全 文 ：第 26卷第 3期
2006年 3月
生 态 学 报
ACTA EC0L0GICA SINICA
V01．26．No．3
Mar．．2oo6
夹竹桃强心总甙灭螺活性与机理
王万贤 ，杨 毅H，王 宏 ，舒丽慧 ，张 勇 ，张佳磊 ，侯金华
(1．湖北大学生命科学学院，武汉 430062；2．上海交通大学环境科学与工程技术学院，上海 200240)
摘要：血吸虫病(Schistosomiasis)是严重危害人民身体健康的疾病。钉螺是血吸虫的唯一中间寄主，是血吸虫生活周期中最脆弱
环节，灭螺能有效控制血吸虫病，保护湿地和水资源。按强心总甙提取方法，用有机溶剂提取，从 118．1940g(相当于 lOOg干材
料)夹竹桃新鲜叶中得到 0．9815g夹竹桃强心总甙。将强心总甙按 5、10、15、20、25、30mg／L配制成6个不同浓度梯度的处理溶液
处理钉螺。取活钉螺 100只为 1组，每 20个装入一个尼龙网袋中，分别将各组(5袋／组 ；网孔 2mm)钉螺浸入盛有 2000g不同浓
度的夹竹桃强心总甙灭螺剂水溶液的玻璃缸中，设 1mg／L氯硝柳胺水溶液和无氯清水对照。分别于处理 1、2、3、4、5d后，将各处
理中的钉螺随机取出 1袋。用无氯水冲洗数次，再放入清水中静置 1d，然后作存活检查：在解剖镜下针刺无反应的证实死亡。结
果显示夹竹桃强心总甙具有很好的毒杀钉螺活性，用20mg／L的夹竹桃强心总甙的水溶液处理 3 4d的效果与 lmg／L氯硝柳胺
溶液处理 2—3d的灭螺效果相当；经统计分析：用其水溶液灭螺的 和 ∞浓度分别是 4．0500mg／L和 22．2500mg／L。用 ∞∞
浓度的夹竹桃强心总甙溶液处理 50个钉螺之后。取活螺用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行测试，在处理 6h时，显示各处理样
品的酶活高于对照组 ，表现为酶带颜色加深 ，有新的酶带出现；而在处理 12h和 24h后，各处理的样品酶带浅于对照组。酶带颜
色逐渐变浅，直到消失。采用蒽酮显色法测定经夹竹桃强心总甙处理后钉螺软体的糖原含量糖原含量显著下降，减少幅度从
9．9％到 32．6％；钉螺经夹竹桃强心总甙处理后蛋白质含量的变化不明显。分析了强化感作用植物夹竹桃植物新鲜叶中强心总
甙的灭螺活性，并在微观领域探究其化感作用导致钉螺的形态病理以及糖代谢 、蛋白质代谢等生理变化等方面所表现出的杀伤
钉螺的机理，由此获得强化感作用植物夹竹桃灭螺的化学生态学证据，为研制新的具中国特色的植物成份灭螺剂打下了基础，
并为合成仿生灭螺剂以及最终构建生态工程中强化感作用植物群落灭螺提供理论依据。
关键词：强心总甙；夹竹桃；钉螺；化感作用
文章编号：1000．0933(2006)03．0954．06 中图分类号：R184．38 文献标识码：A
Efect of cardiac glycosides from Nerium indicum on Oncomelania hupensis
WANG Wan—Xian ，YANG Yi ，WANG Hong2，SHU Li．Hui
， ZHANG Yong ，ZHANG Jia．Lei ，HOU Jin．Hua (1．
School of蜘 Science，Hubei University。Wuhan 430062，China；2．School ofEnvironmental Science and Engineering，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai
200240，China)．ActaEcologica Sinica，2OO6，26(3)：954—959。
Abstract：The Schistosomiasis is a serious diseases threatening human being’s health．Oncomelannia hupensis is the only
intermediate host of Sehistosome，and is the most fragile during its life cycle．To effectively control the occurrence of
Schistosomiasis and protect wetland and water resource。it is an essential practice to destroy snails of O．hupensis．In the present
study，cardiac glycosides were extracted from fresh leaves of Nerium indicum Mill and efects of the cardiac glycosides on mortality
of O．hupensis were investigated．Six concentrations of the cardiac glycosides(5，10，15，20，25，30mg／L)were used to treat
O．hupensis，and treatments of 0．hupensis with 1 mg／L niclosamidum and dechlorided water were set as contro1．0．hupensis
that had been treated with varying concentrations of cardiac glycosides for 1～5d was randomly chosen for testing the mortality after
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30471506)；湖北省中药生物技术重点实验室基金资助项目(4300620103)
收稿日期：2005—06—29：修订日期：2006．O1．02
作者简介：王万贤(1949～)，男，湖南汉寿人，教授，主要从事植物生态及环境生物工程研究．
*通讯作者 Author for co~espondence．E-mail：yangyiyy2006@yahoo．com．cn
Foundation l~m：The pr0ject was suppofled by National Natural Science Foundation of China(No．30471506。39670654)and Hubei Provincial Kev Laboratory of
Biotechnology of Traditonal Chinese Medicine
Received da te：2005-06—29；Accepted date：2006—01—02
Biography：WANG Wan—Xian，Professor mainly engaged in plant ecology and environmental bioteehnology
．
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3期 王万贤 等：夹竹桃强心总甙灭螺活性与机理 955
l d incubation in water folowing thoroughly rinsing with dechlorided water．0．hupensis that did not respond tO needle puncture as
observed under a dissecting microscope was defined as death．Our results show that the cardiac glycosides obtained from fresh
leaves of N．indicum efectively kiled 0．hupensis．The mortality of 0．hupensis treated with 20mg／L cardiac glycosides for 3
— 4d was similar to that treated with l mg／L niclosamidum for 2～3d．Statistical analyrsis revealed that the LD5o and LD90 values
for the cardiac glycosides were 4．0500mg／L and 22．2500mg／L，respectively．Fifty 0． hupensis treated with the LD5o
concentration of cardiac glycosides was used to do PAGE test．The treated samples displayed higher activities of enzymes than the
controls；the color of enzyme bands was enhanced and new enzyme bands were induced after 6h treatment．However，the color of
enzyme bands was lower than that of the controls，and eventually disappeared after 1 2 and 24h treatments．There was a marked
decrease in glycogen content(ranged from 9．9％ tO 32．6％)in response to treatments with the cardiac glycosides．The protein
contents were not signifcantly changed by the treatments．This paper anMyzed the molluscicidal activity of cardiac glucosides
extracted from N．indicum and elucidated the mechanisms underlying the alelopathical efects of the cardiac glucosides on
morphological pathology，metabolisms of sugar and protein of 0．hupensis．We have obtained chemiecological evidence that N．
indicum is capable of kiling 0．hupensis．These results provide the foundation for developing new plant molluscacide，and
scientifc grounds for synthesizing biomimetic moluscacide and constructing plant community to destroy 0．hupensis．
Key words：cardiac glycosides；Nerium indicum mil；Oncomelania hupensis；allelo~thy
血吸虫病(Schistosomiasis)是严重危害人民身体健康的疾病u 。钉螺(Oncomelania hupensis Gredler)是 日本
血吸虫(Schistosomajaponicun Katsurade)的唯一中间寄主 ]，是血吸虫病传播中不可缺少的环节_3]。另一方面，
钉螺也是血吸虫生活周期中最脆弱的一环，灭螺能有效地减少血吸虫病的传播 j¨。近半个世纪以来，灭螺措
施倍受重视，成为控制血吸虫病的重心。利用化学药物灭螺成为首选方法。埃及于 1940年用无机化合物
CuSO 等灭螺b]，从 1946年到 1955年，大约有 7000种化学药物用于灭螺实验 ，到 1955年，筛选出了高效的
五氯酚钠(pentachloropheno1)，20世纪 60年代早期出现了氯硝柳胺(niclosamidum)。CuSO,灭螺效果好，但易被
土壤和生物体吸收，高 pH值时失效；五氯酚钠灭螺效果好，但对非靶生物具有广谱毒性，早已被我国和 日本
等政府禁止使用；氯硝柳胺对钉螺生命周期的所有阶段都有效，并且对人，家畜和农作物无毒，但价格昂贵，对
鱼类极为有害。尽管如此，到目前为止，化学控制仍然是灭螺的最重要方法。在流行病学上重要的水接触点
集中使用，不仅可维持 95％ 的灭螺率，也可减少大面积灭螺的费用。
为了避免化学合成灭螺剂对环境的污染，人们一直想获得纯天然的植物灭螺药物。自Archibsld第 1次用
Balanites aegyptiace的果实进行灭螺以来，至今已有 1000余种植物用于灭螺试验 ,¨71；在这方面我国研究人员
也做了大量的研究工作 ，但研究水平仍然处于较低的阶段，文献报道仅仅是用植物的粉末直接灭螺，或用植物
提取的混合物灭螺 ，研究的结果不能进行标准化评价，难以在国际上被认可。
前期研究表明：活体夹竹桃具有毒杀钉螺作用，在一桶清水(约 20kg)中投放 2—3片鲜叶能在 3～4d内杀
灭所饲养的全部实验螺 。在此基础上，从夹竹桃新鲜叶中提取、分离、纯化得到化感作用灭螺活性物质夹竹
桃强心总甙，并对其灭螺活性与机理进行了研究。
1 材料和方法
1．1 实验材料
实验用钉螺采自湖南省洞庭湖区，转入23℃温室饲养，选用能正常活动的阴性成螺作为实验材料。实验
用夹竹桃新鲜叶采自湖北大学校园内。
1．2 植物材料的处理
按强心总甙提取方法 。将夹竹桃新鲜叶洗净，加 75％乙醇适量灭活，搅碎后，用 10倍于鲜叶重量的
70％～75％乙醇加热至70qC温浸12h，提取3次后去除残渣 ，减压回收乙醇，沉淀过滤除杂；接着用乙醚处理浓
缩滤液，弃醚层；再在水溶液中加饱和碱式醋酸铅水溶液，过滤去沉淀；然后将滤液通入 H s气体之后再次过
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滤去沉淀；浓缩滤液静置可析出结晶或快速风干成固体状物质，便得到夹竹桃强心总甙。从 118．1940g新鲜
叶(相当于lOOg干材料)中获得0，9815g夹竹桃强心总甙。
1．3 灭螺活性的测定
实验采用浸泡法。将夹竹桃强心总甙按 5、10、15、20、25、30mg／L配制成 6个不同浓度梯度的处理溶液。
取活钉螺 100只为 1组，每 20个装入一个尼龙网袋中，分别将各组(5袋／组)钉螺浸入盛有 2000只不同浓度的
夹竹桃强心总甙灭螺剂水溶液的玻璃缸中，另设 1mg／L氯硝柳胺水溶液和无氯清水对照。实验温度控制在
(23士1)oc。分别于处理 1、2、3、4、5d后，将各处理中的钉螺随机取出 1袋，用无氯水冲洗数次，再放入清水中
静置 1d，然后作存活检查：开厣爬行者为活螺，余下的用敲碎和解剖针刺的方法。鉴别死活。实验重复 3次，
取其平均值作为实验结果。
1．4 同工酶电泳分析
用夹竹桃强心总甙按低于 ∞浓度配制溶液。将 5O个钉螺分别浸养于浓度为 1．5、2．0、2。5、3．0、3．5和
4．0mg／L夹竹桃强心总甙溶液中，处理 6h，12h和24h后分别取出活钉螺，并用无氯清水漂洗干净，吸干水分，
敲碎螺壳，取出整个软体组织，加磷酸缓冲液 们¨滴／螺，冰浴匀浆。匀浆液0~C 8000r／min冷冻离心，上清液与
溴酚蓝指示剂等量混合后作为电泳样品。正常饲养螺作为对照组。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。使用
Hoefer SE600垂直板电泳仪，所有电泳及染色药品均为亚法公司进口分装。贮液配制参照 B．D．Hames和 D．
Rickwood等以及 Hoefer公司电泳指南。采用Tris—Gly高 pH不连续缓冲系统(7．5％分离胶一3．75％浓缩胶)，板
距 1mm，板胶 16mm×17mm。每槽加样 15／A，恒流 20mA，22~C条件下电泳 6h左右。染色，冲洗，固定，拍照。
1．5 夹竹桃强心总甙对钉螺软体组织重量的影响
夹竹桃强心总甙及使用剂量与同工酶电泳相同，另正常饲养螺作为对照组。每组使用 50只大小基本一
致的成螺，浸杀 2d后取出整个软体组织，称量湿重，烘箱常温吹干，再称量干重，磨粉。
1．6 夹竹桃强心总甙对钉螺糖原的影响
用钉螺软体组织重量测定后的干粉。每次取样 10mg左右。加 30％KOH溶液2rd，置沸水浴 20ml ，冷却后
加入 95％乙醇 lOml，离心后沉淀物即为糖原。采用蒽酮显色法。反应呈现的绿色，用 721分光光度计在
620nm处比色，读取光密度值。用葡萄糖作标准曲线。实验重复3次，平均值作为实验结果。
1．7 提取物对钉螺蛋白质的影响
与糖原测试样品相同。KND一04全自动凯氏定氮仪，上样量 30mg左右。按蛋白质含量 ：6．25×氮含量计
算。实验重复3次，平均值作为实验结果。
2 结果与分析
2．1 夹竹桃强心总甙灭螺活性结果与分析
用不同浓度的夹竹桃强心总甙水溶液处理钉螺，在不同时间的处理下，钉螺死亡率存在差异。其规律是
随处理浓度的增加。钉螺死亡率呈上升趋势。15～20mg／L以上的夹竹桃强心总甙灭螺剂水溶液具有 100％的
明显毒杀钉螺致死效果(表 1)。
裹 1 夹竹桃强心总甙灭螺效果统计
氯硝柳胺是普遍使用的化学灭螺剂。将夹竹桃强心总甙的灭螺效果与之对照，可知 20mg／L的夹竹桃强
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心总甙的水溶液约与 1mg／L氯硝柳胺溶液的灭螺效果相当。不过夹竹桃强心总甙的毒效较氯硝柳胺略慢。
用 1mg／L氯硝柳胺溶液处理钉螺2—3d可达 l00％死亡，而用 20mg／L的夹竹桃强心总甙水溶液处理需要 3～
4d才能达到同样的效果。
2．2 夹竹桃强心总甙灭螺 ∞加和LD帅值分析 30
研究结果显示夹竹桃强心总甙具有很强的活性。
经统计分析：用其水溶液灭螺的 卯和 LD帅浓度分别
是4．0500mg／L和22．2500mg／L(图 1)。 20
2．3 酯酶同工酶电泳结果与分析 l量
得到的EST电泳图谱如图 1、图2、图3所示。未做
酶谱的薄层扫描，但从凝胶显色时颜色的深浅可以大致 6 10
判断酯酶的活性强弱。在处理 6h时，显示各处理样品 糖
的酶活高于对照组，表现为酶带颜色加深，有新的酶带
图2 夹竹桃强心总甙处理 6h时钉螺酯酶同功酶图谱
Fig．2 EST isozyme profiles after treated in 6h
CK，CK ，CK ：对照样品 Samples controled；1，1 ：浓度为4．0mg／L的
夹竹桃强心总甙处理样品 Samples treated by 4．Omg／L of the cardiac
glycosides ofN．indium Mil1．；2，2 ．浓度为 1．5mg／L的夹竹桃强心总
甙处理样品 Samples treated by 1．5mg／L of the cardiac glycosides of N．
indicum Mil；3，3 ：浓度为 2．5mg／L的夹竹桃强心总甙处理样品
Samples treated by 2．5mg／L of the cardiac glycosides of N．inclicum Mil；
4，4 ：浓度为3．0mg／L的夹竹桃强心总甙处理样品 Samples treated by
3．Omg／L of the cardiac glycosides of N．indium Mil；5，5 ：浓 度 为
3．5mg／L的夹竹桃强心总甙处理样品 Samples treated by 3．5mg／L of the
cardiac glycosides of N．indium Mil1．；6，6 ：浓度为2．0mg／L的夹竹桃
强心总甙处理样品，图2与图 3的注释相同 Samples treated by 2．0mg／
L of the cardiac glycosides of N．ind／cum Mil1．Same n0te8 used in Fig．2
and Fig．3
图3 夹竹桃强心总甙处理 12h时钉螺酯酶同功酶图谱
Fig．3 EST i8ozyme profiles after treated in 12h
CK l l 2 2 3 3 CK 4 4 5 5 6 6 CK”
图4 夹竹桃强心总甙处理 24h时钉螺酯酶同功酶图谱
Fig．4 EST i80zyme profiles after treated in Z4h
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2．4 钉螺软体组织重量测试结果及分析
钉螺经夹竹桃强心总甙处理后的软体组织的平均干重、湿重及干湿比如表2所示。由表2可知，所选用的
钉螺软体组织重量基本一致，经处理后钉螺软体的含水量也未见明显变化。其干重约为湿重的l／5到 1／4之间。
裹2 夹竹桃强心总甙处理后钉螺的软体组织重量
2．5 糖原测试结果及分析
钉螺经夹竹桃强心总甙处理后糖原含量的变化如表 3所示。由表 3可知，经夹竹桃强心总甙处理 2d后，
钉螺软体的糖原含量有显著下降，减少幅度从 9．9％到32．6％，减少幅度从大到小依次与夹竹桃强心总甙处
理液浓度呈正相关，表现出与灭螺活性基本一致的规律。
裹 3 夹竹桃强心总甙处理后钉螺的软体组织糖原含量
Table 3 Glycogen Content of soft tissues of mails after treated by the cardiac glycosides of N．indicum Mill
— — — 垄亘壅尘皇望塑!竺 翌!!丝2 墼： !：! ：! !： ：! ： 二
2．6 蛋白质测试结果及分析
钉螺经夹竹桃强心总甙处理后蛋白质含量的变化如表 4所示。由表 4可知，经夹竹桃强心总甙处理 2d
后 ，钉螺软体的蛋白质含量均有下降，减少幅度从 14．9％到 22．0％，夹竹桃强心总甙的灭螺活性与作用后蛋
白质的减少似乎没有关系。
衰4 夹竹桃强心总甙处理后钉螺软体组织蛋白质含量
Table 4 Total pro~in content of softtisues of snails aftertreated bythe cardiacglycosides ofN．indicum Mil
— — 导 l_———————— — ! ! 堕望
望 竖型 一一 丝： ! ：! ：! !： 丝： !：! =
3 讨论
3．1 由于化学灭螺剂污染环境，研究和利用生物源灭螺剂成为当前国内外的热点⋯]，而其中利用植物的化
学成份灭螺是目前国内外灭螺研究的前沿，有机合成新的仿生灭螺剂是最时新的研究 ]。我们项目组对孳
生钉螺的长江中下游水域江滩、湖洲及沟渠两旁生长的近 100种水生与湿生植物，采取随机选取样地的方法，
开展了它们对钉螺分布影响的调查研究，发现其中夹竹桃等近 20种植物与钉螺的相关性系数 2 >6
．635，能
明显抑制钉螺的繁衍n 。实验室研究进一步证实了夹竹桃具有很强的灭螺活性
，20mg儿 的夹竹桃强心总甙
的水溶液约与 1mg／L氯硝柳胺溶液的灭螺效果相当；不过夹竹桃强心总甙的毒效较氯硝柳胺略慢，用 lmg／L
氯硝柳胺溶液处理钉螺2～3d可达 too％~ ，而用 20mg／L的夹竹桃强心总甙水溶液处理需要 3～4d才能达
到同样的效果，但夹竹桃强心总甙属于生物源类药物，对人类的生存及生态环境较化学灭螺剂氯硝柳胺等要
安全得多。
3-2 酯酶(EsT)是动物体内一种重要的解毒酶系统，且是钉螺对外界刺激反应最强烈的同工酶之一 ·l4_。
得到的 EST电泳图谱所反映的明显变化揭示 EST具有特定的病理生化意义，可以作为钉螺中毒的指标
。 从
三张酶谱中可见样品总的EST的变化规律为中毒早期经处理样品的酶活高于对照组，表现为酶带颜色加深
，
但图中的第 1号样品酶带浅于对照组，这可能是因为在此之前的某一时刻就已经达到酶活高峰
，制样的时候
已处于酶活下降的阶段。而在中毒中期和后期经处理样品的酶活低于对照组，直至酶带完全消失。这与正常
的病理反应完全一致。在中毒早期，药物刺激 EST的表达，增强钉螺肝脏的解毒能力；在中毒中后期
，由于药
物作用时问或强度超过钉螺生理阈限，其体内物质和能量代谢出现紊乱，从而抑制酶的合成；在接近死亡的机
体中，酯酶的合成几乎停I卜
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3．3 夹竹桃强心总甙能够显著地降低钉螺体内的糖原含量。可能是：(1)夹竹桃强心总甙影响钉螺的肝功能
使局部肝细胞坏死，可直接影响糖原合成；(2)夹竹桃强心总甙对酶的作用，能够激活或钝化某些酶，促进糖原
分解和抑制糖原合成，导致糖原含量下降；(3)提取物能够影响消化道功能，引起摄食量减少，细胞摄取葡萄糖
减少，糖原合成下降。夹竹桃强心总甙能够在一定程度上降低钉螺体内的蛋白质含量，但减少量不及糖原的
减少量那样显著。
3．4 对植物提取物灭螺活性的研究是目前国际上灭螺研究的热点，目前所做的工作也是偏重于这一方面。
但灭螺研究的发展趋势是生态灭螺 川¨ ，这使得仅有实验室的工作是远远不够的，尤其是对分布于我国、13
本、菲律宾的两栖习性的湖北钉螺 ¨”]，还需要更多地开展野外调查及人工灭螺植物群落中钉螺消长规律的
研究，如江滩生态环境的改建，人工林各层次植物种类的选择，各植物的搭配比例，栽培密度，人工辅助能量的
供给等；植物对生活在其周围的钉螺等生物的化感作用机理 坞 ，这些都是今后工作的重点。只有综合两方
面的工作，生态灭螺才能真正实施并造福于人类。
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