全 文 ：第 26 卷第 6期
2006 年 6月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 26, No. 6
Jun. , 2006
镉长期暴露对黑斑蛙的氧化胁迫和抗氧化能力的影响
汪美贞, 贾秀英* , 董爱华, 何 鑫, 褚绞娇
(杭州师范学院生命科学学院,浙江杭州 310036)
基金项目:浙江省自然科学基金资助项目( 302056) ;浙江省动物学重点学科资助项目
收稿日期: 2005-04-28;修订日期: 2006-01-19
作者简介:汪美贞( 1982~ ) ,女,浙江金华人,硕士生,主要从事生态毒理学研究. E-mail: XY- Jia@163. com
* 通讯作者 Corresponding author.E-mail: XY- Jia@163. com
Foundation item: The project was supported by Natural Science Foundat ion of Zhejiang Province( No. 302056) ; By Grant From the Local Governments of Zhejiang
Province for the Specially Supported Discipline of Zoology
Received date: 2005-04-28; Accepted date: 2006-01-19
Biography: WANG Mei_Zhen,Master graduate student, mainly engaged in ecological toxicology.
摘要:在实验条件下, 将黑斑蛙暴露于 1215 mgPL 和 2510 mgPL 浓度的镉溶液中 30d, 分别测定了黑斑蛙在暴露 10、20 和 30d 时
肝、肾组织中镉( Cd )含量、过氧化产物丙二醛( MDA)的含量、还原型谷胱甘肽( GSH)含量和超氧化物歧化酶( SOD)活性,以探讨
镉对机体的脂质过氧化作用及机体的抗氧化损伤机制。实验结果表明, 不同剂量组黑斑蛙肝、肾镉含量、MDA 含量均随着镉暴
露时间的延长而升高,且肝 MDA含量与镉在肝中的蓄积量呈显著正相关( R2= 018643, n= 9)。肝脏 GSH 含量随镉暴露时间的
延长而被显著诱导,且与 MDA含量呈显著正相关( R2= 01 5933, n= 9) ; 肾 GSH 含量则随暴露时间的延长而显著下降, 与 MDA
含量呈显著负相关( R2= 018609, n= 9)。不同剂量组肝 SOD活性随镉暴露时间的延长而升高,肾 SOD活性在高剂量组随镉暴
露时间的延长表现为先升高后回落下降的趋势。可见, 在镉的长期暴露下, 细胞膜过氧化增强是镉伤害机体的主要原因, 而
GSH 含量、SOD活性的升高则可能是机体抗过氧化的机理之一。
关键词:镉; 氧化胁迫; 抗氧化能力; 黑斑蛙
文章编号: 1000-0933(2006) 06-1718-07 中图分类号: Q494, X171. 5 文献标识码: A
Effects of Cadmium on oxidative stress and antioxidative ability in the Frog Rana
nigromaculata under a long-term exposure
WANGMe-i Zhen, JIA Xiu-Ying
*
, DONG A-i Hua, HE Xin, CHU Jiao_Jiao ( School of Lif e Sciences, Hangzhou Normal College ,
Hangzhou 310036, China) . Acta Ecologica Sinica, 2006, 26( 6) : 1718~ 1724.
Abstract: Amphibian populations appear to be declining around the world. Although there is no single cause, one factor may be
pollution from heavy metals. Heavy metals such as cadmium ( Cd) have been one of the most fundamental causes of soil and water
pollution in industrial and developing countries. The liver and kidneys are the main target organs for toxic effects of Cd. We used
the frog Rana nigromaculata as a test subject to evaluate the effect of Cd on oxidative stress and antioxidative ability under a long-
term exposure. Female frogs were exposed to 1215 and 2510 mgPL of cadmium dissolved in water for 30 days in experiment
condition. The concentration of cadmium, levels of malondialdehyde (MDA) , the contents of glutathione ( GSH) and the activities
of superoxide dismutase( SOD) in the liver and kidneys were determined at the end of the 10
th
, 20
th
and 30
th
days of Cd exposure
respectively. The results showed that the cadmium accumulation and the MDA contents in the liver and kidneys were increased
rapidly with the prolonged time at the dosage of 1215 and 2510 mgPL Cd, and Cd accumulation was strongly positive correlated
with the MDA contents in the liver ( R
2
= 018643, n= 9) . GSH contents were induced significantly in the liver and were
decreased significantly in the kidneyswith increasing of exposure time, GSH contents were posit ively correlated with MDA contents
in the liver ( R2 = 015933, n= 9) , while GSH contents were negatively correlated with MDA contents in the kidneys ( R2 =
018609, n= 9) 1 SOD activities in liver were increased in the dosage of 1215 and 2510 mgPL Cd and SOD activities in the kidneys
were first raised and declined afterwards in the dosage of 2510 mgPL Cd with increasing of exposure time. These results suggest that
the enhancement of peroxidation of membrane lipid may be one of the cadmium injury mechanisms in R. nigromaculata.
Furthermore, the increasing of GSH content and SOD activity would be part of general defense strategies to cope with oxidative
stress.
Key words: cadmium; oxidative stress; antioxidative ability; Rana nigromaculata
全球范围内生物多样性的逐渐丧失已经引起人类的日益关注。两栖类动物是生态群落的重要组成部分,
因此,它们的消亡和灭绝对生物多样性会产生很大的威胁。近些年来,随着环境污染的日益加重, 两栖动物种
类在世界各地正在急剧地衰减或消失[ 1~ 3] 。研究者对许多常见的两栖类物种不明原因地衰减或消失进行了
多次论证, 认为两栖动物由于其皮肤的高渗透性、水陆两栖等生物学特性,对环境污染极其敏感,两栖动物种
群的变化与环境污染物有密切的关系[ 4, 5] ,而关于环境污染物对两栖动物的作用机理仍然不太清楚, 对两栖动
物生理和生化方面的影响很值得深入研究。
重金属是当前环境污染最重要的因素之一。由于工业的发展,环境中重金属的含量越来越高,其毒性已
引起人们的普遍重视 [ 6] 。数十年来,国内外学者已就铅、镉等重金属对水生动物、哺乳动物的机体结构及生理
生化等方面的影响作了较多的研究 [ 7- 10] ,研究表明,活性氧的大幅度增加是造成机体细胞伤害的主要原因之
一,而生物体内具有清除活性氧作用的抗氧化防御系统成分的改变可以作为机体遭受氧化胁迫的指示[ 11~ 13] ,
因而尝试以这些抗氧化防御系统成分的变化作为污染物胁迫的生物标志物的研究正成为生态毒理学领域中
新的热点[ 14]。
近年来,国内外关于重金属污染对两栖类影响的研究报道[ 15~ 18]已有不少,而关于重金属对两栖类动物抗
氧化防御系统影响的研究则鲜见报道。研究表明,短期内很难观察到低浓度污染物对生物的危害,往往需要
长期暴露后方能显示[ 19]。因此, 污染物长期暴露的生态效应值得关注。本实验以广泛分布的两栖类动物
) ) ) 黑斑蛙成体为实验材料, 通过对长期暴露在重金属镉溶液下黑斑蛙肝、肾组织中镉( Cd)、谷胱甘肽
(GSH)、超氧化物歧化酶( SOD)及丙二醛( MDA)等几个指标的测定, 探讨镉暴露对黑斑蛙肝、肾的脂质过氧化
作用及抗氧化损伤机制, 为保护两栖类动物资源和充实分子毒理生态学内容提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1. 1 实验动物及处理
健康成年黑斑蛙( Rana nigromaculata)捕自杭州市郊, 平均体长为( 7415 ? 413) mm, 平均体重为( 3616 ?
918) g。在室内盛有 2~ 3 cm去离子蒸馏水的玻璃水族缸(实验前用10%的稀硝酸浸泡)中暂养 7d后,随机均
分为对照组和染毒组,每组30只(全为雌性)。暴露实验在玻璃缸( 60 @ 40 @ 35 cm3 )中进行。根据急性毒性实
验测定的LC50浓度, 染毒组黑斑蛙分别暴露于 3 cm 深的 1215 mgPL 和 2510 mgPL 的镉溶液中(按镉计, 用
CdCl2#215H2O配制) ,对照组黑斑蛙暴露于 3 cm深的清洁水溶液中。每一处理各设一平行组。暴露实验共进
行30d, 采用静态置换法每天更新溶液 50%, 每天投喂1次。驯养期间及实验过程中黑斑蛙没有出现死亡情况。
1. 2 实验设计和样品处理
对照组和染毒组于暴露后第 10、20、30天分别取样。每次每组取蛙 8只, 活体解剖,取出肝脏和肾脏,迅
速置于液氮中。测定时, 从液氮中取出肝脏和肾脏, 清洗, 称重, 4 e 下按 1 g 组织样品加 10 ml生理盐水的
比例, 用玻璃匀浆器在冰浴中匀浆, 并于 4 e , 12000 rPmin离心20 min,将上清液保存于- 20 e 冰箱中待测。
1. 3 测定指标及方法
镉含量的测定采用原子吸收分光光度法; 谷胱甘肽( GSH)含量的测定采用二硫代二硝基苯甲酸比色法;
丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸比色法; 超氧化物歧化酶( SOD)活性的测定采用黄嘌 氧化法;
蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法。试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。
1. 4 数据处理
17196期 汪美贞 等:镉长期暴露对黑斑蛙的氧化胁迫和抗氧化能力的影响
图 1 镉在黑斑蛙肝脏中的积累
Fig. 1 Cd accumulation in livers of Rana nigromaculata
* 表示与对照组差异显著( p< 0105) , * * 表示与对照组差异极显著
( p < 0101) ; + 表示与低剂量组差异显著( p < 0105) ; €x ? s , n= 8, 其
余图相同 * p < 0105, * * p < 0101, Compared to control group; + p
< 0105,Compared to low concentrat ion group; Values are expressed as mean
? SD of 8 observations; The same below
每组实验数据用平均数 ? 标准误差表示;处理与对
照间的差异比较用单因素方差分析法, 处理间的差异
比较采用新复极差法( SSR) , 当 p< 0105时, 认为有显
著差异。用回归方法分析指标之间的相关性, 以相关
系数表示相关的密切程度。
2 结果与分析
211 镉在黑斑蛙肝脏和肾脏组织中的分布情况
镉在各组黑斑蛙肝脏和肾脏中的分布情况见图 1
和图 2。镉处理组黑斑蛙肝、肾组织中的镉含量均显著
高于对照组( p < 0101) ,表明通过皮肤渗透黑斑蛙肝脏、
肾脏均能蓄积大量的镉, 且均随着染毒剂量的增大和暴
露时间的延长而升高, 其中肾脏中镉积累的绝对值较
高,积累量在 12119~ 17156mgPkg 之间; 而肝脏中镉的
积累量随暴露时间的延长而升高的幅度较大,与对照相
比,各处理组在不同暴露时间下镉的积累幅度达 10177
图 2 镉在黑斑蛙肾脏中的积累
Fig. 2 Cd accumulation in kidneys of Rana nigromaculata
~ 24113倍。
212 镉对黑斑蛙肝脏和肾脏 GSH 含量的影响
由图 3可见, 在1215mgPL 和 2510 mgPL 镉暴露30d
内, 镉对黑斑蛙肝脏 GSH 含量有显著诱导作用。其中
在1215 mgPL 镉处理组, 污染暴露 10d、20d, 肝脏 GSH
含量与对照组比较无显著性差异( p> 0105) , 而在污染
暴露 30d, GSH 含量则显著高于对照组( p < 0105) 1 在
2510mgPL 镉处理组, 污染暴露第 10d、20d, 肝脏 GSH
含量均显著高于对照组和 1215 mgPL 镉处理组 ( p <
0105) , 污染暴露 30d, GSH 含量没有继续升高, 但仍显
著高于对照组( p< 0105)。表明在该镉试验浓度下, 随着镉剂量的增加和暴污时间的延长,黑斑蛙肝脏 GSH
含量被显著诱导,且这种诱导作用持续到实验结束( 30d)。
图 3 镉对黑斑肝脏中 GSH 含量的影响
Fig. 3 Effect of Cd on GSH content in livers of Rana nigromaculata
图 4 镉对黑斑蛙肾脏中GSH 含量的影响
Fig. 4 Effect of Cd on GSH content in kidneys of Rana nigromaculata
由图 4可以看出, 各镉处理组肾脏 GSH 含量均随着暴污时间的延长而下降。在1215mgPL 镉处理组,污染
暴露 20d, 肾脏 GSH 含量显著低于对照组( p< 0105) , 污染暴露 30d, GSH 含量极显著低于对照组( p< 0101)。
在2510 mgPL 镉处理组, 污染暴露 10d、20d, 肾脏 GSH含量均显著低于对照组( p< 0105) ,污染暴露 30d, GSH
含量显著或极显著低于 1215 mgPL 镉处理组( p< 0105)和对照组( p < 0101)。提示镉对黑斑蛙肝脏和肾脏GSH
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代谢的影响有不同的机制。
213 镉对黑斑蛙肝脏和肾脏MDA含量的影响
由图 5, 图 6 可见, 各镉处理组黑斑蛙肝、肾 MDA 含量均随着暴污时间的延长而升高。其中在镉暴露
10d, 肝、肾组织MDA含量与对照比较均无明显差异( p> 0105) ; 污染暴露 20d,肝、肾脏MDA含量均显著高于
对照组( p< 0105) ;污染暴露 30d, 1215 mgPL 镉处理组中肝、肾MDA 含量显著高于对照组( p < 0105) , 而 2510
mgPL 镉处理组中肝、肾MDA含量则极显著高于对照组( p< 0101)和显著高于 1215 mgPL 镉处理组( p< 0105)。
由此可见,镉的长期暴露对黑斑蛙肝、肾均可引起脂质过氧化损伤。
图 5 镉对黑斑蛙肝脏中MDA 含量的影响
Fig. 5 Effect of Cd onMDA content in l ivers of Rana nigromaculata
图 6 镉对黑斑蛙肾脏中MDA含量的影响
Fig. 6 Effect of Cd on MDA content in livers of Rana nigromaculata
214 镉对黑斑蛙肝脏和肾脏 SOD活性的影响
如图 5所示, 在1215 mgPL 和2510 mgPL Cd暴露下,黑斑蛙肝脏内SOD活性均随着暴露时间的延长而不断
升高, 其中,在 1215 mgPL Cd处理组, 污染暴露 10d、20d, 肝 SOD活性与对照组比较均无明显差异( p > 0105) ,
污染暴露 30d,肝 SOD活性显著高于对照( p< 0105) ; 在 2510 mgPL Cd处理组, 污染暴露 20d,肝 SOD活性显著
高于对照组( p < 0105) ,污染暴露 30d, 肝SOD活性继续升高,与对照组比较差异极显著( p< 0101)。说明在本
实验条件下, Cd对黑斑蛙肝脏 SOD活性表现为显著的诱导作用。
从图 6可见, 在1215 mgPL Cd处理组,肾 SOD活性随着暴露时间的延长呈升高趋势,但在暴污10d、20d,肾
SOD活性与对照组比较无明显差异( p > 0105) ,而在暴污 30d, 肾 SOD活性则显著高于对照组( p < 0105) ;在
2510 mgPL Cd处理组,污染暴露 10d, 对肾 SOD活性影响不大, 污染暴露 20d, 肾 SOD活性显著高于对照组和
1215 mgPL Cd处理组( p < 0105) ,污染暴露 30d,肾 SOD活性又开始下降回落至对照组水平。说明在较高 Cd浓
度暴露下,黑斑蛙肾 SOD活性随时间延长则表现为先升高后回落下降的趋势。
图 7 镉对黑斑蛙肝脏中 SOD 酶活性的影响
Fig. 7 Effect of Cd on SOD act ivity in l ivers of Rana nigromaculata
图 8 镉对黑斑蛙肾脏中 SOD酶活性的影响
Fig. 8 Effect of Cd on SOD activity in kidneys of Rana nigromaculata
215 肝、肾组织中MDA与镉、GSH含量的相关关系
将肝脏和肾脏组织中的镉含量与相应的 MDA含量作相关分析, 肝脏镉蓄积量与 MDA含量呈显著正相
17216期 汪美贞 等:镉长期暴露对黑斑蛙的氧化胁迫和抗氧化能力的影响
关, R2= 018643(图 9) ,肾脏镉蓄积量与 MDA含量相关关系不明显。
将肝脏和肾脏组织中的 MDA 和相应的 GSH 含量作相关分析, 肝脏 MDA 与 GSH 呈显著正相关, R 2=
015933(图 10) ,而肾脏MDA与 GSH则呈显著负相关, R 2= 018609(图11)。这种差异性,可能与肝、肾对镉不同
的反应机制有关。
图 9 肝脏中镉积累量与MDA 的相关性
Fig. 9 Correlation between Cd and MDA concentrat ion in the liver of Rana
nigromaculata
图 10 肝脏中MDA与 GSH 的相关性
Fig. 10 Correlation between MDA and GSH concentration in the liver of
Rana nigromaculata
图 11 肾脏 MDA 与GSH的相关性
Fig. 11 Correlat ion between MDA and GSH concent rat ion in the kidney of
Rana nigromaculata
3 讨论
目前研究认为, 镉在动物体内的蓄积有较强的选择
性,肝和肾是主要的蓄积器官 [20]。本研究结果表明, 在
1215 mgPL和 2510 mgPL镉溶液中暴露30d,黑斑蛙肝脏、
肾脏均能蓄积大量的镉, 且均随着染毒剂量的增大和暴
露时间的延长而升高 1其中,随着暴露时间的延长, 镉
在肝脏中的蓄积率比肾脏高, 但在肾脏中蓄积的镉绝对
量要比在肝脏中蓄积的镉绝对量大,说明黑斑蛙经皮肤
渗透在镉溶液中暴露 30d内, 镉在肾脏中蓄积的能力要
高于肝脏, 这与 Hogstrand and Haux[ 21]、Suzuki and Kawa-
mura
[ 22] 、Torra等[ 23] 的研究基本一致。至于蓄积在肾脏
中的较高镉绝对量, 一方面可能与镉诱导肝脏合成的金
属硫蛋白复合物( CdMT)在肾内降解释放出镉离子有
关,也可能还与MT 以外的其它方式和机制有关。
MDA是一种高活性的脂质过氧化产物,能交联脂类、核酸、糖类及蛋白质,破坏膜的结构, 导致细胞质膜
受损伤, 因此, MDA 含量是反映脂质过氧化作用强弱的一个重要指标。Papadimitriou and Loumbourdis研究表
明[ 24] , 湖蛙( Rana ridibunda)在 100 mgPLCu溶液中暴露 30d, 肝MDA 含量显著增加,是暴露 5d、15d时的 115
倍和2倍。贾秀英等 [ 25]采用腹腔注射法对蟾蜍( Buf o bufo gargarizans)给铅,研究了不同浓度( 1~ 8mgPkg 体重)
铅胁迫下蟾蜍肝、肾组织丙二醛(MDA)含量的变化,结果表明蟾蜍肝、肾组织MDA 含量随着铅染毒浓度的增
加而增加。本实验结果也表明,在重金属镉暴露下,黑斑蛙肝、肾组织MDA含量均随着镉暴露浓度的升高、暴
露时间的延长而增加,表明镉的长期暴露对黑斑蛙肝、肾均可引起脂质过氧化损伤。可见过多的自由基积累
引起的膜脂过氧化, 在重金属毒害两栖类动物的过程中充当了重要角色。
GSH 作为生物体内重要的抗氧化剂,既可由于污染的暴露而产生适应性诱导反应,也可由于污染的毒性
作用而产生中毒反应 [ 26]。一般认为, GSH 含量的增加可能代表了机体对污染物暴露的适应性反应[ 27] ,而 GSH
含量的降低则可能与细胞对污染物及其代谢物解毒能力的饱和作用有关, 也可能是污染物暴露的毒性效应的
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反应 [28]。本实验结果显示,黑斑蛙在1215 mgPL 和 2510 mgPL Cd处理组经皮染镉 30d,肝GSH 均随着污染暴露
时间的延长而被显著诱导,这与Papadimitriou and Loumbourdis [24]、Vogiatzis and Loumbourdis [29]的研究结果基本一
致。肾脏 GSH含量则刚好相反,均随着污染暴露时间的延长而下降。说明在本实验设定的浓度和暴露时间
下,黑斑蛙肝脏对镉暴露总体上表现为适应性反应,而肾脏则表现出明显的肾毒性效应。值得注意的是, 暴露
20d, 2510 mgPL 浓度组与 1215 mgPL浓度组肝 GSH 含量比较增加显著( p< 0105) ,而暴露 30d,二者则相当接近
( p> 0105) , 这可能表明随着暴污时间的延长和镉浓度的升高,细胞对镉及其代谢物的解毒能力已达饱和。至
于肝、肾产生的上述差异性,可能是由于其合成GSH 能力不同,镉诱导的 GSH 代谢不同。在肝脏, 较低镉剂量
范围内,随着肝内镉蓄积量的增加,镉诱导肝脏GSH 合成增加,随着暴露时间的延长,肝内镉蓄积量的逐渐升
高,可能由于镉对肝细胞产生的毒性增强,影响到 GSH的合成,从而导致肝 GSH 含量的逐步下降。在肾脏,由
于本身GSH 合成能力很弱,主要靠肝合成 GSH供给, 因而随着镉浓度的增加和染镉时间的延长,肾 GSH 消耗
量也增加。
另外,本实验一个重要的发现, 肝中MDA含量与镉的蓄积量呈显著正相关; 肝脏 GSH 含量与MDA含量
呈显著正相关, 而肾脏GSH 含量与MDA含量呈显著负相关。这种相关性形成的机制目前尚未知, 有待于进
一步研究, 但根据大量有关肾细胞氧化损伤的研究表明,细胞内 GSH 含量是细胞损害的一个重要影响因素,
增加细胞内GSH 含量可保护肾细胞免于受损, 而降低细胞内 GSH 含量可增强肾细胞毒性。由此说明镉可导
致黑斑蛙较强的肾毒性, 肾脏是主要的中毒器官。
SOD是体内重要的保护性酶,对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用,它能清除超氧阴离子自
由基,保护细胞免受损伤。本研究表明,在 1215 mgPL Cd处理后,肝、肾 SOD活性随着暴露时间的延长而升高,
尤其在暴露30d, 肝、肾 SOD活性均被显著诱导;但在2510 mgPL Cd处理组,肝SOD活性暴露 30d被显著诱导,
而肾 SOD活性在暴露20d被显著诱导,暴露 30d则开始回落甚至被抑制。说明黑斑蛙在镉的污染暴露下,机
体会产生适应性诱导反应, SOD活性升高以清除自由基伤害; 但如果胁迫时间过长或胁迫程度过大, 超过机体
所能忍受的极限,使机体出现中毒反应,致使 SOD活性降低。黑斑蛙肝、肾组织 SOD活性变化的差异性, 说明
肝、肾组织从污染的适应性反应到中毒性反应存在着不同的阈值,这可能与肝是脊椎动物体内最主要的解毒
器官以及肾脏对镉具有最大的蓄积量有关。
总体而言, 黑斑蛙在较低浓度镉的长期暴露下,肝、肾组织脂质过氧化产物MDA含量显著升高, 导致机体
发生氧化损伤。同时, GSH、SOD作为机体重要的抗氧化物质,随着暴露时间的延长或暴露强度的增加, 表现
出一定程度的诱导反应, 说明机体在镉暴露环境中,能借助自身的抗氧化能力, 力图维持活性氧代谢平衡,保
护膜结构, 从而使动物体在一定程度上减缓或抵抗逆境的影响。但这种维持作用是有一定限度的, 随着胁迫
时间的延长和胁迫强度的增加, GSH、SOD可能因为中毒而受到抑制,由此造成活性氧的积累和对细胞膜的损
伤,降低生物的适应性反应能力。由此可见, MDA、GSH 含量以及抗氧化酶 SOD活性的变化在一定程度上反
映了镉对黑斑蛙的损伤作用。
值得注意的是, 从MDA、GSH 和 SOD在不同剂量和不同暴露时间作用下所产生的结果看, MDA和 GSH的
变化相对于SOD来说要稳定,而且本实验还表明,肝、肾MDA和 GSH 均具有较显著的相关性,因此,在评价镉
对黑斑蛙的亚慢性毒性作用时,可优先选择肝、肾组织的MDA和 GSH 水平作为镉早期污染胁迫程度的生物
效应指标。
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