全 文 ：第 !" 卷第 # 期
!$$" 年 # 月
生 态 学 报
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基金项目：国家科技部“#"5”重点基础研究资助项目（$$6&76$8#）；农学教学实验用微生物资源课题资助项目（!$$9:;%!6!$8<=）；华中农业大
学农业微生物学国家重点实验室开放基金资助项目
收稿日期：!$$=<6$<6$；修订日期：!$$"<$>作者简介：徐莉（6#"6 ?），女，湖北孝感人，讲师，主要从事应用微生物和生物技术等领域的研究2
’通讯作者 &0@@3A40BCDBE FGHI0@2 (
%E@0B0JN ’3FPIDBE V@0K3PH （.02 !$$9:;%!6!$8<=）FBC )43B X0GBCFHD0B 0S -HFH3 ;3N *FT0@FH0@N 0S %E@DPG1HG@F1 WDP@0TD010EN
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不同地域豇豆（!"#$% &$#&"’&(%)%）
根瘤菌的表型和遗传多样性
徐[ 莉6，杨江科6，’，张伟涛!，袁天英!，周俊初!，’
（62 华中科技大学生命科学与技术学院，武汉[ >5$$">；!2 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉[ >5$$"$）
摘要：豇豆根瘤菌既是豆科植物根际微生物的主要类群，也是重要的根瘤菌资源之一。通过最适碳 \氮源、内源抗生素抗性和
.F&1耐受性等表型特征和 6=-进行了表型和遗传多样性分析。供试菌株无论是在表型还是遗传型方面均具有丰富的多样性。根据 ,+- UX*V特征，供试豇豆
慢生根瘤菌分为以下 > 个 ,+-类群：,+-于 !"#$%"&’()*’+, -#.)/’0+,和 !"#$%"&’()*’+, 1’#)/’/23/43；,+-<$属于 !"#$%"&’()*’+, 315#/’’。豇豆快生型菌株则分别归为 ,+-<
%和 ,+-<&群，在分类地位上分别属于 6’/)"&’()*’+, 7"3$’’和 8&’()*’+, 132+,’/)4#"+,。不同地域的菌株在多样性方面具有明显
的差异。分离自湖北红安的菌株仅与黑龙江德都具有一定的相似性，]FPPF@C系数为 $2 !9，表现出地理隔离作用。来自黑龙江
德都和广西武鸣的菌株的多样性最为丰富，其 -DJ4A0B指数和 -IFBB0B<^D3B3@指数分别为 $2 ==" 和 62 !>5 与 $2 9#5 和 $2 #=6。
关键词：豇豆根瘤菌；表型；,+-；多样性
文章编号：6$$$<$#55（!$$"）$#<5=99<$8[ 中图分类号：_#58；_#>9[ 文献标识码：%
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生物固氮不仅是生物圈氮素循环的重要环节，而且在维持土壤肥力、促进农业的可持续发展中具有重要
的作用。通过对根瘤菌资源的收集、整理，可筛选出与豆科作物相匹配、高效结瘤固氮的根瘤菌，用于提高作
物的产量和品质［@］。
豇豆［!"#$% &$#&"’&(%)% （D&）?-*#&］是起源于非洲和亚洲的一种豆科植物，目前在世界范围内广泛栽
培。在非洲及拉美国家，豇豆是低收入家庭主要的蛋白质来源［1］；在我国，豇豆不仅是人们日常食用的绿色
蔬菜，而且在南部地区豇豆还是重要的绿肥作物和饲料。与豇豆共生的根瘤菌主要为慢生型根瘤菌。依据根
瘤菌与豆科植物共进化所形成的宿主专一性的关系，豇豆根瘤菌在系统发育上称为“豇豆族”。该类根瘤菌
宿主关系复杂、分类地位模糊［C］。
根瘤菌具有优良的生态适应性，广泛存在于各种生态环境中。它们不仅是根际微生物区系的重要成员，
而且也生活于水体中。其少数类群还能与非豆植物共生结瘤固氮，有些还能以内生菌的形式存在于水稻根
内［B，2］。另一方面，不同的地理环境、耕作制度、栽培品种等各种因素对根瘤菌的分布和多样性也具有明显的
影响［=］。
我国具有丰富多样的地理及生态环境。不同地域的土著根瘤菌必然具有特定的特征。通过开展不同生
态区域豇豆根瘤菌多样性和系统发育的研究，不仅能收集、整理一批豇豆根瘤菌资源，而且能进一步深化根瘤
菌生物与遗传多样性的基础知识，从而为确定其系统发育与分类地位提供证据。
)* 材料与方法
)& )* 采样点的设置与豇豆根瘤菌的分离
采样地选取东北平原的黑龙江德都（L@1=& @M，NBO& 20）和宝清县（L@C1& @M，NB=& CC）、华北平原的河北邢
台（L@@B& BO，NCM& 02）、邯郸（L@@B& BM，NC=& =）和石家庄（L@@B& BO，NCO& 0C）、江苏省连云港（L@@G& @=，LCB&
2G）、长江中下游地区的湖北红安（L@@B& =@，NC@& 1G）和广西武鸣（L@0O& 1M，N1C& @M）。按 2 点取样法采集各
点的土壤样本，并以豇豆品种早丰一号和鄂豇一号为捕获植物，以土样悬液接种无菌砂培的豇豆植株，于温室
中生长约 C09后采集根瘤，经 CP的 N-Q*R1表面消毒后，用平板划线法分离、纯化根瘤菌，挑取单菌落，转接并
保存于 STU斜面。于无菌双层砂钵中进行根瘤菌的宿主回接试验，并通过比较接种供试根瘤菌植株与对照
植株地上部分干重来确定供试菌株的共生有效性［M］。随机挑选 21 株供试菌株进行多样性研究（表 @）。
)& +* 根瘤菌表型测定
（@）所用碳源为V 肌醇、果糖、山梨醇、葡萄糖、甘露醇、乳糖、糊精、蔗糖等；所用氮源为：赖氨酸（D4/）、甲
硫氨酸（T’"）、亮氨酸（D’:）、脯氨酸（F5)）、精氨酸（W5#）、苯丙氨酸（F!’）、色氨酸（<’5）和 XNRC；抗生素选用
氨苄青霉素（U7#）、壮观霉素（<#’）、链霉素（<"5）、四环素（W(）、卡那霉素（X7）、新霉素（N’)）和利福平
（Y,6）。所用碳 $氮源均为国产分析纯试剂，抗生素为 <,+7-公司生产。
（1）碳 $氮源测定V 采用
根瘤菌内源抗性及 N-Q*耐受性试验均在 STU平板上进行，先制备含不同浓度的抗生素或 N-Q*平板，然后接
种供试菌株，1O \培养，1 ] B9后观察。
)& ,* 根瘤菌总 8NU的提取
供试菌株在 STU液体培养基中培养至对数期后，离心收集菌体，经
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菌体；经 /0 121 裂解菌体后，加入蛋白酶 3 至终浓度为 45 !+ $ 6*，78 9保温至菌液透明；加入 4 6)* $ :
;-<*=>至终浓度为 / 6)* $ :，混匀后加入等体积苯酚?氯仿反复抽提至界面无蛋白；取上清液，经乙醇沉淀、洗
涤、干燥并溶解在低浓度 @3中，通过 A’(B6-. 2C?D55 分光光度计定量后贮存备用。
表 !" 供试豇豆根瘤菌和参比菌株
#$%&’ !" !"#$% &$#&"’&(%)% ()*+,%*$ $-. (’/’(’-0’ 12($*-1
菌株
1"E-,.F
宿主植物
G)F" #*-."F
地理来源
H’)+E-#!,( )E,+,.F
表型
I!’.)"J#’F
KH1 LM:I
#-""’E.F
N"O>，N"O4 !" #$%#&’#()*) 河北邢台 N" " /
N"3P，N"3> !" #$%#&’#()*) 河北邢台 N" " Q
N"37 !" #$%#&’#()*) 河北邢台 N" " 8
N"3Q， !" #$%#&’#()*) 河北邢台 N" # /5
GR3/，GR3P，GR3> !" #$%#&’#()*) 河北邯郸 GR " /
GR37，GRO7 !" #$%#&’#()*) 河北邯郸 GR " 8
GRO> !" #$%#&’#()*) 河北邯郸 GR " Q
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:J+OP，:J+O> !" #$%#&’#()*) 江苏连云港 :J+ " D
:J+3/，:J+3P，:J+37 !" #$%#&’#()*) 江苏连云港 :J+ " S
1TUO/，1TUO7 !" #$%#&’#()*) 河北石家庄 1TU " 4
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1TUO> !" #$%#&’#()*) 河北石家庄 1TU $ P8
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1TU3> !" #$%#&’#()*) 河北石家庄 1TU $ PQ
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1TU3Q !" #$%#&’#()*) 河北石家庄 1TU $ PD
2RO7，2R3P !" #$%#&’#()*) 黑龙江德都 2R # /4
2RO4 !" #$%#&’#()*) 黑龙江德都 2R % P5
2R37 !" #$%#&’#()*) 黑龙江德都 2R # /Q
2R3> !" #$%#&’#()*) 黑龙江德都 2R $ PS
2R34 !" #$%#&’#()*) 黑龙江德都 2R # /P
AV3/，AV37，AV3> !" #$%#&’#()*) 黑龙江宝清 AV # /8
AV3P !" #$%#&’#()*) 黑龙江宝清 AV " 7
W6O/ !" #$%#&’#()*) 广西武鸣 W6 " >
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W63P，W637 !" #$%#&’#()*) 广西武鸣 W6 # /5
W63> !" #$%#&’#()*) 广西武鸣 W6 " 8
W634 !" #$%#&’#()*) 广西武鸣 W6 # //
W638 !" #$%#&’#()*) 广西武鸣 W6 $ PP
G-O/，G-O7，G-O>，G-3> !" #$%#&’#()*) 湖北红安 G- % /D
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84Q7Z S 期 Z Z Z 徐莉Z 等：不同地域豇豆（!&%$) #$%#&’#()*)）根瘤菌的表型和遗传多样性 Z
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!& "# /01 23456781 2345 9:1 ;<363=>;分析
利用特异性引物 #?2 （@’6A:< ::< A:: 5A< 5<< A<< AA68’）和 #7813B/ （@’6::< A:< AA< A55 :<<
55<68’）对供试菌株 /01 2345基因与 781 2345基因间的 9:1区段进行 ;<3扩增。反应总体积为 7B !*，反
应体系程序为：初始变性 CD E D F,.；CD E / F,.，@0 E / F,.，G7 E 7 F,.，88 个循环；最后 G7 E延伸 0 F,.。
;<3反应在美国 5H9公司热循环仪（7G7B 型）上进行。
;<3扩增产物分别用 !"#999、!$"9、!%&I9 和 ’()9 等限制性内切进行酶切。酶切产物以 /BB J#K L45
>-MM’2作分子量标准，经 7& BN琼脂糖凝胶电泳后，用 O)M-P凝胶成像系统记录数据。具体操作参照文献［Q］。
!& $# 数据分析与处理
表型分析结果记录为“R $ S”格式，即在含抗生素、4-<*或不同氮 $碳源的平板上生长者为“R”，不生长
者为“S”。通过 4A1T1软件将其进一步转化为“/ $ B”数字符，即“R”转化为“/”，“S”转化为“B”。凝胶图
像先经计算机凝胶扫描成像系统摄取，经过均一化处理后转化为“B”和“/”数字符，即有条带处以“/”表示，
无条带处以“B”表示。再通过 4A1T1 5##*,’M H,)K"-",K",(K软件进行相似性分析，并利用平均连锁法（U;:V5）
进行聚类分析转化为树状图。
!& %# 根瘤菌各类群相似性和多样性分析
利用 W-((-2M指数、1,F#K).指数和 1!-..).6X,’.’2指数分析采自各地域的供试豇豆根瘤菌在 9:1分群水
平上的类群相似性和多样性［C］。W-((-2M公式为：* Y + $（, R - S +），其中 ,、-为两地域根瘤菌的 9:1类群数，
<为两地域共有 9:1类群数；1,F#K).指数公式：. Y / S%/%7，其中 /%为 9:1类群个体数占群落中总个体数的
比例；1!-..).6X,’.’2指数公式：! Y S%/% *./ ,，式中 /% Y 0% $ 0。
&# 结果与分析
&& !# 表型多样性分型
通过对供试菌株和参比菌株的最适碳 $氮源利用状况，内源抗性和对 4-<* 的耐受性等表型特征的测定，
表明供试菌株表现出了丰富的表型多样性，共产生 87 个特征数。在 4A1T1软件辅助下，将特征数量化，并通
过 U;:V5算法对菌株进行聚类分析，将供试菌株与参比菌株聚为 D 大群（表 / 和表 7）：其中群 9 由 7G 株慢
生根瘤菌组成，并可进一步分为 95 和 9H 两小群。该群菌株具有较强的内源抗性，对 4-<* 具有较好的耐受
性，能较好的利用甘露醇、蔗糖和葡萄糖，除 O4Z8外，部分菌株还能以 >[K、V’"、;2)和 1’2为氮源。群 99由 //
株供试菌株、参比菌株 -1 2")3&%456和 -1 7%"3&%&8#&(#组成。它们的内源抗性和对 4-<* 的耐受性均较弱，最
适碳 $氮源分别为甘露醇和 O4Z8，但对其它碳 $氮源的利用率低。群 999主要由来自湖北红安的菌株和参比菌
株 -1 #79"&%%组成。在所有供试菌株中，该群菌株的内源抗性和 4-<*的耐受性均最低，且利用碳 $氮源能力最
弱。群 9\由 G 株快生豇豆根瘤菌与快生型的参比菌株 ’#(3:$%;3<%56、*%&3:$%;3<%56 和 =$%;3<%56 等组成。在
所有供试菌株中，该群的内源抗性和对 4-<*耐受性均最高，碳 $氮源的利用能力最强，除甘露醇和 O4Z8外，该
群的大部分菌株对其它碳 $氮源的利用率均较高。
&& &# 9:1 3=>;分析
以 #?2和 #7813B/ 为引物对供试菌株的 9:1区段进行了 ;<3 扩增，所有供试快生根瘤菌和慢生根瘤菌
的 9:1大小均在 /& C ] 7& /PJ之间。利用 !"#999、!$"9、!%&I9和’()9 D 种限制性内切酶分别对 9:1区段进行了
酶切分析，酶切谱带显示出丰富的多样性（图 /）。在 4A1T1 软件的辅助下，经 U;:V5 法生成了反映各菌株
间相似性关系的系统发育树（图 7）。由图 7 可见：供试豇豆根瘤菌具有丰富的多样性，在 QBN的相似性水平
上，可分为 9:16"、9:16#、9:16$、9:16%、9:16&和 9:16’等 0 个类群。其中 9:16"为最大的一群，有 7G 株
供试豇豆根瘤菌，占供试总菌数的 @/& CN。聚类分析结果表明该群在系统发育上与其它豇豆根瘤菌和参比
菌株分离。9:16#属于 -1 2")3&%4"56，主要由来自广西武鸣的菌株组成。9:16$属于 -1 7%"3&%&8#&(#，主要由
来自东北德都和宝清的菌株组成。9:16%属于 -1 #79"&%%，主要由来自湖北红安的菌株组成。9:16&属于 *1
>:#?%%，主要由来自河北石家庄的菌株组成；9:16’由单一菌株 LM^D 组成，在系统发育上属于 =$%;3<%56
Q@08 _ 生_ 态_ 学_ 报_ _ _ 7G 卷_
!""#：$ $ %%%& ’()*)+,(-& (.
!"#$%&’()*+$%。/
表 !" 供试菌株及参比菌株的表型特征分型
#$%&’ !" ()’*+,-.’/ +0 1+2.’$ 3)45+%4$ $*6 ,)’ 3’0’3’*1’ /,3$4*/
项目 0"’1
群! 2*34"’5 ! （’’ 6 78）
09（’ 6 :;） 0<（’ 6 :7）
群"
2*34"’5 "
（’ 6 :;）
群#
2*34"’5 #
（’ 6 :=）
群$
2*34"’5 $
（’ 6 :=）
内源抗性 9.",>,)",(
5’4,4"-.(’ （+ $ 1*）
氨苄 91# ;= ? （:7）’’ ?（::） ?（:=） ?（8） / ?
:== ?（;） ?（@） / A / A / ?
链霉素 B"5 7= ?（8） ?（@） ?（;） ?（C） / ?
D= / A / A / A / A ?（8）
壮观霉素 B#’ 7= ?（E） ?（@） ?（8） ?（F） / ?
D= / A ?（F） / A / A ?（@）
四环素 G( := ?（:C） ? ?（:C） ?（8） ?
7= A ?（C） / A / A ?（;）
卡那霉素 H1 7= ?（:C） ?（::） ?（:=） ?（@） / ?
D= ?（E） ?（E） ?（;） / A ?（@）
新霉素 I’) 7= / ? / ? ?（:C） ?（E） / ?
D= ?（E） ?（:=） ?（;） ?（;） / ?
利福平 J,K := / ? / ? ?（::） ?（8） / ?
7= ?（E） ?（:=） ?（;） ?（C） / ?
碳源 2-5>). 4)35(’
/ 肌醇 0.)4,")* / A / A / A / A / A
/ 果糖 L53(")4’ / A / A / A / A ?（@）
/ 山梨醇 B)5>,")* / A / A ?（C） / A ?（E）
/ 葡萄糖 M*3()4’ ?（:=） ?（E） ?（:C） ?（;） / ?
/ 甘露醇 N-..,")* / ? / ? / ? / ? / ?
/ 乳糖 O-(")4’ / A / A / A / A / A
/ 糊精 P’Q"5,.’ / A / A / A / A / A
/ 蔗糖 B3(5)4’ / ? / ? ?（:C） ?（F） / ?
氮源 I,"5)+’. 4)35(’
/ 赖氨酸 OR4 ?（:=） ?（8） ?（8） ?（F） ?（@）
/ 甲硫氨酸 N’" ?（;） ?（D） ?（7） / A ?（;）
/ 亮氨酸 O’3 / A / A / A / A ?（C）
/ 脯氨酸 S5) ?（F） ?（D） / A / A ?（8）
/ 精氨酸 G5# / A / A / A / A ?（;）
/ 色氨酸 B’5 ?（8） ?（;） / A / A ?（F）
/ HITC / ? / ? / ? / ? / ?
I-2* （U）
/ =& D / ? / ? / ? / ? / ?
/ =& F / ? / ? / A / A / ?
/ =& @ / A ?（C） / A / A / ?
/ / ’菌株数/ G!’ .31>’5 )K 4"3V,’V 4"5-,.4；?：示正反应 -** 4"5-,.4 -5’ #)4,",W’；A：示负反应 -** 4"5-,.4 -5’ .’+-",W’
’’表现正反应的菌株数/ I31’5,(-* W-*3’ ,. #-5’."!’4’4 ,4 "!’ .31>’5 )K "!’ 4"5-,. %,"! #)4,",W’ 5’-(",).
!& 7" 不同地域分离豇豆根瘤菌菌株的相似性和多样性指数
在 0MB类群水平上考察了自不同供试地域分离的豇豆根瘤菌的相似性和多样性，结果见表 C。由表 C 可
见：来自黑龙江德都和广西武鸣的菌株的多样性最为丰富，其 B,1#4). 指数和 B!-..).XY,’.’5 指数分别为
=Z FF8 和 :& 7DC 与 =& ;EC 和 =& EF:。来自湖北红安的菌株在系统发育上相对独立，仅与黑龙江德都具有一定
E;FC/ E 期 / / / 徐莉/ 等：不同地域豇豆（,&#’* $’#$&-$!*.*）根瘤菌的表型和遗传多样性 /
!""#：$ $ %%%& ’()*)+,(-& (.
图 /0 由 !"#111产生的代表菌株和参比菌株 /234563 173 89:;图谱
9,+& /0 /234563 173 89:; <,.+’=#=,."> )< =’#=’>’."-",?’> -.@ =’<’=’.(’ >"=-,.> #=)@A(’@ BC !"#111
D：D-=E’=；/：F@G/，5：HIG5，6：J"G5；K：HIG6；L：F-M/；2：N@GK；O：PQG/；R：55R/；S：T3NU2；/V：3WXMK；//：T3NU5VL；
/5：T3NUOL；/6：T3NUKOOS；/K：T3NU56OV
的相似性，其 Y-((-=@系数为 V& 5L，所有分离自该地的菌株均属于 1734!群，表明该地域具有严格的地理分隔
作用。分离自河北邯郸和江苏连云港的菌株同样表现出很低的多样性，它们均属于 1734"群。
表 !" 各地域豇豆根瘤菌 #$%类群的相似性指数和多样性指数
&’()* !" %+,+)’-+./ ’01 1+2*-3+./ 45 6478*’ -9+:4(+’ 5-4, 1+55*-*0. -*;+403
地域
8’+,).>
Y-((-=@指数
邢台
J"
邯郸
F@
连云港
:C+
石家庄
3WX
武鸣
HI
宝清
PQ
德都
N@
红安
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指数
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指数
邢台 J" V& 5OR V& KL/
邯郸 F@ V& LV V& VVV V& VVV
连云港 :C+ V& LV /& VV V& VVV V& VVV
石家庄 3WX V& LV V& LV V& LV V& KSL V& 2RO
武鸣 HI /& VV V& 66 V& 66 V& 2O V& LS6 V& S2/
宝清 PQ V& 66 V& LV V& LV V& 66 V& 5L V& 6OL V& L26
德都 N@ V& 5V V& 5L V& 5L V& VV V& /2 V& 5V V& 22O /& 5K6
红安 F- V& VV V& VV V& VV V& VV V& VV V& VV V& 5L V& VVV V& VVV
!" 讨论
传统上，豇豆根瘤菌是由多种慢生根瘤菌组成的混杂群体。随着多样性研究的深入，研究工作者逐渐发
现在豇豆根瘤菌中以一定的比例存在着快生型的根瘤菌［/V，//］。本研究中也成功地分离到快生型根瘤菌，其
占豇豆根瘤菌群体的比例为 /6& LZ，并在分类地位上分属于 $% &’#())和 *% +#,-.)/01"’-.。另一方面，慢生根
瘤菌在表型和遗传型上仍表现出丰富的多样性，并在 RVZ的 173 相似性水平上分为 K 个类群。1734#、1734
$和 1734!则在系统发育上分别属于 2% 3"40/)5-.、2% +)"0/)/,#/1# 和 2% #+6"/))。1734"为供试豇豆根瘤菌
的优势群体，它无论在表型、还是在遗传型特征上均明显区别于其它供试慢生根瘤菌和分离自大豆的参比菌
株。表明豇豆根瘤菌的优势群体仍具有明显的宿主特征。
通常，根瘤菌的分布与多样性受地理因素和生态因素的影响明显［/5］。本试验分离自湖北红安、河北邯郸
和江苏连云港的菌株多样性较低，分别属于 1734!和 1734"等单一的 173群。尤其是分离自湖北红安的菌株
多样性及与其它地域菌株的相似性均很低，在系统发育上明显表现出独立性。湖北红安位于大别山南麓，具
有明显的地理隔离特征，从而使该地域的菌株在系统发育地位上区别于其它地域的菌株。耕作制度、栽培品
V226 0 生0 态0 学0 报0 0 0 5O 卷0
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图 /0 供试菌株及参比菌株 123 4567分析树状图
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种和洪涝等因素均能促使根瘤菌发生较大范围的迁移与融合，从而使特定地域的菌株多样化。当不同地域的
菌株之间发生长期频繁的交换后，这些地域的菌株在组成和多样性上可能趋同［BC］。河北邯郸和江苏连云港
等的菌株相多样性均较低，但与其它地域菌株之间的相似性则较高，可能反映出了这一现象。
本试验通过对分离自不同地域豇豆根瘤菌表型和遗传多样性研究，表明我国主要地域的豇豆根瘤菌不仅
具有丰富的多样性，而且其分布具有明显的地域特征。通过对分离自不同宿主豇豆根瘤菌的深入研究将有利
于阐明宿主植物、栽培品种等因素对豇豆根瘤菌多样性的影响。
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