蛋白的一段保守构象, 这一变异可能使豆科植物具有根瘤固氮能力。研究结
果为阐明Nin-like基因的功能提供了新的研究思路。
关键词 进化, 功能分化, Nin-like基因, 根瘤共生, 结构歧异
朱新宇, 吕万胜, 余春梅, 汪保华 (2013). 根瘤感受样基因的进化: 结构歧异与功能分化. 植物学报 48, 519–530.
最初, Schauser等(1999)在豆科模式植物百脉根
(Lotus japonicus)中鉴定了调控根瘤菌感染线形成和
原基细胞启动的Nin(nodule inception)基因。随后,
Borisov等 (2003)在豌豆 (Pisum sativum)中鉴定了
Nin基因的直系同源基因Sym35, 以及Schauser等
(2005)在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza
sativa)等非豆科植物中鉴别了Nin-like同源基因。由此
证实Nin基因属于一个多基因家族。NIN-like蛋白包含
1个保守的RWP-RK结构域(PF02042)、1个C末端的
PB1结构域(SM00666)和1–2个N末端的GAF结构域
(PF01590)。在功能上, RWP-RK结构域负责与DNA
结合, 因此推测NIN蛋白作为一种转录因子行使功能
(Schauser et al., 1999, 2005); PB1结构域负责蛋白
质-蛋白质间的相互作用, 以及与其它包含PB1结构
域的蛋白质形成异聚体(Ito et al., 2001); GAF结构域
一般存在于植物光敏色素和cGMP特定的磷酸二酯酶
(cGMP-specific phosphodiesterases)中, 也存在于
与固氮密切相关的根瘤菌转录调控蛋白NifA中
(Aravind and Ponting, 1997)。研究结果(Schauser et
al., 2005)显示, 百脉根Nin基因在进化过程中丢失了
一段位于GAF结构域区域的序列, 推测这一片段丢
失事件使得百脉根Nin基因招募为根瘤固氮基因。然
而, 这一丢失事件尚未在更多豆科固氮植物中得到证
实。研究显示, Nin-like基因尽管功能不同, 但都响应
氮营养信号, 显示与氮源的利用有关, 功能上可能存
在相互协同的关系(Scheible et al., 2004; Barbulova
et al., 2007; Castaings et al., 2009)。目前, 这些功
能不同但相关的Nin-like基因结构歧异式样与功能分
化的关系尚未被充分认识。随着多个豆科模式植物核
基因组测序的完成(Cannon et al., 2006; Sato et al.,
2008; Schmutz et al., 2010), 探索Nin同源基因的进
化歧异与功能分化的条件也逐渐成熟。本研究在基因
和蛋白质水平上分析Nin-like基因的结构歧异式样,
探讨结构歧异与功能分化的联系, 旨在为Nin-like基
因的功能研究提供新思路。
1 材料与方法
1.1 数据提取
以百脉根(Lotus japonicus (Regel) K. Larsen)NIN蛋白
作为查询序列, 使用缺省参数, tBLASTn搜素4个非豆
科模式植物和3个豆科模式植物的Nin-like基因(表1)。
·研究报告·
520 植物学报 48(5) 2013
表1 本研究所涉及的物种和Nin-like基因的取样
Table 1 The plant species and nodule inception like genes surveyed in this study
Species (Abbr.) Name Gene model GenBank accession Length (aa)
AtNLP1 AT2G17150 Q8H111 909 Arabidopsis thaliana (At)
AtNLP2 AT4G35270 D7MD23 963
AtNLP3 AT4G38340 Q9SVF1 767
AtNLP4 AT1G20640 D7KJ39 844
AtNLP5 AT1G76350 D7KTC4 808
AtNLP6 AT1G64530 D7KS88 841
AtNLP7 AT4G24020 D7M8Y6 959
AtNLP8 AT2G43500 D7LK24 947
AtNLP9 AT3G59580 Q9M1B0 894
OsNLP1 Os03g03900 NP_001048860 942 Oryza sativa (Os)
OsNLP2 Os04g41850 Q0JC27 936
OsNLP3 Os01g13540 NP_001042530 938
OsNLP4 Os11g16290 ABA92484 886
OsNLP5 Os09g37710 EEE70166 865
GmNLP1 Glyma06g00240.1 XP_003527589 682 Glycine max (Gm)
GmNLP2 Glyma04g00210.1 XP_003523488 744
GmNLP3 Glyma16g30180.1 XP_003548181 963
GmNLP4 Glyma09g25230.1 XP_003533182 933
GmNLP5 Glyma11g13390.1 XP_003539038 965
GmNLP6 Glyma12g05390.1 XP_003540690 946
GmNLP7 Glyma15g03220.1 XP_003546980 973
GmNLP8 Glyma20g29960.1 XP_003555384 897
GmNLP9 Glyma13g42160.1 XP_003542064 974
GmNLP10 Glyma10g37860.1 XP_003536463 883
MtNLP1 Medtr4g092610 XP_003606812 912 Medicago truncatula (Mt)
MtNLP2 Medtr5g106690 XP_003618108 933
MtNLP3 Medtr1g126970 XP_003592270 979
MtNLP4 Medtr2g120530 XP_003597538 993
LjNIN Chr2.CM0102.250.r2.m CAB61243 878 Lotus japonicus (Lj)
LjNLP1 Chr1.CM0178.280.r2.m CAE30324 904
LjNLP2 Chr3.CM0106.760.r2.m CAE30325 972
LjNLP3 Chr5.CM0148.170.r2.a – 976
LjNLP4 Chr3.CM0091.230.r2.m – 985
Pisum sativum (Ps) PsNIN CAD37948 921
SmNLP1 Gw1.3._1005.1 XP_002963404 606 Selaginella moellendorfii (Sm)
SmNLP2 EstExt_Genewise1Plus.C_180498 XP_002971920 777
PpNLP1 EstExt_Genewise1.C_260189 XP_001757159 697 Physcomitrella patens (Pp)
PpNLP2 EstExt_gwp_gw1.C_1280044 XP_001770664 799
PpNLP3 EstExt_Genewise1.C_2500013 XP_001779081| 697
PpNLP4 Gw1.109.16.1 XP_001769027 661
Lotus japonicus的数据来自http://www.kazusa.or.jp/lotus/, 其余均来自phytozome(http://www.phytozome.net/search.php)或JGI数
据库(http://genome.jgi-psf.org/)。–: GenBank蛋白数据库中缺乏相应序列。
The data of Lotus japonicus are retrieved from http://www.kazusa.or.jp/lotus/, the rest from phytozome (http://www.phytozome.
net/search.php) or JGI (http://genome.jgi-psf.org/). –: Denotes the lack of corresponding sequences.

其中 , 百脉根序列从百脉根基因组数据库 (http://
www.kazusa.or.jp/lotus/)中提取(Sato et al., 2008),
其余从phytozome或JGI数据库中提取(Goodstein et
al., 2012)。此外, 为了更好地理解豆科固氮植物Nin-
朱新宇等: 根瘤感受样基因的进化: 结构歧异与功能分化 521
like基因的进化史, 我们还加入了豆科非模式植物豌
豆的Nin基因(Borisov et al., 2003)。在几种候选序列
中, 如果同一基因存在选择性剪切, 仅选择最长的序
列。如果存在截断序列, 则重新预测基因模型。最终
选择的同源序列要求与百脉根NIN蛋白具有同样的结
构域组织, 即同时包含GAF、RWP-RK和PB1结构域。
蛋白结构域组织信息通过SMART平台获取(Schultz
et al., 1998)。对于真正的Nin-like基因, 我们预期它
们在候选序列中排名靠前。对每条候选序列, 用手工
检查它们的结构域组织, 且对最终确定的候选者进行
EST搜索以获取这些基因的表达信息 (Lee et al.,
2005)。
1.2 序列比对和系统发育分析
系统发育分析使用蛋白质序列。截取每条蛋白质序列
中GAF、RWP-RK和PB1结构域区域的序列, 通过
Clustal X进行序列比对(Thompson et al., 1997)。首
先建立3个独立的结构域数据集, 手工校对比对结果,
然后合并这3个比对为单一的数据矩阵。为了进行基
因结构分析 , 使用PAL2NAL程序 (Suyama et al.,
2011), 以全长蛋白质序列比对为基础构建基于密码
子的比对。用最大似然法(ML)(Felsenstein, 1981)和
邻接法(NJ)(Saitou and Nei, 1987)构建系统树时分
别用PHYML(Guindon and Gascuel, 2003)和MEGA
程序(Tamura et al., 2011)。ML分析中, 使用ProTest
程序(Abascal et al., 2005)测试进化模型和速率异质
性参数。NJ分析中选择成对删除空位方式。支持度通
过non-parametric bootstrap评估; 分别使用1 000和
500次重复抽样分析进行NJ和ML系统树牢固度评估。
支持强度分为低 (50%–75%)、中 (76%–85%)和高
(86%–100%)。
1.3 基因结构分析
使用spidey程序(Wheelan et al., 2001)比较全长蛋白
质比对和相应的cDNA比对, 以获得基因结构, 然后
手工分析内含子-外显子边界和相位信息。相位0指内
含子插入在密码子之间; 相位1指内含子插入密码子
第1个核苷酸和第2个核苷酸之间; 相位2指定内含子
插入密码子第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。内含子
的位置信息依据密码子比对和内含子-外显子边界信
息获得。本研究中内含子位置即使被1个碱基对分开
也被认为是不相同的, 尽管不能排除它们有共同起源
的可能(Rogozin et al., 2000)。
1.4 蛋白质结构分析
利用ScanProsite程序(http://prosite.expasy.org/scan-
prosite/)(Gasteiger et al., 2005)分析蛋白质功能位点
的类型和数量。利用WoLF PSORT程序(http://wolf-
psort.org/)(Horton et al., 2007)分析蛋白质的亚细胞
定位。通过Phyre(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre/)
(Kelley and Sternberg, 2009)远程同源建模方法对
NIN-like蛋白的N末端GAF结构域进行三级结构建
模。以人类磷酸二酯酶(phosphodiesterase)C末端
GAF结构域晶体结构(PDB代码: 2ZMF; SCOP代码:
c2e4sA)为模板。采用Swiss-Pdbviewer程序(Guex
and Peitsch, 1997)比较和显示蛋白质三级结构模型。
2 结果与讨论
2.1 数据抽提
我们从7个模式植物和1个非模式植物中共获得40条
NIN-like蛋白质序列和相应的cDNA(表1)。比较以往
的研究(Schauser et al., 2005), 我们在百脉根基因组
数据中鉴别了2个新成员, 即LjNLP3(chr5.CM0-148.
170.r2.a) 和 LjNLP4(chr3.CM0091.230.r2.m); 在水
稻基因组数据库中鉴别了2个新成员 , 即OsNLP4
(Os11g16290)和OsNLP5(Os09g37710)。本研究保
持以前研究中使用的Nin-like基因名称(Schauser et
al., 2005)以便比较。
2.2 系统发育
排除3个结构域各自比对中的模糊区域和自衍征插入
后, 组合获得长度为293个氨基酸残基位点的矩阵。
在AIC标准(Kullback and Leibler, 1951)下的最优进
化模型为JTT(Jones et al., 1992), 数据异质性参数
为G=1.258, I=0.063。以小立碗藓(Physcomitrella
patens)NIN-like蛋白作为外类群。采用ML分析产生最
优树(图1)的InL分值为–10 573.337 444。NJ分析产
生几乎与ML法分析相同的拓扑结构, 差别主要存在
于少数极短的分支上(图1)。我们构建的系统树显示
(图1), 所有参与分析的被子植物NIN-like蛋白成员可
以分为3个高度支持的分支, 分别定名为分支I、II和
522 植物学报 48(5) 2013

图1 NIN-like蛋白的ML系统发育树
分支上方分别为大于50的ML和NJ法bootstrap百分值; 分支下方为分支名称。– 表示在NJ分析中没有可分辨的分支关系; 三角指示
该基因具有EST支持; 星号表示推测的早期基因重复事件。a代表来自豆科植物的NIN-like蛋白固氮分支。右侧为每个蛋白对应的结
构域组织。

Figure 1 ML phylogenetic tree of NIN-like proteins
The numbers above branches are ML and NJ bootstrap percentages >50, respectively; Those below branches are the clade
name. “–” denote the relationships not resolved in NJ analysis; The genes with available EST sequences are indicated by trian-
gles; The stars denote the inferred early duplication events. The lowercase letter “a” represents the nitrogen fixation subclade
from legume plants. The domain organizations within each clade are depicted on the right.
朱新宇等: 根瘤感受样基因的进化: 结构歧异与功能分化 523
III。这一结果重现了以前基于拟南芥、水稻和百脉根
3个物种的分析(Schauser et al., 2005)。所不同的是,
我们分辨的3个分支均获得高度支持。在3个分支的关
系上, 分析结果显示, 分支I和分支II为姐妹群, 并同
时获得ML和NJ方法的低度支持, 提示它们可能有最
近的共同起源; 而分支III显示为较早分化的一支。在
分支I的内部, 由豆科成员组成的固氮亚支a获得高度
支持 (图 1), 提示在分支 I谱系进化中豆科植物
NIN-like基因的一次祖先基因重复事件形成了这个亚
支。
2.3 结构域组织的进化
为了追踪NIN-like蛋白结构域组织的歧异式样, 我们
在SMATR平台上获取它们的结构域组织信息。所有
参与分析的NIN-like蛋白在其C侧具有1个RWP-RK
和1个PB1结构域, 而N侧的GAF结构域存在变化(图
1)。在分支I和分支II的成员中, GAF结构域的数量为
1–2个; 如果存在2个GAF结构域, 位于C侧的GAF结
构域是退化(degeneration)的, 即发生显著变异或丢
失, 而位于N侧的GAF结构域其长度和氨基酸组成具
有高度保守性。在分支III中, 所有成员只保留了N侧
的GAF结构域, 而C侧的GAF结构域则完全消失。由
于在完成测序的基部陆生植物小立碗藓中所有
NIN-like蛋白保持2个GAF结构域(图1), 我们认为具
有2个GAF结构域的组织形式为祖先状态。在进化过
程中, 位于C侧的GAF结构域逐渐丢失。
2.4 基因结构的进化
本研究对3个被子植物分支的模式植物Nin-like基因
的结构进行了分析和比较, 表2显示了内含子数目和
相位分析结果。我们发现, 在33个被分析的Nin-like
基因中, 分支I的OsNLP5缺乏内含子, 其余基因的内
含子数目变异范围为3–9; 在32个具有内含子的基因
中共有142个内含子, 平均每个基因4.44个; 每个基
因的平均内含子数量在不同群之间也是不同的, 分支
I、分支II和分支III分别为3.09、5.44和4.92个; 在142
个内含子中, 75个(53%)相位是0, 56个(39%)相位是
1, 11个(8%)相位是2。表3显示了内含子插入位置分
析结果。由表3可知, 在所有被分析的Nin-like基因中
存在3个保守的内含子插入位置, 即位置11、19和31。
依据内含子插入位置和/或数量的变化, Nin-like基因
可以划分为3类基因结构, 基本对应于系统发育分析
的3个分支(图1)。在分支I中, 一般仅存在3个保守的
内含子插入位置, 无其它内含子插入, 保守位置19在
不同成员之间的变化是由于1个核苷酸对或一个密码
子位置变化产生的(如位置16、17和18)。在分支II中,
位置11的上游和位置31的下游存在数目不等且随机
的内含子插入。在分支III中, 与分支I中位置19的情况
类似, 位置11也由于1个核苷酸对或1个密码子位置
变化导致不同成员之间存在变异(如位置12和13), 在
位置19和31之间以及位置31下游存在数目不等的随
机内含子插入。
2.5 蛋白质功能位点和三维结构的歧异
所有40个NIN-like蛋白具有细胞核定位信号, 符合转
录因子细胞区室定位特征。对3个分支的NIN-like蛋白
的功能位点进行分析, 共鉴别了8个功能位点。其中,
N-豆蔻酰化(N-myristoylation)、N-糖基化(N-glycosy-
lation)、蛋白激酶CK2磷酸化(casein kinase II
phosphorylation)和蛋白激酶C磷酸化位点(protein
kinase C phosphorylation)存在于所有被分析的蛋白
序列中, 数目多且位置随机。另外4类功能位点选择
性分布在不同的蛋白序列中, 位点数目为1–2个(表
4)。cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点


表2 根瘤感受样(Nin-like)基因的内含子数量和相位
Table 2 Phase and number of introns in nodule inception like genes
No. of introns in each phase (%) Clade (No. of genes)
0 1 2
Total No. of introns Mean No. of introns per gene
I (11) 17 14 3 34 3.09
II (9) 22 24 3 49 5.44
III (12) 36 18 5 59 4.92
Total (32) 75(53) 56(39) 11(8) 142 4.44

524 植物学报 48(5) 2013

朱新宇等: 根瘤感受样基因的进化: 结构歧异与功能分化 525
表4 根瘤感受样(NIN-like)蛋白功能位点的分布式样
Table 4 Distribution pattern of functional sites of nodule inception like proteins
Functional site (PROSITE ID) Clades Gene name
Amidation site
(PS00009)
Tyrosine kinase
phosphorylation
(PS00007)
cAMP- and cGMP-dependent
protein kinase phosphorylation
(PS00004)
Cell attachment
sequence
(PS00016)
I AtNLP1
AtNLP2
AtNLP3
AtNLP4
AtNLP5
LjNLP1
LjNIN
PsNIN
MtNLP2
GmNLP1
GmNLP2
OsNLP1
OsNLP5
II AtNLP6
AtNLP7
OsNLP3
MtNLP3
GmNLP3
GmNLP4
GmNLP8
GmNLP10
LjNLP3
III AtNLP8
AtNLP9
OsNLP2
OsNLP4
MtNLP1
MtNLP4
GmNLP5
GmNLP6
GmNLP7
GmNLP9
LjNLP2
LjNLP4
表中阴影部分表示存在相应的功能位点。
The shaded part in this table represents the presence of corresponding functional sites.


(cAMP- and cGMP-dependent protein kinase
phosphorylation)广泛分布于3个分支的蛋白序列中,
仅少数序列缺乏。酰胺化位点(amidation site)和酪氨
酸激酶磷酸化位点(tyrosine kinase phosphorylation)
一般分布在分支I和分支III中, 在分支II中几乎完全缺
乏。细胞附着序列(cell attachment sequence)零星分
布在分支I和分支III的少数序列中, 在分支II中则完全
缺乏。不同分支的NIN-like蛋白功能位点分布的差别
意味着它们接受不同的信号因子, 最终可能影响不同
靶基因的表达。有趣的是, 细胞附着序列, 即Arg-
Gly-Asp(RGD)三肽, 以往只发现于胞外与细胞表面
受体相互作用的蛋白质中(Ruoslahti and Pierschba-
cher, 1986)。
在N侧的GAF结构域序列中, 豆科固氮亚支(图1
的亚支a)的成员存在一个变异区域(图2A), 研究推测
这个变异区域可能导致百脉根的Nin基因被招募为根
526 植物学报 48(5) 2013

图2 LjNLP1蛋白GAF结构域的三级结构模型
(A) GAF结构域的多序列比对(阴影部分示发生在固氮亚支a(图1)中的显著变异区段); (B) LjNLP1蛋白GAF结构域的三级结构模型
标注的氨基酸位置代表LjNLP1的GAF结构域的起点(Ile1)和终点(Glu156)以及对应于豆科植物变异区的起点(Arg31)和终点(Val94)。

Figure 2 Three-dimensional structural model of GAF domain in LjNLP1 protein
(A) Multiple sequence alignment of GAF domain regions; The shaded part indicates the significantly variable region occurred in
NIN-like proteins from legume plants (see the clade a in Figure 1); (B) Three-dimensional structural model of GAF domain in
LjNLP1 protein; The labelled amino acids, Ile1 and Glu156, represent the starting and ending points of GAF domain in LjNLP1,
respectively, and in which, the Arg31 and Val94 represent the starting and ending points corresponding to the variable part in
legume plants.
朱新宇等: 根瘤感受样基因的进化: 结构歧异与功能分化 527
表5 已知功能的根瘤感受样(Nin-like)基因
Table 5 Known functions of nodule inception like genes
Clade Gene name Function Reference
I LjNIN, PsNIN,
OsNLP1,
AtNLP3
LjNIN and PsNIN involved in early stages of root nod-
ule formation; OsNLP1 did not rescue abortion of in-
fection in nin mutant plants, whereas LjNIN did;
AtNLP3 responsed quickly to N nutrition
Schauser et al., 1999; Borisov et al.,
2003; Scheible et al., 2004; Yokota
et al., 2010
II AtNLP7 Response to N nutrition; may play a role in stomatal
movements and drought resistance
Castaings et al., 2009
III AtNLP8 Response to N nutrition Scheible et al., 2004


瘤固氮基因(Schauser et al., 2005)。本研究显示在取
样的3个豆科模式植物(大豆、蒺藜苜蓿(Medicago
truncatula)和百脉根)中均存在这样1个变异区。对分
支I的LjNLP1的GAF结构域进行远程同源建模(图2B)
发现, 对应于豆科固氮亚支N侧GAF结构域变异区域
的是一段保守的β-折叠+转角+α-螺旋构象, 范围从
Arg(R)31到Val(V)94(图2B)。其中Glu(E)73到Glu(E)
89片段对应于LjNIN中的一段丢失区域, 这一片段包
含一个α-螺旋区。由于固氮亚支在进化过程中发生N
侧GAF结构域的变异或片段丢失, 可能改变了这些
基因的功能, 分化为根瘤固氮基因。
2.6 讨论
基因家族是真核生物的特征之一 (Horan et al.,
2005)。家族内的基因在经历进化选择过程后, 最终
形成不同的直系同源群以执行不同的功能(Lespinet
et al., 2002)。通过扩大豆科固氮植物物种的取样, 有
助于加深理解根瘤感受样(Nin-like)多基因家族的结
构歧异式样与功能分化的关系。我们的分析不仅重现
了以前划分的3个直系同源群, 且鉴别了它们之间的
系统发育关系, 即分支I和分支II的姐妹群关系(图1)。
在分支I中, 固氮亚支a显示起源于分支内的一次祖先
NIN-like基因的重复事件, 其后裔基因由于GAF结构
域的变异和/或其它未知的机制获得根瘤固氮能力。分
支III的成员一致地丢失1个GAF结构域。由于基部陆
地植物NIN-like蛋白包含2个GAF结构域, 按照进化
的简约规则 , 我们认为具有 2个 GAF 结构域的
NIN-like蛋白为祖先结构形式。
Nin-like基因表现出结构多样性(表3), 意味着在
其进化过程中发生了频繁的内含子插入和丢失(Park
et al., 2008)。由于内含子可能有调控功能, 内含子的
插入和丢失可能促成基因的功能分化, 它们通过促进
外显子重排或直接导致调控元件的差异(Lynch and
Conery, 2000); 另一方面, 3个分支内部在内含子位
置11、19和31是高度保守的(表3), 处于强选择性压
力下, 意味着这些基因具有相似的功能。我们认为,
无内含子的OsNLP5基因可能起源于基因返座(Roy
et al., 2003)而不是内含子丢失事件, 原因为其潜在
的返座源基因OsNLP1具有3个内含子(表3), 而发生
3次基因丢失事件的可能性很低(Zhu et al., 2012)。一
般认为 , 返座基因由于缺乏调控元件而不能表达
(Graur and Li, 2000), 但有研究显示返座基因不仅能
够表达且能够承担非冗余的功能(Kong et al., 2004)。
OsNLP5和它潜在的返座源基因OsNLP1都具有作为
活跃转录基因的EST证据(图1中的分支b), 它们在表
达式样上的差异值得进一步关注 (Sakai et al.,
2011)。
在3个直系同源群中, 一些成员的功能已经确定
(表5)。分支I的固氮亚支a的LjNIN和PsNIN, 功能上与
固氮根瘤的早期形成有关(Schauser et al., 1999,
2005; Borisov et al., 2003), 这2个基因都响应根瘤细
菌的微共生条件而形成过度的根毛卷曲。分支 I的
OsNLP1不能替代百脉根LjNIN的功能(Yokota et al.,
2010)。尽管OsNLP1与LjNIN同属一个进化分支, 但
它们的功能已经分化。进一步证明豆科植物根瘤固氮
能力是一种后发特征, 起源于不具有根瘤固氮能力的
同源基因。分支I的AtNLP3能够响应硝酸盐的N源信
号, 表明尽管AtNLP3不具有根瘤固氮能力, 但与N源
的利用有关, 处于N源利用的基因网络中(Scheible et
al., 2004)。在分支II中, AtNLP7的功能已被初步确定。
AtNLP7突变显示典型的氮饥饿表型, 并影响硝酸盐
利用相关基因(如硝酸盐吸收和诱导基因)的功能, 因
528 植物学报 48(5) 2013
此, AtNLP7与AtNLP3功能类似, 都涉及硝酸盐利用
和代谢调控(Castaings et al., 2009)。有趣的是, 尽管
2个基因处于不同的进化分支, 两者的功能位点分布
却是相同的(表4), 因此它们在功能上的分化需要进
一步研究。在分支III中, 拟南芥AtNLP8同样响应硝酸
盐的N源信号(Scheible et al., 2004)。值得注意的是,
AtNLP8与AtNLP7和AtNLP3的功能位点分布不同(表
4), 表明尽管它们都涉及响应硝酸盐的N源信号, 但
可能接受不同的调控信号。以上研究提示, 不同分支
的Nin-like基因均涉及N源利用过程, 发挥不同但相
互关联的功能。由于不同的进化背景, GAF的功能可
能不同, 但其中有一个确定的功能是cGMP-binding
(Aravind and Ponting, 1997)。研究发现, 与其它非豆
科植物相比较 , 豆科植物百脉根的NIN-like蛋白的
GAF结构域存在一段显著变异区域, 且正是这个变
异区域导致百脉根获得根瘤固氮能力。本研究中蛋白
质三级结构比较分析显示, 在这个变异区域内, 处于
同一个进化分支的百脉根NIN-like蛋白(LjNIN1)具有
保守的β-折叠+转角+α-螺旋三级结构构象(图2B), 而
固氮植物可能发生了变异 (如 LjNIN)或丢失 (如
PsNIN)(图2A)。由于蛋白质功能常常与它的构象密切
相关(Hou et al., 2007), 在核心结构区域的突变能急
剧改变结合口袋(binding pocket)的形状。我们的建模
分析提示, 固氮植物可能通过改变GAF结构域对信
号分子的结合潜能或性质影响靶基因的转录, 并最终
获得固氮能力。
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Abstract The nodule inception gene Nin is related to early stages of root nodule formation in the model plant Lotus
japonicus. Functionally, its homologs, Nin-like genes, are also involved in N metabolism. In this study, Nin-like gene data
were retrieved from completely sequencing genomes of legume and non-legume plants for investigating phylogeny to
trace the divergence of genes and proteins and build relationships between structural divergence and functional differen-
tiation. We revealed novel Nin-like genes; previously resolved orthologous groups were recovered and their sister rela-
tionships resolved. Nin-like genes showed a diversity of structures, which supports the results of phylogenetic and func-
tional studies; OsNLP5 from Oryza sativa was found to be intronless, which probably originated from a gene retroposition
event. We found discrepancies in domain organizations and functional sites among NIN-like proteins, which indicates
possible functional differentiation. 3-D structural analysis revealed the occurrence of significant conformational changes in
GAF domains of NIN-like proteins from nodule legume plants, which could become the basis of recruitment as nodule
inception genes. Our findings will contribute to the design of further experimental studies.
Key words evolution, functional differentiation, Nin-like genes, rhizobia symbiosis, structural divergence
Zhu XY, Lü WS, Yu CM, Wang BH (2013). Evolution of the nodule inception-like genes: structural divergence and func-
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* Author for correspondence. E-mail: zhuxinyu@ntu.edu.cn
(责任编辑: 白羽红)