全 文 ：第 25 卷第 12 期
2005 年 12 月
生　　态　　学　　报
A CTA ECOLO G ICA S IN ICA
V o l. 25,N o. 12
D ec. , 2005
线粒体D NA nad1 序列在青海云杉青藏高原台面
和周边地区种群中的变异
杨　瑞1, 3, 孟丽华1, 3, 张　茜1, 3, 刘建全1, 23
(11 中国科学院西北高原生物研究所青藏高原生物进化与适应开放实验室, 西宁　810008;
21 兰州大学干旱与草地生态学重点实验室, 兰州　730000; 31 中国科学院研究生院, 北京　100039)
基金项目: 国家自然科学基金重点资助项目 (30430560) ; 中国科学院知识创新工程方向性资助项目 (KSCX2SW 2106) ; 全国优秀博士论文作者专
项基金资助项目
收稿日期: 2004211226; 修订日期: 2005204210
作者简介: 杨瑞 (1977～ ) , 男, 甘肃临夏人, 东乡族人, 硕士生, 主要从事树木分子遗传学研究。3 通讯联系人A utho r fo r co rrespondence. E2m ail: ljqdxy@public. xn. qh. cn
Foundation item: Key P ro ject of N ational Science Foundation of Ch ina (N o. 30430560) ; Key Innovation P lan of Ch inese A cadem y of Sciences
(N o. KSCX2SW 2106) ; Special Fund of O utstanding Ph. D. D issertat ion.
Rece ived date: 2004211226; Accepted date: 2005204210
Biography: YAN G Rui, M aster candidate, m ain ly engaged in mo lecu lar genetics of trees.
摘要: 青藏高原是气候变迁的敏感区。但第四纪以来全球气候的反复变化对该地区植物分布格局的影响至今未进行过仔细研
究。线粒体DNA 在松科植物中是母系遗传, 其变异被广泛用于研究该科植物历史上由于气候变迁造成的瓶颈作用以及冰期后
扩张中形成的奠基者效应。对青海云杉位于青藏高原核心、其边缘甘肃和宁夏地区共 12 个种群 155 个个体的线粒体 nad 1 片段
的全序列进行测序, 研究该序列在各种群中的变异状况。通过测序发现该片段在青海云杉中十分保守, 在所有个体中仅发现由
于重复序列造成的 5 种单倍型 (H ap A , H ap B , H ap C, H ap D 和 H ap E)。高原核心的所有种群均只有H ap A , 而所有的 4 种单
倍型都在高原边缘的甘肃地区存在, 但这一地区仍然是H ap A 占优势; 但是在远离高原的宁夏地区则存在 5 种单倍性; 多样性
的变异趋势是宁夏地区高于高原边缘的甘肃地区, 而甘肃地区又显著高于高原核心地区。这一结果表明, 在过去气候变迁过程
中, 不同地区的青海云杉种群经历了不同的气候影响, 这种影响造成的奠基者效应或者瓶颈作用是造成目前这种遗传多样性分
布格局的主要原因。现有的单倍型分布格局, 特别是高原上所有间断分布种群拥有相同的单倍型表明, 森林回迁中的奠基者效
应应是更为重要的因素。
关键词: 青海云杉; 线粒体DNA nad 1; 序列变异; 瓶颈作用; 奠基者效应
文章编号: 100020933 (2005) 1223307207　中图分类号: Q 948, S151　文献标识码: A
The m itochondr ia l D NA nad1 sequence var ia tion of P icea crass if olia (P inaceae)
in the Qingha i-T ibetan Pla teau pla tform and adjacen t popula tion s
YAN G R u i1, 3, M EN G L i2H ua1, 3, ZHAN G Q ian1, 3, L IU J ian2Q uan1, 23 　 (1. Q ing ha i2T ibet P la teau B iolog ica l E volu tion
and A d ap ta tion L abora tory , N orthw est P la teau Institu te of B iology , Ch inese A cad emy of S ciences, X in ing 810008, Ch ina; 2. K ey L abora tory of
A rid and G rassland E cology , L anz hou U niversity , L anz hou 730000, Ch ina; 3. G rad ua te S chool of the Ch inese A cad emy of S ciences, B eij ing
100039, Ch ina). A cta Ecolog ica S in ica , 2005, 25 (12) : 3307～ 3313.
Abstract: T he Q inghai2T ibetan (Q 2T ) P lateau is the h ighest and largest p lateau in the w o rld, w ith an average elevat ion of～
415 km and an area of 215×106 km 2. Its vegetat ion is considered to be h igh ly sensit ive and vu lnerab le to global clim ate change
because p lan t grow th and distribu t ion in the region depend great ly on su rvivab le temperatu res. T he clim atic o scilla t ions of the
Q uaternary since 2 m illion year ago resu lted in several glacial and in terglacial cycles du ring w h ich glaciers developed, expanded
and receded in circumpo lar and moun tainous regions. It rem ains unknow n how the p lan ts in the Q 2T P lateau had responded to
the Q uaternary clim atic o scilla t ion. T he vegetat ion of the no rtheast Q 2T P lateau is dom inated by alp ine m eadow and desert2
steppe w ith sparse fo rests scat tered w ith in it. To ob tain a better understanding of the h isto rical b iogeography of one
const ituen t species of the fo rests in th is region, w e exam ined the m itochondrial DNA (m t DNA ) varia t ion of P icea crassif olia
Kom. (P inaceae) , a key species in the sparse fo rest islands of the p lateau. T h is fragm en ts is paternally inherited acco rding to
the o ther researched m em bers of P inaceae and has been used to detect the bo tt leneck imp rin ts and founder effects du ring the
po stglacial reco lon izat ions of the con ifers of th is fam ily in response to the past clim atic o scilla t ion. In the p resen t study,
m tDNA nad 1 w as sequenced fo r 155 individuals of P. crassif olia from 12 popu lat ions located respect ively in the Q 2T P lateau
p latfo rm (6 popu lat ions) and adjacen t regions (Gansu region, p lateau edge, 3 popu lat ions and N ingx ia region, 3 popu lat ions).
T h is DNA fragm en t is h igh ly conserved in P. crassif olia , and on ly 5 hap lo types (H ap A , H ap B , H ap C, H ap D and H ap E)
w ere recovered w ith in all samp led individuals, and H ap A is the commonest. T he p lateau p latfo rm fixed on ly H ap A , bu t fou r
hap lo types occu rred in the edge popu lat ions w ith H ap A dom inan t. How ever, a ll of 5 hap lo types w ere found in the N ingx ia
region w ith even frequencies and the to tal diversity of th is region is the h ighest. T he diversity of Gansu region at the p lateau
edge is m uch h igher than that of the p lateau p latfo rm. T hese resu lts indicate that bo th the p lateau p latfo rm and p lateau edge
popu lat ions m ust have suffered in tensive bo tt leneck s o r founder effects du ring the po stglacial reco lon izat ions due to the past
clim atic o scilla t ions, and the fo rm er region suffered mo re than the lat ter. T he hap lo type distribu t ion pattern of the p resen t
invest igat ion seem s fu rther to indicate that the common fix tu re of the sam e hap lo type among the dist junct popu lat ions of the Q 2
T p lateau p latfo rm w as m ain ly caused by the founder effect du ring the fo rest reco lon izat ion in th is region.
Key words: P icea crassif olia; m itochondrial DNA nad 1; varia t ion, bo tt leneck s; founder effects
第四纪冰期气候的反复变化对整个地球、特别是对北半球的生物分布格局产生了重要影响[1 ]。在冰期, 高纬度地区常形成
冰原, 相应在北温带的高海拔山区形成山地冰川, 这一时期的生物向低海拔地区迁移, 或者在原分布地域的小地点保存, 但种群
相应缩小; 在间冰期或者冰期结束后存在于避难所的种群再回迁 ( re2co lon izat ion) , 而原地保留的小种群则再次扩张
(expansion) ; 这种气候的反复变迁造成植物群体遗传结构产生重大变化: 回迁的种群由于受到奠基者效应 (founder effect)、在
极端生境原地保存的种群由于小种群效应而带来的遗传漂变 (genetic drift) 都使得遗传多样性降低; 但是位于避难所的种群,
则保留有较完整与较高的遗传多样性[2, 3 ]。这种遗传结构变化模型最近在欧洲、北美洲以及部分热带生物中都得到了检验和证
实, 并与古生物学等其它证据相吻合[1 ]。但是, 只有部分研究涉及到亚洲的生物类群, 如对两种杉木 (Cunn ing ham ia kon ish ii 和
C. lanceola ta)的分子谱系地理学 (mo lecu lar phylogeography)研究等[4 ]。
等位酶、细胞器基因标记和核基因标记均能反映种子植物种群历史的变化过程[5 ] , 但是由于细胞器基因是单亲遗传, 具有
更小的有效种群尺度 (sm aller effect ive popu lat ion size) , 在反映种群群体遗传结构的变化比后者更为明显[6 ], 特别是那些母系
遗传的细胞器DNA 片段, 它们在追溯现代种群建立过程中的种子来源方面更具有优势[7 ]。松科多个属植物的人工杂交与分子
标记结合表明线粒体在该科中为母系遗传[8, 9 ]; 尽管对部分DNA 片段的测序表明, 线粒体DNA (m tDNA )序列在该科种内的变
异十分保守, 但仍在种内检测出一定的变异, 被广泛用于种群群体的遗传结构研究[10 ]。N ad 1 基因编码线粒体呼吸传递链的复
合体É ——泛醌氧化还原酶 (NADH: ub iqu inone ox ido reductase)的 nad 1 亚基, 是一个结构较为稳定的线粒体基因, 由 5 个外显
子构成 (nad 1öA 2E) [11 ]。该基因片段外显子B 和C 之间的内含子区具有重复插入 (repeated indel) , 可以区分出多种单倍型, 这些
单倍型的群体分布式样已成功地应用于松属 (P inus)及云杉属的部分种类 (如挪威云杉 P icea abies, 欧洲云杉 P. obova ta, 黑云
杉 P. m ariana 等)的分子谱系地理学和物种间基因流造成的渐渗研究[12～ 17 ]。
第四纪冰期, 中国虽然没有直接被冰原覆盖, 但温度急剧下降造成东部的森林南移[18 ]。依据古花粉证据, 最后一次大冰期
(约 18000～ 20000 a 前)时中国的植被重建中也发现北部的针叶林、暖温带落叶阔叶林南移, 而西北部无森林存在[19 ]。中国西部
的青藏高原在第四纪全球气候开始剧烈变化时已经接近目前的高度[20 ]。由于其特殊的生存环境, 青藏高原地区应该是对温度
最为敏感的地区之一。古孢粉的证据表明, 在冰期高原上不存在森林植被, 这些森林退缩到高原东南部的横断山地区; 而间冰期
和冰期后的全新世森林植被在高原上的分布面积又进一步扩大[21 ]。森林植被的变化是生物对冰期气候变迁响应的重要指示;
但是, 依据古孢粉证据建立的森林变迁途径不能确定具体植物种类 (古孢粉极难确定到某个种) 的避难所以及这些物种在某一
地区的增长或者缩小过程。此外, 由于古孢粉取样过于稀疏, 不能完整反映一个物种现代种群的历史变化过程。而对现代种群密
集取样的分子谱系地理学则能克服这些缺点, 使其在研究物种种群的历史变化过程方面具有更为重要的优势[22 ]。青海云杉
(P icea crassif olia Kom. )是青藏高原东北部残存森林片段阴坡的主要建群种, 分布在青海西部、东南部、北部、甘肃东南部以及
宁夏的贺兰山地区[23 ]。该树种是青藏高原东北部高原台面上森林间断分布的典型代表, 可能反映了该地区森林与高寒草甸或
者荒漠生态系统在第四纪以来气候反复变化中的交替过程。这些现代分布森林片段有 2 种可能存在的来源: (1)是在冰期气候
变化早期开始片段化, 并在冰期气候变化过程中一直在原地保留至今; (2) 冰期后森林回迁 (reco lon izat ion) 入侵青藏高原造成
8033　 生　态　学　报 25 卷
森林连续分布, 由于全新世以来的温度下降或者人为活动影响才造成现今的森林间断分布。如果是由于前者造成的森林片段分
布, 这些在高原台面原地保留的各个群体, 由于遗传漂变遗传多样性减少; 后者同样造成遗传多样性减少, 但和前者不同的是,
这些间断的种群由于是共同的入侵而留下的后代, 都应该拥有相同的遗传结构 (如单倍型或者其它分子标记产物) ; 但是无论如
何, 在高原边缘的种群由于受瓶颈效应相对较弱或者处于奠基者效应的起始阶段, 应该保留比高原台面更为丰富的遗传多样
性。本文主要目的是: (1)通过对种群测序检验青海云杉 nad 1 基因的 in tron2 是否存在变异, 能否在所测个体中区别出多种单倍
型? (2)如果存在变异, 这些单倍型在高原台面和边缘种群中是否存在不同的地理分布式样?而远离高原地区的宁夏贺兰山是否
存在更高的遗传多样性?
1　材料和方法
111　实验材料
本研究所用青海云杉针叶采自间断分布森林片段的 12 个种群 (表 1) , 其中 6 个种群是分布在青藏高原台面上, 3 个种群来
自甘肃的高原东北部边缘地区, 3 个种群来自宁夏贺兰山 (图 1)。每个种群采 5～ 18 个个体。个体之间间隔 100m 以上, 共采 155
个个体。针叶在野外使用硅胶迅速干燥。
图 1　青海云杉研究种群及各单倍型分布图
F ig11　T he distribu tional range and hap lo type distribu tion of P. crassif olia
112　DNA 提取、PCR 扩增、纯化和测序
总 DNA 的提取采用改进后的 CTAB 法[24 ]。每个个体取 8～ 10 片针叶, 提取总 DNA。使用 nad 1 F ( GA TC
GGCCA TAAA T GTA CTCC) 和 nad 1 R (CCCCA TA TA T TCCCGGA GC)引物来扩增 nad 1 基因的全DNA 片段。扩增反应体系
为 25 Λl, 反应体系包括: 10～ 40ng 总DNA , 50mmo löL T ris2HC I, 115mmo löL M gC l2, 250ΛgömL BSA , 015mmo löL dN T P s,
2Λmo löL 引物 和 0175U T aq 酶 1 扩增反应在 Tpersonal PCR System (B iom etra) 上进行, 程序为: 70 ℃ 4 m in→94℃ 1 m in,
52℃ 20 s, 72℃ 2 m in, 4 个循环→94℃ 20 s, 52℃ 20s, 72℃ 2 m in, 36 个循环→72 ℃ 7 m in. PCR 产物用纯化试剂盒纯化
(Casarray, Shanghai, Ch ina)。
测序引物根据 GenBank 中云杉属已经报道的 nad 1 全序列设计, 使用的引物序列见表 2。使用 10Λl 的反应体系,D YEnam ic
D ye T erm inato r (Am ersham ) , 215Λl, 引物 5 pmo l, 模板 25～ 50ng 。测序反应的条件如下: 95℃ 8s→ 95℃ 15s, 50℃ 15s, 60℃
90s, 31 个循环, 60℃ 90s, 4℃ 5m in。测序反应的产物按如下步骤进行纯化: 将测序反应的产物转入含有 22185Λl 无水乙醇和 1Λl
N H 4A C 的溶液中, 室温放置 15m in, 4℃ 12000röm in 离心 22m in, 弃上清液, 加入 150Λl 70% 乙醇洗涤沉淀。4℃ 12000röm in 离
心 10m in, 弃上清液, 室温放置 30m in 自然风干, 加入 10Λl L oading so lu t ion, 用M egabase 500 A utom ated DNA 测序仪收集数
据。每段序列正反测序相互重合达 90% 以上。
903312 期 杨　瑞等: 线粒体DNA nad 1 序列在青海云杉青藏高原台面和周边地区种群中的变异 　
0133　 生　态　学　报 25 卷
表 2　测序使用引物
Table 2　Pr imers for sequenc ing
引物名称
P rim er nam e
方向
D irection
引物序列
P rim er sequence (5′～ 3′)
N ad 12F Fo rw ard GA TCGGCCA TAAA T GTA CTCC
N ad 12R Reverse CCCCA TA TA T TCCCGGA GC
N ad 12590F Fo rw ard CTCGGCA GA GGAA GGGGCT GT
N ad 12840F Fo rw ard CTCGGA GGGCGA GCGT TCGT
N ad F Fo rw ard CTCTCCCTCA CCCA TA T GA T G
N ad R Reverse A GA TCCCCA TA TA T TCCCGG
113　数据处理
序列用 CLU STAL W [25 ]进行对位排列 (a lignm en t) , 寻找
不同的序列。根据每个种群中每种单倍型的频率 (表 1) , 用
A RL EQU IN 软件①计算 FCT、FST , 结果的可靠性用 1000 次
重复的自展检验来完成。种群总的基因多样性 H t (N ei) 用
H ap lodiv 计算。为检验海拔对两个地区单倍型多样性的影响,
计算每种单倍型在每个居群中的多样性指数D [26 ] , D 值越大,
多样性越高。
2　结果
通过对 12 个种群共 155 个体的 nad 1 in tron2 进行序列测
定, 共发现 5 种不同的序列, 可分为 5 种单倍型 (H ap lo type) : 单倍型A (H ap A )的序列长 991 bp , H ap B 序列长 1025 bp , H ap C
序列长 1059 bp , H ap D 序列长 1093bp , 和H ap E 序列长 1127bp 它们之间的差异在于: H ap B、H ap C、H ap D 和H ap E 4 种单倍
型在离 5′端 466bp 开始分别有 1 至 4 个 34bp (CCCCCTCCGT T GTCA GGGGA GCGA CT TCGTA CCT) 的重复序列, 它们在
GenBank 中的序列号从A Y786580 至A Y786584。它们在所研究种群中的分布分别见表 1 和图 1: H ap A 是分布最广的单倍型,
存在于每一个居群中, 并占有绝对的优势; H ap B、H ap C、H ap D 分别发现于甘肃的 3 个种群中, 每个种群均只发现有 1 个个
体。每个种群的多样性指数D 值, 在甘肃的 3 个种群D 值分别为 0111, 0113, 0120, 在宁夏的 3 个种群D 值分别为 0171, 0183
和 0184, 而其余高原面上的种群D 值均为 0 (表 1)。
宁夏贺兰山地区种群总的基因多样性H t (N ei)为 0180634, 甘肃地区种群总的基因多样性H t (N ei)为 0114435, 而高原面上
所检测的所有种群均只有 1 种单倍型, H t (N ei) 为 0; 3 个地区总的基因多样性 H t (N ei) 为 0134176。通过分子变异分析
(AM OVA ) , 3 个地区间的分化指数 F ct 为 0142261 (p < 0105) , F st 为 0142188 (p < 01001) , 表明 3 个地区之间存在显著的遗传
分化。
3　讨论
在云杉中线粒体基因母系遗传, 仅通过种子传播, 在研究种群的历史变化过程中比其它分子标记具有更大的优势[27～ 30 ], 但
是线粒体基因DNA 片段十分保守[17, 31 ]。欧洲广布的挪威云杉在 nad 1 in tron 2 内含子含有两处重复序列: 一是 34 bp 的重复,
在研究的 940 棵树中, 共发现有 1～ 6 个插入的重复; 二是紧靠该重复区, 发生 32 bp 的重复, 在所有研究的树中共有 0～ 7 个重
复[15, 16 ]; 这一重复区在欧洲云杉和黑云杉中可能也存在, 因为通过 PCR 2R FL P 对这一区域进行多态检测时均发现了不同的多
态片段[17 ], 形成种内的多种单倍型。而在其它已经研究的云杉中, 如红云杉 P. rubens 未发现该位点DNA 片段的重复[17 ]。对青
海云杉 nad 1 in tron 2 进行全序列测定, 研究发现在 155 个个体中仅在挪威云杉的第 1 个重复位点发生 0～ 4 个 34 bp 的重复,
而在第 2 个重复位点未发现插入重复。这些重复将青海云杉所测的 155 个个体分为 5 种单倍型。
青海云杉 5 种单倍型在所研究群体中的分布呈现一定的规律: 高原台面的 6 个种群均只固定 H ap A ; 而甘肃的 3 个种群也
是H ap A 占优势, 但在每一个种群发现有另一种不同的单倍型; 宁夏地区则发现所有的 5 种单倍型, 并且各种单倍型分布的频
率相对较多, 总的遗传多样性 (H t)较高。对于这种单倍型分布最好的假设是, H ap A 是最原始的, 它广布于现在分布的各个种
群中; H ap B , H ap C 和 H ap D 后来随机在甘肃和宁夏的种群中产生。但是, 这种插入突变在十分保守的线粒体DNA 中需要很
长的时间, 如成万上百万年以上才能产生如此一个突变[17, 31 ]。在这种情况下, 这些单倍型的地理分布模式只能是由于历史环境
变迁和种群遗传结构改变造成的。5 种单倍型在环境变迁之前已经存在, 且在各种群中以较为均衡的比例存在, 如本文发现的
宁夏地区的种群遗传结构式样。
高原面上森林片段每个种群单一的遗传多样性有两种可能的原因: 冰期气候变化开始就片段化的森林种群由于气候反复
变迁遗传漂泊造成遗传多样性减少, 或者冰期后森林回迁过程中奠基者效应所形成的。研究结果显然支持后者, 这是因为如果
是前者, 在冰期连续的森林被分割成孤立的小种群, 并且种群规模迅速减小; 而在间冰期居群又迅速扩大; 如此反复应使得 5 种
单倍型由于遗传漂泊而随机高频率固定在不同的居群中。但高原间断的森林片段拥有相同的单倍型, 则表明是由于森林回迁过
程中奠基者效应所造成的。已有的古孢粉证据表明, 在全新世中期的冰期后青藏高原东北部森林面积进一步增加, 而在全新世
晚期森林再次锐减, 并伴随高寒草甸与灌丛的发育替代[21 ]。由于冰期时的地理温度效应, 高原面的温度比边缘低很多, 即使在
高原面上的部分地区还存在具有不同于 H ap A 的其它少量单倍型 (如 H ap B 和 H ap C) 个体, 在回迁入侵过程中也被大量的
113312 期 杨　瑞等: 线粒体DNA nad 1 序列在青海云杉青藏高原台面和周边地区种群中的变异 　
① h ttp: öölgb. un ige. chöarlequ inö
H ap A 个体在随后的几代中排挤。在回迁入侵过程中, 奠基者效应使得所有的种群都拥有相同的单倍型。这次冰期后的森林回
迁应该是连续的, 而这些种群的现代间断分布则可能是更晚时候, 由于全新世后期温度下降或者人为活动影响造成的。高原台
面上单倍型的这种分布式样暗示青藏高原东北部高原台面上在冰期后经历了一次连续的森林回迁入侵、再间断的过程, 这显然
与古植物学全新世早中期森林花粉增加、而在中后期再次锐减的证据相吻合[32 ] , 但是否能得到其它证据的支持仍然有待进一
步研究。在这些森林岛屿之间的高寒草甸和荒漠地区, 进行了炭屑物 (charcoal)的寻找, 结果发现在绝大多数挖掘的地层均能找
到大量的炭屑物, 这些炭屑物经鉴定后与目前森林岛屿的种类一样, 为圆柏属 (J un ip erus)和云杉属 (P ieca) 植物, 年龄测定是在
5000～ 8000 a 之间。这些结果都共同暗示青藏高原东北部可能在全新世有一次连续的森林回迁入侵过程, 从森林演变到如今以
高寒草甸和荒漠为主的生态系统可能发生在全新世离现今非常近的一段时间内。
甘肃地区的种群, 位于高原边缘, 可能是青海云杉在冰期的避难所之一, 但是, 由于仍然处于青藏高原, 不可避免遭受冰期
由于高原带来的巨大气候影响, 造成冰期和间冰期种群的反复缩减和扩增, 瓶颈效应造成遗传多样性减少, H ap A 占优势, 同时
还局部保留其它的单倍型。冰期后, 占优势的H ap A 向高原台面扩散, 形成高原面上的种群均只拥有H ap A。但是我们的研究
发现青海云杉在高原之外的贺兰山地区拥有更为丰富的遗传多样性, 这一地区应是青海云杉最为主要的冰期避难所, 冰期后从
该山区向整个高原扩散, 由于高原边缘的甘肃地区处于扩张的前沿, 尽管存在奠基者效应, 仍然比处于扩张后期的高原台面拥
有更为丰富的遗传多样性。总之, 研究结果表明, 青海云杉 nad 1 基因的 in tron2 存在变异, 能够将所测的个体分为 5 种单倍型,
这些单倍型的地理分布式样初步表明, 多样性的变异趋势是宁夏地区高于高原边缘的甘肃地区, 而甘肃地区又显著高于高原核
心地区; 宁夏地区由于远离高原, 因而保留了最为丰富的遗传多样性, 冰期后森林从避难所回迁而造成的奠基者效应是目前这
种遗传多样性分布格局的主要原因。
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